Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens
15 de novembro de 2012
Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.
O objetivo geral deste procedimento é extrair, visualizar e contar os citos he de lagartas selvagens. Isso é feito primeiro anestesiando a lagarta, colocando-a no gelo, injetando-a com uma solução tampão contendo um anticoagulante e devolvendo a lagarta ao gelo para permitir que os citos reentrem na circulação antes da extração. O segundo passo é fazer uma incisão rasa na extremidade posterior da lagarta usando um bisturi limpo.
Em seguida, a lagarta é espremida suavemente com uma pinça macia. Em seguida, a mistura de hemolinfa da solução tampão é aspirada usando uma micropipeta e coletada em um tubo de microcentrífuga. A etapa final é misturar suavemente a solução de hemolinfa com um volume igual de solução tampão e transferir 10 microlitros da solução para um hemocitômetro para visualizar e contar o número de citos.
Em última análise, este método de extração de hemócitos pode ser usado como um método rápido e eficaz para contar os citos de várias espécies de lagartas e conservá-los como uma ferramenta para examinar aspectos fisiológicos da resposta imune celular dos insetos. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para extrair hemosots de lagartas com proxe muito reduzida. Outros modelos de lagartas são sangrados cortando um dos profissionais, extraindo os citos do líquido que sai.
Além disso, essa técnica pode ser usada para extrair o hemotipo de outras espécies de insetos. Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da ecoimunologia, como a resposta imune celular do inseto varia com a qualidade da dieta, estágio de desenvolvimento ou exposição a diferentes patógenos. Para iniciar este procedimento, anestesiar as larvas do penúltimo ínstar, resfriando-as no gelo por 20 minutos antes da extração do hemócito.
Depois disso, encaixe a extremidade cega de uma agulha capilar limpa de calibre 16 no tubo que está conectado a uma seringa de vidro de 20 mililitros. Deixe o tubo que contém a solução de coleta aberto na bancada do laboratório. Encha lentamente o capilar com aproximadamente 10 a 15 microlitros de tampão.
Em seguida, coloque a agulha em uma bola de argila que é colocada ao lado do microscópio de dissecação. Coloque a lagarta em uma placa de Petri. O inseto deve ser posicionado de lado de forma que as esféricas fiquem claramente visíveis.
Enquanto visualiza sob um microscópio de dissecação, segure a lagarta no lugar com um par de pinças e coloque a agulha perto de uma das esféricas, onde a cutícula do inseto é geralmente mais macia. Em seguida, pressione suavemente a agulha capilar contra o corpo do inseto. Uma vez que a agulha tenha penetrado na cutícula, injete o volume total da solução na lagarta.
O corpo da lagarta inchará após a injeção, mas não deve estourar ou escorrer. Retorne a lagarta para a placa de Petri gelada. Posicione o inseto dorsalmente para evitar que o tampão vaze para fora da ferida.
Repita as injeções para cada lagarta usada para extração hemo limp. Em seguida, deixe todos os insetos esfriarem no gelo por 30 minutos. Agora, coloque a lagarta em uma placa de Petri sob o microscópio de dissecação.
Faça cuidadosamente uma incisão rasa com cerca de dois a três milímetros de comprimento na região posterior da lagarta, usando um bisturi estéril sem danificar o intestino ou outros órgãos internos. Em seguida, aperte a lagarta suavemente usando um par de pinças de plástico flexível enquanto coleta aproximadamente 10 a 20 microlitros da mistura hemo limp com uma ponta de pipeta de 10 microlitros. Novamente, tome cuidado para não ferir os tecidos internos.
Depois disso, descarte os restos de lagartas. Colete o hemo limp de cada lagarta em tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitro rotulados e rotulados separadamente. Em seguida, adicione aproximadamente 10 a 20 microlitros da solução de incubação a cada amostra hemo claudicante coletada de uma lagarta individual.
Mantenha as amostras de hemolinfa no gelo o tempo todo nesta etapa. Misture a amostra de hemolinfa e a solução de incubação imediatamente antes da contagem. Ele cita.
Este tratamento permite a separação adequada dos citos e evita a aglomeração. Use uma ponta de pipeta limpa para transferir 10 microlitros de hemolinfa sample misturada com a solução de incubação para um hemocitômetro. Em seguida, usando um microscópio composto, conte e registre o número de citos em pelo menos 15 dos grandes quadrados da grade central do hemocitômetro.
Some esses valores para obter uma soma total do número de hemócitos nos 15 quadrados. Em seguida, enxágue bem o hemocitômetro e sua lâmina de tampa usando um frasco de lavagem com água destilada e deionizada. Em seguida, seque-o com lenços umedecidos.
Repita os procedimentos para o resto das amostras de hemoclaudicação e calcule o número médio de citos por mililitro de volume de hemoclaudicação para cada lagarta. A imagem de microscopia de campo claro mostra os citos he extraídos das lagartas do núcleo hin ai com uma ampliação de 20 x. Após este procedimento, os hemócitos coletados podem ser usados para estudar a resposta imune celular e estabelecer ensaios como fagocitose e cap, encapsulamento selecionado e atividade da pH oxidase.
Além disso, R-N-A-D-N-A e proteína podem ser coletados sem uso para ensaios adicionais, a fim de estudar essas respostas imunes celulares em insetos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como injetar lagartas com o objetivo de extrair hemolinfa e como coletar hemolinfa contendo hemócitos vivos.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas silvestres. Os hemócitos desempenham papéis cruciais tanto em funções imunes quanto não imunes durante o desenvolvimento dos insetos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia de insetos
- Função dos hemócitos
- Biologia do desenvolvimento
Contexto
- Os hemócitos são essenciais para as respostas imunológicas de insetos.
- Compreender os tipos de hemócitos auxilia no estudo da biologia dos insetos.
- O conhecimento atual baseia-se principalmente em modelos genéticos.
- Este estudo concentra-se em lagartas silvestres para ampliar o conhecimento existente.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para extração de hemócitos.
- Visualizar hemócitos para melhor compreensão de suas funções.
- Quantificar hemócitos para avaliar seu papel na fisiologia de insetos.
Métodos Utilizados
- Anestesiar lagartas em gelo.
- Injetar uma solução tampão com anticoagulante.
- Realizar uma incisão superficial para facilitar a extração de hemócitos.
- Aspirar o hemolinfa e misturá-lo com tampão para análise.
Resultados Principais
- Extração e visualização bem-sucedidas de hemócitos.
- Quantificação de hemócitos utilizando um hemocitômetro.
- Demonstrou a viabilidade do método em lagartas silvestres.
- Forneceram informações sobre a circulação e função dos hemócitos.
Conclusões
- O método permite o estudo eficaz de hemócitos em lagartas silvestres.
- Amplia a compreensão das respostas imunológicas em insetos.
- Pode ser aplicado a outras espécies de insetos para estudos comparativos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A extração e quantificação confiáveis de hemócitos de lagartas silvestres permitem o estudo dos mecanismos de imunidade inata em espécies de insetos não-modelo, apoiando a validação inicial de alvos em imunologia de insetos. Este protocolo fornece um fluxo de trabalho padronizado para o isolamento de células imunes, facilitando estudos comparativos e ensaios funcionais relevantes para pesquisas translacionais e ecoimunologia. O método aumenta a confiança preditiva na caracterização da resposta imune, orientando decisões ajustadas ao risco em etapas de descoberta que envolvem modelos de insetos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da diversidade e função de células imunes em insetos de espécies não modelo.
- Apoia a desmistificação biológica ao fornecer acesso a células imunes primárias para estudos mecanicistas.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de ensaios imunológicos subsequentes.
- Aprimora a confiança preditiva em hipóteses sobre respostas imunes em pesquisas baseadas em insetos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara amostras validadas de hemócitos para ensaios imunológicos quantitativos e funcionais.
- Padroniza a extração e contagem celular, favorecendo a reprodutibilidade entre experimentos.
- Permite o preparo escalonável de hemócitos para triagem de efeitos de patógenos ou compostos.
- Fornece números confiáveis de células para normalização de ensaios e análise comparativa.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com estudos de ecoimunologia ao permitir o perfil imunológico em populações silvestres.
- Apoia a continuidade desde a coleta de campo até ensaios funcionais baseados em laboratório.
- Facilita o avanço com ajuste de risco de modelos de insetos para pesquisa translacional.
- Oferece desvio mecanicista de risco para estudos de modulação imunológica e interação com patógenos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de extração de hemócitos situa-se na interface entre a descoberta inicial e o desenvolvimento de ensaios, permitindo estudos de células imunes orientados por hipóteses em modelos de insetos silvestres.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre diversidade e função de células imunes em insetos não modelados.
- Triagem: Fornece preparações padronizadas e quantitativas de hemócitos para ensaios imunológicos subsequentes.
- Análise: Fornece contagens celulares e dados morfológicos para comparar respostas imunes entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a coleta de campo com o perfilamento imunológico em laboratório para estudos de ecoimunologia e estudos comparativos.
- Reutilização em Escala: Oferece um protocolo reutilizável adaptável a diversas espécies de lepidópteros e insetos aparentados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de células imunes e reduz a ambiguidade mecanicista na imunologia de insetos.
- Valor Operacional: Padroniza a extração e contagem de hemócitos para fluxos de trabalho reproduzíveis e escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir ou não em pesquisas imunológicas baseadas em insetos e em fluxos de ecoimunologia.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de modelos de insetos para estudos funcionais e translacionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de insetos e em técnicas de microdissecção.
- Exige acesso a microscópios estereoscópicos e microscópios compostos, hemocitômetros e instrumentos estéreis.
- Exige padronização entre equipes para protocolos de coleta de amostras e contagem de células.
- Pode ser adaptado a diversas espécies de lepidópteros e insetos relacionados com modificações mínimas.
- O rendimento da amostra e a viabilidade celular podem variar conforme a espécie e o estágio de desenvolvimento.
