Name: Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a extrair, visualizar e quantificar hemócitos de lagartas selvagens usando anestesia em gelo, injeção de tampão anticoagulante e incisão cuidadosa. Este método permite estudar respostas imunes celulares em insetos.

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TMS foi apoiado pela confiança Harlan Fellowship (UGT) durante este estudo. O financiamento para a coleta de campo e criando L. fasciola e E. delphinii foi fornecido pela concessão do NSF DEB 0642438 para JTL.

1. Preparação de material <ol><li> Prepare agulhas (1-2 ponta fim e cone 3-4 mm) de tubos de vidro de borosilicato capilares e um extrator micropipeta. Configurações do instrumento: rampa: 561, velocidade: 20; calor: 560; atraso: 1; tração: 100; pressão: 500. </li><li> Preparar a solução de recolha: 60% de meio de Grace (GM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 20% de Tampão de anticoagulante (98 mM NaOH, 186 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA e 41 mM de ácido cítrico, pH 4,5 ). A solução acima é preparada em condições estéreis e mantido em gelo em todos os momentos. </li><li> Preparar a solução de tampão de incubação: 90% do GM suplementado com 10% de FBS. Esta solução também é preparada e mantida em gelo em todos os momentos. </li><li> Preparar um total de, pelo menos, 15 ul × o número de insectos para a recolha e as soluções de incubação. </li></ol> 2. Injeção de Lagartas com solução de coleta <ol><li> Anestesiar ins penúltimaslarvas de alcatrão por arrefecimento com gelo durante 20 minutos antes da extracção hemocitária. </li><li> Coloque a extremidade romba de uma agulha limpa capilar (calibre 16) para dentro do tubo que está ligado a uma seringa de vidro de 20 ml (Figura 2). Deixar o tubo que contém a solução de recolha de abrir na bancada do laboratório e lentamente encher o capilar pelo tampão. O capilar é normalmente preenchido com aproximadamente 10-15 uL de solução de recolha, dependendo do tamanho da lagarta (cerca de 1 ul de solução por 10 mg de lagarta massa corporal total = 0,01% da massa corporal total). Descanse a agulha em uma bola de argila que é colocado ao lado do microscópio de dissecação. </li><li> Coloque a lagarta em uma placa de Petri. O insecto deve ser posicionada para o lado, de modo que os espiráculos são claramente visíveis (Figura 3). </li><li> Durante a visualização sob um microscópio de dissecação, manter a lagarta no local com um par de pinças e colocar a agulha perto de um dos espiráculos, em que o emcutícula seita é geralmente mais macia. Pressione suavemente a agulha capilar contra o corpo do inseto. Uma vez que a agulha penetrou a cutícula, injectar o volume total da solução para a lagarta (Figura 3). É importante evitar a injecção de bolhas de ar dentro da lagarta. Do corpo da lagarta vai inchar (por exemplo, aumento do volume em 20%) após a injeção, mas não deve estourar ou vaza. </li><li> Retorne a lagarta para o gelo, colocando o inseto dorsalmente para evitar tampão de vazar para fora da ferida (Figura 3). </li><li> Repita os passos de 2,1-2,4 para cada lagarta usada para extração de hemolinfa. Nesta fase, permitir que todos os insectos para arrefecer em gelo durante 30 min antes de prosseguir. </li></ol> 3. Extração de Hemócitos <ol><li> Coloque a lagarta em uma placa de Petri com o microscópio de dissecação. </li><li> Faça uma incisão (2-3 mm de comprimento) rasa na região posterior da lagarta utilizando um scalpe estéril<html> l (Figura 3). Tome cuidado para não danificar o intestino ou outros órgãos internos, o objetivo é perfurar a cutícula cuidadosamente e recolher o mix de buffer / hemolinfa contendo hemócitos de insetos individuais. </li><li> Aperte a lagarta delicadamente usando uma pinça de plástico flexíveis ao coletar a mistura hemolinfa (aproximadamente 10-20 ul) com uma ponta de pipeta 10 jul, novamente tomando cuidado para não ferir os tecidos internos (Figura 3). Hemolinfa é coletado da minúscula gotinha do corpo da lagarta. Descartar restos da lagarta. </li><li> Colete hemolinfa de cada indivíduo em separado lagarta rotulados siliconizado 0,5 microtubos ml. </li><li> Adicionar um volume igual de solução de incubação (cerca de 10-20 ul) de cada uma das amostras recolhidas a partir da hemolinfa de uma lagarta individual. Manter as amostras de hemolinfa sobre gelo em todos os momentos. </li><li> Repita os passos de 3,1-3,5 para cada lagarta utilizados no experimento. </li></ol>le &quot;Quantificação&gt; 4. dos hemócitos <ol><li> Misturar a amostra e hemolinfa a solução imediatamente antes da incubação hemócitos contagem. Este tratamento permite uma adequada separação de hemócitos e impede aglomeração. </li><li> Usar uma pipeta para transferir limpo 10 ul de amostra de hemolinfa misturado com a solução de incubação para um hemocitómetro. </li><li> Usando um microscópio composto, contar e registar o número de hemócitos em pelo menos 15 dos grandes quadrados (área de um quadrado de 0,04 mm 2, a profundidade: 0,1 mm) da grelha central do hemocitómetro (Figura 3). Adicionar esses valores para obter uma soma total do número de hemócitos nos 15 quadrados. </li><li> Lave o hemocitômetro e seu slide cobertura, cuidadosamente, com um frasco de lavagem com água destilada e deionizada e seque com Kimwipes (Kimberly-Clark) entre cada amostra. </li><li> Repita os passos de 4,1-4,4 para cada amostra de hemolinfa. </li><li> Calcula-se a média do número de hemócitos por ml de hemolinfa volume para cada uma lagarta, como se segue: </li></ol> O volume total de cada quadrado da grelha de hemocitómetro: (0,04 mm 2 de área) x (0,1 mm de profundidade) = 0,004 mm 3 × 15 quadrados = 0,06 mm 3 = o volume total de todos os 15 quadrados contados. (Soma de o número total de hemócitos em 15 quadrados contados / volume do total de todos os 15 quadrados contados) x factor de diluição 2 = o número de hemócitos / mm 3 x 1,000 = o número de hemócitos / ml de hemolinfa.

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<li>Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+larval+and+pupal+hemocytes+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%2C+determined+by+monoclonal+antibodies+and+density+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation.</a> J. Insect Physiol. 50 (9), 805(2004).</li>
<li>Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+hemocyte+counts+with+different+developmental+parameters+during+the+last+larval+instar+of+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63(2008).</li>
<li>Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+tri-trophic+interaction+between+insects%2C+nematodes+and+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus.</a> Parasitology. 137 (11), 1695(2010).</li>
<li>Qayum, A. A., Telang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+Collecting+and+Staining+Hemocytes+from+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti.</a> J. Vis. Exp. (51), e2772(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Métodos para a extração de hemócitos de insetos de importância médica e insetos lepidópteros modelo foram relatados 9, 14. Métodos de extração de hemócitos são adaptados de acordo com as espécies de insetos, o estágio de desenvolvimento do inseto e suas características morfológicas. Por exemplo, o isolamento a partir da hemolinfa de larvas Manduca pode ser prontamente realizada cortando o chifre curvo perto do fim do abdómen 15. Porque lagartas Slug (Limacodidae) não possuem essa estrutura...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de vidro de borossilicato </td><td> Sutter Instruments </td><td> B100-50-10 </td><td> OD: 1.0, ID: 0,50 milímetros </td></tr><tr><td> Meio de Grace </td><td> Sigma </td><td> G8142 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3007102 </td><td> Inactivado por calor </td></tr><tr><td> Dumont n º 5 Fórceps </td><td> Belas ferramentas da ciência </td><td> 11252-40 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de Neubauer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 3200 </td><td></td></tr><tr><td> Plástico tubing </td><td> Tri-Tech </td><td> TT-3-32OD </td><td> OD: 3/32&#39;&#39;, ID: 1/32 &#39; </td></tr><tr><td> Médicas de vidro seringa </td><td> Fortuna Optima </td><td> D-97877 </td><td> Volume de 50 ml </td></tr><tr><td> Agulha de ponta romba </td><td> Peças pequenas </td><td> NE-162PL-25 </td><td> Calibre 16 x 1 comprimento &quot; </td></tr></tbody></table>

um protocolo simples para extrair hemócitos de lagartas selvagens

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Hemócitos de insetos (equivalente a mamíferos células brancas do sangue) têm um papel importante em vários processos fisiológicos ao longo do ciclo de vida de um inseto 1. Em estágios larvais de insectos pertencentes à ordem dos lepidópteros (borboletas e traças) e Diptera (moscas verdadeiras), são formados a partir de hemócitos do gânglio linfático (um órgão especializado hematopoiética) ou células embrionárias e pode ser carregado até à fase adulta. Hemócitos embrionários estão envolvidos na migração de células durante o desenvolvimento e a quimiotaxia de regulação durante a inflamação. Eles também participam de apoptose das células e são essenciais para a embriogênese 2. Hemócitos mediar o braço celular da resposta imune inata de insectos, que inclui várias funções, tais como a agregação de células de células difusão, formação de nódulos, e a fagocitose de encapsulamento de invasores estranhos 3. Eles também são responsáveis ​​por orquestrar específicas de insectos defesas humorais durante a infecção, tais como a produção de péptidos antimicrobianos e outras moléculas efectoras 4, 5. Hemócitos morfologia e função têm sido principalmente estudados em modelos genéticos ou fisiológica de insectos, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, 7, os mosquitos Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e o hornworm tabaco, Manduca sexta 10, 11. No entanto, pouca informação existe atualmente sobre a diversidade, classificação, morfologia e função de hemócitos em espécies não-modelo de insetos, especialmente aqueles coletados de 12 a selvagem. Aqui nós descrevemos um protocolo simples e eficiente para extrair hemócitos de lagartas selvagens. Usamos penúltimo estádio Lithacodes fasciola (amarelo Traça lesma) (Figura 1) e Euclea delphinii (spiny lesma carvalho) lagartas (Lepidoptera: Limacodidae) e mostram que os volumes suficientes de hemolinfa (sangue do inseto)pode ser isolado e os números contados a partir de hemócitos larvas individual. Este método pode ser utilizado de forma eficiente para estudar tipos de hemócitos nestas espécies, bem como em outras lagartas relacionados colhidas a partir do campo, ou pode ser facilmente combinado com ensaios imunológicos concebidos para investigar a função hemocitária após infecção com micróbios ou parasitas 13.

O protocolo aqui descrito permite a recolha de um volume mínimo de 10-20 ul de hemolinfa de larvas de insectos individuais. Hemócitos recolhidas utilizando este método são livres de agregação de células, defeitos de melanização, restos de tecido ou outros contaminantes. Portanto hemócitos podem ser facilmente observados e contados sob o microscópio, e vários insectos pode ser observado no prazo de uma Hosur poucos. Observou-se que a maioria dos hemócitos em nossas amostras consistiu de 3 (plasmatócitos hemóci...

Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.

Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens

As hemócitos de insetos (equivalentes aos glóbulos brancos de mamíferos) desempenham um papel importante em diversos processos fisiológicos ao longo do ciclo de vida de um inseto...

O objetivo geral deste procedimento é extrair, visualizar e contar os hemócitos de lagartas silvestres. Isso é realizado primeiramente anestesiando a lagarta colocando-a sobre gelo, injetando nela uma solução tampão contendo um anticoagulante e devolvendo a lagarta ao gelo para permitir que os hemócitos retornem à circulação antes da extração. O segundo passo consiste em fazer uma incisão superficial na extremidade posterior da lagarta utilizando um bisturi limpo.Em seguida, a lagarta é suavemente comprimida usando pin&ccedil;as macias. Depois, a mistura de linfa hemoc&eacute;lica com a solu&ccedil;&atilde;o tamp&atilde;o &eacute; aspirada com uma micropipeta e coletada em um tubo de microcentrifuga&ccedil;&atilde;o. O passo final &eacute; misturar suavemente a solu&ccedil;&atilde;o de linfa hemoc&eacute;lica com um volume igual de solu&ccedil;&atilde;o tamp&atilde;o e transferir 10 microlitros da solu&ccedil;&atilde;o para um hemocit&ocirc;metro, a fim de visualizar e contar o n&uacute;mero de h&eacute;citose.Por fim, este método de extração de hemócitos pode ser utilizado como uma técnica rápida e eficaz para contar hemócitos de diversas espécies de lagartas e conservar como uma ferramenta para examinar aspectos fisiológicos da resposta imune celular dos insetos. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser

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Biologia

Este vídeo vai demonstrar como obter hemócitos (células sangüíneas) a partir do Hawaiian bobtail...

Obtenção Hemócitos do Hawaiian Bobtail Squid Euprymna scolopes Observando e sua adesão a bactérias simbióticas e não-simbióticas

A simplificada ainda método preciso para coletar e mancha hemócitos mosquito é descrito. Nosso método combina a simplicidade de perfusão com a precisão das técnicas de injecção de alta para isolar os preparativos limpa de hemócitos em mosquitos Aedes. Este método facilita os estudos que exigem conhecimento dos tipos de hemócitos e sua abundância.

Um Protocolo de Coleta e coloração Hemócitos do mosquito da febre amarela Aedes aegypti</em

Este vídeo descreve a glândula linfática da Drosophila - o local primário de hematopoiese na larva da mosca - e mostra um exemplo de protocolo para dissecar e montar o órgão para imuno-histoquímica e imagens fluorescentes.

Dissecção de glândulas linfáticas larvais: isolando o órgão produtor de hemócitos de Drosophila

A hemolinfa da Drosophila serve como sangue e fluido intersticial, circulando por todo o corpo durante os estágios larva e adulto. Este vídeo descreve um protocolo de coleta de hemolinfa larval para quantificar as células circulantes.

Ruptura da cutícula: um método para coletar hemolinfa de larvas de Drosophila

Este vídeo demonstra o ensaio de distúrbio de hemócitos, avaliando a readesão de hemócitos nas bolsas hematopoiéticas de larvas de Drosophila. O distúrbio mecânico libera hemócitos residentes, elevando a contagem de hemócitos circulantes. Após a recuperação, a readesão dos hemócitos residentes é confirmada, ilustrando a reversibilidade.

Um ensaio de distúrbio de hemócitos para avaliar a readesão de hemócitos a bolsas hematopoiéticas

As células sanguíneas de Drosophila, ou hemócitos, circulam entre os locais residentes e a circulação.  Na larva, os hemócitos residentes (sésseis) localizam-se em microambientes indutivos, as bolsas hematopoiéticas, enquanto os hemócitos circulantes se movem livremente na hemolinfa. O objetivo deste protocolo é o isolamento e quantificação padronizados dessas duas populações de hemócitos comportamentalmente distintas, mas intercambiáveis.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Sistemas hematopoiéticas de mamífero Drosophila e compartilham muitas características comuns, tornando Drosophila um modelo genético atraente para estudar hematopoiese. Aqui demonstramos dissecção e montagem do principal órgão hematopoiético larval para imuno-histoquímica. Descrevemos também métodos para ensaiar vários compartimentos hematopoiéticos larvais incluindo hemócitos circulantes e células de cristal sésseis.

Métodos para examinar a linfa Gland e Hemócitos em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Este método demonstra como visualizar a invasão do patógeno em células de inseto com modelos tridimensionais (3D). Hemócitos de larvas de Drosophila foram infectados com patógenos virais ou bacterianos, ou ex vivo ou no vivo. Hemócitos infectados foram, em seguida, fixa e manchados para a imagem latente com um microscópio confocal e subsequente reconstrução celular 3D.

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.

Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados

Aqui, apresentamos protocolos para 1) a propagação em cativeiro laboratorial da borboleta azul miami ameaçada pelo governo federal(Cyclargus thomasi bethunebakeri) e 2) avaliando informações básicas da história da vida, como tempo de desenvolvimento imaturo e número de estádios larvais. Ambos os métodos podem ser adaptados para uso com outros programas de conservação ex situ.

Programas de propagação em cativeiro de borboletas em risco para melhorar o conhecimento da história da vida e técnicas eficazes de conservação ex situ

Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.

Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

Aprenda a extrair, visualizar e quantificar hemócitos de lagartas selvagens usando anestesia em gelo, injeção de tampão anticoagulante e incisão cuidadosa. Este método permite estudar respostas imunes celulares em insetos.

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