Uma variante do método EPA 1623 que usa fluxo tangencial ultrafiltração de fibra oca e Passos de calor de dissociação para detectar Waterborne

O objetivo geral deste procedimento é detectar e visualizar espécies de Cryptosporidium e Giardia veiculadas pela água. Isso é realizado primeiramente concentrando a amostra de água utilizando filtração ultra-rápida tangencial com fibra oca. O segundo passo consiste em eluir os organismos e reter os detritos do filtro após uma etapa de centrifugação.

A separação imunomagnética permite a separação seletiva dos parasitas a partir dos resíduos concentrados. As microesferas magnéticas são destacadas dos parasitas por dissociação térmica e removidas utilizando um ímã. Em seguida, cistos e O cistos são colocados em uma lâmina e a amostra é corada para visualização por microscopia de imunofluorescência.

A principal vantagem da filtração hofi em comparação com técnicas existentes é que o ultrafiltro é significativamente menos caro e capta múltiplos microrganismos além de Cryptosporidium e Giardia, como vírus e bactérias. Geralmente, indivíduos novos na imunoseparação enfrentarão dificuldades com a quantidade e o tipo de detritos associados a diferentes amostras provenientes de condições climáticas variadas. Comece montando o aparelho de ultrafiltração dentro de uma cabine de segurança biológica.

Uma vez montado, o aparelho funciona da seguinte maneira: a amostra de água entra no sistema passando pelo conector em T preto e se desloca pela cabeça da bomba, pelo manômetro e em seguida para o filtro ultrafino de fibra oca. A água filtrada sai pela lateral do filtro em direção ao recipiente de resíduos. A água retida, contendo os organismos, é forçada a entrar no frasco de retenção e recirculada pelo sistema até que o volume de água seja reduzido. Para iniciar o procedimento, remova a tampa de ventilação e abra todas as pinças, exceto a pinça de compressão dois, que deve permanecer fechada para permitir que o frasco de retenção encha com a água. Configure o sentido da bomba de modo que a amostra de água flua em direção ao filtro.

Em seguida, ajuste a velocidade da bomba para 25% e ligue a bomba quando o frasco de renato estiver aberto com dois terços de sua capacidade preenchidos. Feche a pinça dois e tampe o frasco rapidamente com a tampa de ventilação. Verifique todas as tubulações e conexões para garantir que não haja vazamentos.

Em seguida, aumente lentamente a velocidade da bomba para cerca de 1,5 litro por minuto usando um cilindro graduado e cronômetro ou um medidor de fluxo, e verifique se a taxa de filtrado — a taxa de saída da água pela linha de efluente — é realmente de 1,5 litro por minuto. Monitore o processo de filtração garantindo que a garrafa de retenção nunca fique vazia, embora o volume possa aumentar ou diminuir ligeiramente. Se o volume cair abaixo de um terço, remova a tampa de ventilação e feche a braçadeira de compressão dois.

Novamente, permita que o volume no frasco aumente até dois terços. Em seguida, recoloque firmemente a tampa de ventilação e abra novamente o clipe dois. Assim que o recipiente da amostra estiver vazio, feche imediatamente o clipe de compressão um, reduza a velocidade da bomba para 20%. Remova a tampa de ventilação do frasco do retentado e feche o clipe da rampa que conecta o tubo de efluente da coluna de filtração ao tanque de resíduos.

Ajuste o volume no frasco retentor para cerca de 200 mililitros apertando ou soltando a braçadeira da rampa. Em seguida, aperte a braçadeira da rampa para a eluição eluir a amostra. Primeiro, adicione 500 mililitros de solução eluente ao recipiente da amostra, enxaguando o interior do recipiente no processo.

Em seguida, coloque a pipeta de 10 mililitros conectada à linha de captação da amostra no recipiente da solução eluciana. Abra momentaneamente a braçadeira de compressão um e feche a braçadeira de compressão dois para aspirar a solução eluciana. Uma vez que toda a solução tenha sido carregada, feche a braçadeira de compressão um, abra a braçadeira de compressão dois e deixe a solução circular por cinco minutos com uma velocidade da bomba de 20%. Aperte ou afrouxe a braçadeira de rampa para ajustar o volume da amostra no frasco de renato a cerca de 100 mililitros.

Em seguida, aperte completamente o grampo da rampa e deixe a amostra recircular por um minuto. Neste ponto, inverta o sentido da bomba por 20 segundos. Isso resultará no acúmulo de cerca de 225 mililitros de amostra no frasco tate.

Em seguida, desligue a bomba. Remova o tubo da cabeça da bomba e o tubo que sai do filtro e segure o tubo sobre o frasco coletor para forçar qualquer amostra remanescente a entrar no frasco. Em seguida, desconecte todos os tubos do frasco e substitua a tampa ventilada por uma tampa não ventilada.

Transfira a amostra concentrada para um tubo cônico de centrífuga de 250 mililitros. Enxágue o frasco do renato duas vezes com 10 mililitros de água reagente e transfira o líquido de enxágue para o tubo de centrífuga. Centrifugue a amostra a, no mínimo, 1500 vezes a gravidade (×g) por 15 minutos.

Não utilize uma desaceleração rápida para interromper a centrifugação. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante até deixar cinco mililitros acima do pellet. Deve-se ter cuidado extra para permanecer na parte superior do nível líquido e evitar a aspiração de cistos O e cistos que estão dentro do pellet.

Vortexe o tubo para ressuspender completamente o precipitado. Em seguida, transfira a amostra para um tubo Dyal L 10 com lados planos contendo um mililitro de cada do tampão 10 X SL A e do tampão B. Enxágue o tubo de centrífuga duas vezes com 2,5 mililitros de água reagente e adicione a solução de enxágue ao tubo Dyal L 10. Adicione 100 microlitros de cada anticorpo conjugado a partículas magnéticas anti-Cryptosporidium e anti-Giardia ao tubo, completando o volume final para 12 mililitros.

Em seguida, gire o tubo a 18 RPM por uma hora à temperatura ambiente em um agitador rotativo após a rotação. Coloque o lado plano do tubo contra o ímã MP six e balance suavemente o tubo por dois minutos sem retirar o tubo do ímã. Mantenha o lado plano voltado para cima e decante o sobrenadante.

Tendo o cuidado de não perturbar as microesferas retidas no lado plano do tubo próximo ao ímã. Remova o tubo da amostra do ímã e lave o lado plano do tubo três vezes com 500 microlitros de tampão A, evitando os detritos no lado arredondado do tubo. Transfira cada volume de lavagem para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro posicionado dentro de um ímã MPCS.

Com o ímã na posição vertical, feche o tubo e agite suavemente por um minuto. Em seguida, mantendo o ímã no lugar, aspire o sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur posicionada no fundo do tubo e adicione cuidadosamente um mililitro de PBS ao tubo.

Tenha cuidado para não perturbar o pellet de microesferas. Fixe na parede do tubo adjacente ao ímã. Remova a fita magnética e agite suavemente o tubo até que as microesferas estejam novamente em suspensão.

Reinsira a tira magnética na posição vertical. Agite suavemente o tubo por um minuto e aspire o sobrenadante, removendo o máximo de resíduos possível sem perturbar as microesferas. Após esta lavagem, remova o ímã e adicione 50 microlitros de água reagente diretamente sobre a paleta de microesferas.

Vortex a tubo em velocidade máxima por 50 segundos para ressuspender as esferas. Em seguida, incubar a amostra a 80 graus Celsius por 10 minutos, permitindo que os cistos de Giardia e os cistos de cryptosporidium se dissocie das esferas. Após a incubação, vortex a amostra por 30 segundos. Em seguida, colocar a tira magnética no MPCS utilizando a posição inclinada para separar as esferas dos cistos e dos O cistos em suspensão.

Transfira o sobrenadante contendo cistos e cistos O para uma lâmina com poço. Repita pela segunda vez os passos de adição de água, vortex e dissociação por calor, adicionando o sobrenadante à mesma lâmina. Em seguida, coloque a lâmina sobre um aquecedor de lâminas a 37 graus Celsius para secar a suspensão.

Inicie aplicando 50 microlitros de metanol na lâmina para fixar a amostra e deixe secar à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 50 microlitros da solução DPI e incube a lâmina por dois minutos à temperatura ambiente. Para corar os núcleos, use um lenço de papel Kim para remover o excesso de solução do poço, tomando cuidado para não tocar o poço.

Em seguida, adicione 50 microlitros de corante fácil para corar a parede celular dos cistos de Giardia e dos cistos de cryptosporidium o. Incube a amostra a 35 graus Celsius por 30 minutos. Remova o corante com o lenço Kim, como antes.

Em seguida, adicione lentamente 300 microlitros de tampão fixador fácil de coloração frio colocando cuidadosamente a ponteira da pipeta fora do poço e permitindo que o líquido entre no poço. Incube a lâmina por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o tampão utilizando uma toalha de papel absorvente e aplique 10 microlitros de meio de montagem, colocando suavemente uma lamínula sobre a amostra, removendo quaisquer bolhas, e selando a lamínula com esmalte incolor. Utilizando um microscópio de fluorescência, examine a lâmina com aumento de 200 x a 1000 x e um filtro fse então DPI com aumento de 200 x; cistos e O cistos aparecem como estruturas ovóides com fluorescência verde brilhante, semelhante à cor de maçã, com bordas fortemente destacadas.

Os oocistos de Cryptosporidium são redondos e variam em tamanho de quatro a seis mícrons. Os cistos de Giardia são maiores, com largura de cinco a 15 mícrons e comprimento de oito a 18 mícrons, e podem ser redondos ou ovóides em uma ampliação de 1000 x. E, utilizando o filtro DPI, a estrutura interna dos cistos e CYS pode ser melhor apreciada.

Tipicamente, até quatro esporozoítas, que aparecem como núcleos corados em azul-celeste com o corante DPI, são visíveis dentro dos oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia. A microscopia de contraste de fase diferencial (DIC) também pode auxiliar na identificação adequada dos parasitas, pois outras características morfológicas podem ser observadas. Os esporozoítas de Cryptosporidium podem ser visíveis por DIC; frequentemente, os cistos de Giardia exibem uma ou mais estruturas internas discerníveis, como núcleos visíveis, organelas em forma de crescente denominadas corpos medianos e estruturas flagelares internas chamadas axonemas.

É importante observar que o procedimento de ultrafiltração com fibra oca tem a capacidade de capturar múltiplos microrganismos. Além disso, outros ensaios de detecção, como QPCR e tipagem genética, podem ser aplicados às amostras concentradas, o que torna este método mais flexível e mais adaptável às suas aplicações. Obrigado por assistir e informe-nos se tiver alguma dúvida.