Name: Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a avaliar a angiogênese em modelo de rato nu com metástase óssea de câncer de mama usando ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultrassom. Este método permite análise não invasiva da vascularização tumoral em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR-23 e SFB-TR 79, TB e DK). Os autores gostariam de agradecer Bangert Renate, Karin Leotta e Lisa Seyler para assistência técnica excelente.

1. Cultura de Células <ol><li> Cultura MDA-MB-231 células cancerosas de mama humanos (American Type Culture Collection) em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Alemanha) suplementado com FCS 10% (Sigma, Alemanha). Manter todas as culturas em condições padrão (37 ° C, atmosfera humidificada, 5% de CO 2) e as células de passagem 2-3 vezes por semana para mantê-las em crescimento logarítmico. Para o modelo animal descrito abaixo, não há necessidade de utilização de osso sub-linhas específicas de MDA-MB-231 células como a taxa de absorção do tumor é superior a 90% 1. </li><li> Colheita sub-confluentes de células tumorais após utilizando EDTA 2 mM em PBS-(salino tamponado com fosfato sem Ca 2 + e Mg 2 +) e 0,25% de tripsina (Sigma, Taufkirchen, Alemanha). Contagem de MDA-MB-231 células em uma câmara de Neubauer e suspendê-las em meio RPMI-1640 (5x10 5 células em 1 mL). </li></ol> 2. Modelo de Rato Nudez de metástase óssea <ol><li> Todos os experimentos foram aprovados pela anima responsável governamentall comitê de ética. </li><li> Use ratos nus com uma idade de 6-8 semanas e mantê-los na isentos de agentes patogénicos condições em um sistema animal apropriado pequena (por exemplo, sistema de mini-barreira). Manter os animais em condições controladas (21 + / - 2 ° C a temperatura ambiente, humidade 60%, e 12 hr ritmo de luz-escuro) e oferecem alimentação autoclavado e água ad libitum para os ratos. </li><li> Antes da cirurgia animal, injectar um medicamento analgésico (por exemplo, carprofeno 4 mg / kg sc; devido à sua administração única e meia-vida curta (cerca de 8 horas), carprofeno não deve afectar o crescimento do tumor). Anestesiar ratos com uma mistura de oxigénio (0,5 l / min) e isoflurano (1-1,5% vol.) E certificar-se o rato é anestesiado adequadamente e respira regularmente antes de iniciar o procedimento seguinte. </li><li> Coloque o animal anestesiado sob um microscópio binocular adequada operacional (por exemplo, Leica) e trabalhar com uma ampliação de 16 vezes. </li><li> Comece o procedimento cirúrgico, cortando a pele e tecido subcutâneo na inguinal região em um comprimento de 2-3 cm, utilizando tesoura (tesoura BC060r Iris 108 mm). Todas as artérias se ramificam a artéria femoral (FA) tem que ser dissecado incluindo a artéria epigástrica superficial (SEA), artéria descendente genicular (DGA), artéria poplítea (PA) e da artéria safena (SA). </li><li> Coloque grampos sobre a artéria femoral proximal da origem do SEA, bem como sobre a DGA, PA e SA para temporalmente ocluir o fluxo de sangue local. Ligar o SEA na sua parte distal para permitir a abertura deste navio sem sangramento (Figura 1A). </li><li> Cortar o mar usando tesouras (Vannas Micro-SCRS-sulcado STR 85 mm) proximal da ligadura (Figura 1B) e administrar uma solução papaverin 1% para o mar, a fim de facilitar a inserção subsequente de uma agulha devido ao relaxamento do vaso ( A Figura 1C). </li><li> Cortar aproximadamente metade do diâmetro do SEA com uma tesoura e inserir uma agulha (0,3 mm de diâmetro e 42 mm de comprimento) para dentro do lúmen do mar, enquanto Holding o corte final do vaso com um fórceps (Figura 1D, E). Quando disponível, fixar a agulha em um dispositivo externo para reduzir os movimentos irregulares que podem resultar em perfuração da parede do vaso. Conectar uma seringa para a agulha. Remova o clipe da FA distal e colocá-lo na artéria safena (Figura 1F). </li><li> Injectar as células MDA-MB-231 suspensos em 0,2 ml de meio lentamente para o mar. Em virtude dos clipes MDA-MB-231 células são dirigidos para a DGA e PA. Remova a agulha e ligar o SEA para prevenir o sangramento antes de tirar os clips da artéria. Fechar a ferida usando grampos cirúrgicos e terminar a anestesia inalatória. </li><li> Para pós-procedimento de monitorização, os ratos são sacrificados geralmente 7-8 semanas após a inoculação das células tumorais para evitar complicações graves esqueléticos. Durante este tempo, os animais devem ser monitorizados diariamente para avaliar o tamanho do tumor e qualquer evidência de dor (por exemplo, os desvios comportamentais, perda de peso, defeitos do motor). Se os animais apresentam um tumortamanho superior ao limite permitido eticamente ou evidência de dor durante o crescimento do tumor, eles têm de ser sacrificado. </li><li> Imuno-deficientes (Nude) ratos foram usados ​​para o transplante de xenógena humanos MDA-MB-231 células de cancro da mama. Ratos nus não foram escolhidos para visualizar melhor o crescimento do tumor. </li></ol> 3. Imagem por Ressonância Magnética (RM) <ol><li> Após a inoculação de células tumorais, permitem que cerca de 25-30 dias de crescimento do tumor, antes de começar com a criação de imagens. Para RM usar um scanner dedicado experimental ou um sistema de MR humana com uma bobina de animal adequado. Foi utilizado um sistema humano MR (Symphony, Siemens, Alemanha) e uma bobina construídos em casa para a excitação de radiofrequência e de detecção, concebido como um volume cilíndrico ressonador com um diâmetro interno de 83 mm e um comprimento útil de 120 mm (Figura 2A). </li><li> Anestesiar o rato com o oxigênio e isoflurano como dado acima. Coloque um cateter na veia da cauda e fixá-la sobre a cauda utilizando uma torneira<html> e. Conectar uma seringa contendo o agente de contraste (por exemplo, 0,1 mmol / kg de Gd-DTPA em aproximadamente 0,5 ml; Magnevist, Bayer-Schering, Alemanha). </li><li> Coloque o rato no sistema MR manter a anestesia por inalação. Comece com uma seqüência MR morfológica para localizar a metástase óssea (por exemplo, ponderada em T2: seqüência turbo spin eco, TR 3240 ms, TE 81 ms, matriz de 152 x 256, FOV 90 x 53,4 milímetros 2, espessura de corte de 1,5 mm, 3 médias, digitalização tempo 3:40 min). </li><li> Determinar uma fatia da metástase óssea com o maior diâmetro e iniciar a seqüência de DCE-MRI (por exemplo, saturação de recuperação sequência de flash turbo, TR 373 ms, TE 1,86 ms, matriz de 192 x 144, FOV 130 x 97,5 milímetros 2, espessura de corte de 5 mm, 512 medições, médias 1, tempo de varredura min 6:55). Depois de cerca de 30 seg, começam a injectar o agente de contraste ao longo de um período de tempo de 10 seg. O tempo total para os procedimentos acima mencionados para realizar um exame de ressonância magnética é aproximadamente 15-20 min por animal. </li></ol>title &quot;&gt; 4. Tomografia Computadorizada Volumétrica (VCT) <ol><li> Escolher um sistema de CT adequado, quer humano ou um scanner de um experimental. Aqui, usamos um protótipo de tela plana equipada volumétrica A tomografia computadorizada (Figura 2B; Volume CT, Siemens, Alemanha). </li><li> Anestesiar o rato com o oxigênio e isoflurano como dado acima. Coloque um cateter na veia da cauda e fixá-la sobre a cauda utilizando uma fita adesiva. Conectar uma seringa contendo o agente de contraste (por exemplo, 1 g de iodo por quilograma em aproximadamente 0,5 ml; Imeron 400, Bracco, Alemanha). </li><li> Coloque o rato sobre o scanner sob anestesia geral inalatória. Use os parâmetros de digitalização a seguir para VCT: tubo de 80 kV de tensão, corrente do tubo de 50 mA velocidade de rotação, tempo de varredura 51 seg, 10 seg, quadros por 120 segundo, matriz de 512 x 512 e uma fatia de espessura 0,2 mm. Injectar o agente de contraste durante a rotação segundo o sistema de painel plano. O tempo total para os procedimentos acima mencionados para realizar uma análise VCT é min aproximadamente 5-10 por Animai. </li><li> Reconstruir imagens com um FDK modificado (Feldkamp-Davis-Kress) cone-beam algoritmo de reconstrução (kernel H80a, Afra, Alemanha). </li></ol> 5. O ultra-som (EUA) <ol><li> Sistemas experimentais e clínicos dos EUA estão disponíveis para este fim. Utilizou-se o clínico sistema Acuson Sequoia sistema de ultra-som 512 com um transdutor de 15L8 linear (Figura 2C; Siemens-Acuson, Mountain View, CA). </li><li> Anestesiar o rato com o oxigênio e isoflurano como dado acima. Coloque um cateter na veia da cauda e fixá-la sobre a cauda utilizando uma fita adesiva. Conectar uma seringa contendo um agente de contraste de microbolhas (por exemplo, 1,6 ml / kg em aproximadamente 0,5 ml; SonoVue, Bracco, Itália). Fixar o transdutor EUA na perna respectiva traseira utilizando um tripé e aplicar EUA gel entre o transdutor ea perna. </li><li> Execute B-mode imaging (frequência de transmissão: 17 MHz; índice mecânico: 0,51) para determinar o maior diâmetro da metástase óssea e corrigir o transdutor em tsua posição. Adicionar Doppler do sinal no modo B-imagens para obter informações sobre a perfusão tecidual. Por favor, tenha em mente que as lesões que interrompem apenas osso cortical são acessíveis a ondas de norte-americanos. </li><li> Para dinâmico de contraste EUA (DCE-US) definir o dispositivo dos EUA em cadência contraste pulso seqüenciamento (CPS) modo (freqüência de transmissão: 7 MHz; índice mecânico: 0,18), injetar as microbolhas e gravar um cine loop de 90 segundos comprimento. O tempo total para os procedimentos acima mencionados para realizar uma análise dos EUA é aproximadamente 10-15 min por animal. </li></ol> 6. Pós-processamento de dados de imagem <ol><li> Use as informações morfológicas da RM, VCT e dos EUA para caracterizar o tumor dos tecidos moles (MRI, EUA) e da destruição do esqueleto (VCT) de metástases ósseas e determinar a localização, tamanho da lesão e volume das lesões com um visualizador DICOM (por exemplo Osirix Dicom Viewer). </li><li> Para obter o padrão de ramificação de vasos em metástases ósseas (angiografia), os dados de ATV pode ser usado. Reconstruir imagens 2D ou 3D, utilizando as informações da fase arterial, com ou sem técnicas de subtração (por exemplo Osirix Dicom Viewer). </li><li> Para quantificar parâmetros da vascularização do DCE-MRI, DCE-VCT e DCE-US, use ferramentas de software específicas para as modalidades. Para DCE-RM, determinar o vascular parâmetros amplitude A (associada com o volume de sangue) ea taxa de câmbio constante k ep (associada com a perfusão e permeabilidade dos vasos) em metástases ósseas com Dyna Lab (Mevis Research, Bremen, Alemanha) com base na dois- modelo de compartimento de Brix 8,9. Modelos alternativos de farmacocinética para avaliação estão disponíveis, por exemplo, o modelo Tofts 10. </li><li> Para quantificar DCE-VCT de dados, realizar uma análise descritiva dos dados para calcular os parâmetros, tais como área sob a curva (AUC) ou intensificação de pico (PE) com Dyna Lab (Mevis Research, Bremen, Alemanha). </li><li> Quantificar informações em tempo real DCE-US usando software de análise quantitativa (por exemplo Qontrast, Bracco, Itália), analisando cine-loops de acordo com o modelo implementado bólus. Coloque a região de interesse (ROI) sobre a metástase óssea, determinar ou fatores descritivos, tais como área sob a curva ou parâmetros quantitativos a partir de códigos de cores mapas, por exemplo, volume de sangue regionais, do fluxo sanguíneo regional e tempo de enchimento. </li></ol> 7. Os resultados representativos Após a injecção intra-arterial de MDA-MB-231 células para o mar (Figura 1), metástases ósseas site-specific desenvolver na perna respectiva traseira do rato nu. Lesões osteolíticas confinados ao fêmur, tíbia e fíbula pode ser trabalhada de forma não invasiva por ressonância magnética, VCT e dos EUA (Figura 2) começando aproximadamente 25-30 dias após a injeção e acompanhados por várias semanas. Ao combinar ressonância magnética, VCT e EUA, incluindo nativos e com contraste de técnicas, informações complementares podem ser avaliados em metástases ósseas que são compostos de um tecido maciotumoral (células tumorais e estroma) ea lesão osteolítica respectivo (a destruição do osso). Para comparação dos respectivos dados entre as técnicas, todos os três métodos de imagem pode ser utilizada sequencialmente no mesmo rato. RM exibe morfologia do tecido metastático ósseo macia que é inicialmente confinado à cavidade da medula óssea e, subsequentemente, excede o osso cortical, no decurso do desenvolvimento. Os parâmetros funcionais, tais como regionais perfusão sanguínea do volume, e permeabilidade do reservatório pode ser obtido a partir de DCE-RM e quantificado (Figura 3). Estrutura óssea e, em particular as alterações osteolíticas nas metástases são avaliados em alta resolução por VCT. Em complemento a resultados de MRI, lesões osteolíticas estão localizadas adjacentes aos intramedular crescimento do tumor. VCT angiografia revela a arquitectura macrovaso alterado de metástases ósseas, e DCE-VCT exibe respectivos aspectos da microcirculação (Figura 4). Devido à destruição local do osso cortical em metastatilesões c, EUA é aplicável para avaliar as características morfológicas e funcionais do tumor do tecido mole através da utilização de modo-B e técnicas de Doppler. Após a aplicação de microbolhas, DCE-EUA permite imagens em tempo real da vascularização em metástases ósseas (Figura 5). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig1.jpg" /> Figura 1. Perna Hind de um rato nu preparado para a inoculação de células tumorais como fotografada através de um microscópio de operação. Um padrão, ramificação da artéria femoral (FA), incluindo a artéria epigástrica superficial (SEA), artéria descendente genicular (DGA), artéria poplítea (PA) e da artéria safena (SA). Clipes arteriais colocado no SA, PA e FA proximal, bem como a ligação da AAE; B, SEA foi cortada proximal da ligadura; C, relaxamento muscular da AAE após a adição de papaverina; D, incisão da SEA (retomada por uma pinça); E, inserção de agulha em SEA; F, agulha fixada na SEA (externo fi<html> xating dispositivo) e injeção de MDA-MB-231 células tumorais através da SEA para o DGA e PA, em virtude dos clipes. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig2.jpg" /> A Figura 2 A, humana MR sistema (Symphony, Siemens, Alemanha) e uma bobina construídos em casa para a excitação de radiofrequência e de detecção colocado no scanner;. B, plana equipado volumétrico A tomografia computadorizada (CT Volume, Siemens, Alemanha); C, clínica ultra-som Acuson sistema Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig3.jpg" /> Figura 3. Cortes axiais de RM. Painel esquerdo, T2w RM; painel do meio, amplitude A (DCE-MRI); painel direito, taxa de câmbio constante k ep (DCE-MRI). As setas indicam a metástases ósseas. O mapa de cores para intervalos DCE-MRI dados do vermelho (alto valor) para azul (valores baixos). 78/4178fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Reconstruções de ATV 3D da metástase óssea osteolítica (painel da esquerda) e uma angiografia (painel do meio), bem como uma secção de DCE-VCT na orientação axial a partir do acessório de pico parâmetro (painel da direita). O mapa de cores para intervalos DCE-VCT de dados de vermelho (alto valor) para azul (valores baixos). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4178/4178fig5.jpg" /> A Figura 5. Imagens dos EU de modo-B (morfologia, painel da esquerda), Doppler (perfusão, o painel do meio) e CEUS (painel da direita, o aumento de pico após a injecção de microbolhas de imagens em tempo real da vascularização) de uma metástase óssea. Filme Suplementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4178/4178movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme suplementar</a> .

<ol><li>Bäuerle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+rat+model+with+site-specific+bone+metastasis+induced+by+MDA-MB-231+breast+cancer+cells+and+its+application+to+the+effects+of+an+antibody+against+bone+sialoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein.</a> Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).</li>
<li>Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W., Bäuerle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib+tosylate+and+paclitaxel+induce+anti-angiogenic%2C+anti-tumor+and+anti-resorptive+effects+in+experimental+breast+cancer+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sorafenib tosylate and paclitaxel induce anti-angiogenic, anti-tumor and anti-resorptive effects in experimental breast cancer bone metastases.</a> Eur. J. Cancer. 47, 277-286 (2010).</li>
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<li>Bäuerle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bevacizumab+inhibits+breast+cancer-induced+osteolysis%2C+surrounding+soft+tissue+metastasis%2C+and+angiogenesis+in+rats+as+visualized+by+VCT+and+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Bevacizumab inhibits breast cancer-induced osteolysis, surrounding soft tissue metastasis, and angiogenesis in rats as visualized by VCT and MRI.</a> Neoplasia. 10, 511-520 (2008).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de indução de osso experimental metástases aqui apresentados, em combinação com os procedimentos de imagem permitir o seguimento lesões osteolíticas em ratos nus longitudinalmente. Em nosso modelo, MDA-MB-231 células humanas de câncer de mama são injetadas no mar, que é uma anastomose entre a artéria ilíaca, através do tronco pudendo ea artéria femoral. Consequentemente, o fluxo de sangue para a região fornecido da articulação do joelho é mantida após a ligadura da SEA. As vantagens deste modelo, em comparação ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 células cancerosas de mama humano </td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> HTB-26 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 61870 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Invitrogen </td><td> 10270 </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Carprofeno Rimadyl </td><td> Pfizer </td><td> PZN 110208 </td></tr><tr><td> Magnevist </td><td> Bayer-Schering </td><td> PZN 6961516 </td></tr><tr><td> Imeron 400 MCT </td><td> Bracco </td><td> PZN 228654 </td></tr><tr><td> SonoVue </td><td> Bracco </td><td> PZN 1567358 </td></tr><tr><td> Papaverin </td><td> Alfa Aesar </td><td> L 04152 </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter</td><td> HDG 9623 </td></tr><tr><td> Symphony (ressonância magnética) </td><td> Siemens </td><td></td></tr><tr><td> Volume CT (tomografia computadorizada volumétrica) </td><td> Siemens </td><td></td></tr><tr><td> Acuson Sequioa 512 (ultra-som) </td><td> Siemens Acuson- </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

A angiogênese é uma característica essencial do crescimento do câncer e formação de metástases. Em metástase óssea, factores angiogénicos são cruciais para a proliferação de células tumorais na cavidade da medula óssea, bem como para a interacção do tumor e osso células, resultando em destruição óssea local. Nosso objetivo foi desenvolver um modelo experimental de metástase óssea que permite avaliação in vivo da angiogênese nas lesões ósseas, utilizando técnicas não-invasivas de imagem. Para este propósito, que injectado 10 5 MDA-MB-231 células cancerosas de mama humano na artéria epigástrica superficial, o que impede o crescimento de metástases em outras áreas do corpo do que a perna respectiva traseira 1. Após 25-30 dias após a inoculação de células de tumor, metástases ósseas específicas do local desenvolver, restrita ao fêmur distal, tíbia proximal e fíbula proximal 1. Aspectos morfológicos e funcionais da angiogênese pode ser investigada longitudinalmente no osso metaestase usando ressonância magnética (MRI), tomografia volumétrica computadorizada (VCT) e ultra-som (EUA). RM exibe informações morfológica da parte do tecido mole de metástases ósseas que é inicialmente confinados à cavidade da medula óssea e, subsequentemente, excede o osso cortical, enquanto a progredir. Usando dinâmica de contraste MRI (DCE-MRI) funcional dados, incluindo o volume de sangue regional, perfusão e permeabilidade dos vasos podem ser obtidos e quantificados 2-4. Destruição óssea é capturado em imagens de alta resolução usando VCT morfológica. Em complemento a resultados de MRI, lesões osteolíticas pode ser localizado adjacente a sítios de crescimento do tumor intramedular. Após a aplicação de contraste, VCT angiografia revela a arquitetura macrovaso em metástases ósseas em alta resolução, e DCE-VCT permite discernimento na microcirculação destes 5,6 lesões. Dos EUA é aplicável para avaliar as características morfológicas e funcionais a partir de lesões do esqueleto, devido àosteólise local de osso cortical. Usando modo-B e técnicas de Doppler, a estrutura ea perfusão das metástases do tecido mole pode ser avaliada, respectivamente. DCE-US permite imagens em tempo real da vascularização metástases ósseas após a injeção de microbolhas 7. Em conclusão, em um modelo de site-specific osso câncer de mama metástases técnicas multi-modais de imagem, incluindo ressonância magnética, VCT e informações complementares oferta dos EUA sobre a morfologia e parâmetros funcionais da angiogênese dessas lesões esqueléticas.

Na patogénese da metástase óssea, a angiogénese é um processo crucial e, portanto, representa um alvo para imagiologia e terapia. Aqui, apresentamos um modelo do rato de site-specific metástases ósseas de câncer de mama e descrever as estratégias para não-invasiva angiogênese imagem<em&gt; In vivo</em&gt; Usando ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som.

Multi-modal de imagem de angiogênese em um modelo de rato nu de Câncer de mama utilizando a ressonância magnética, tomografia computadorizada volumétrica e ultra-som

A angiogênese é uma característica essencial do crescimento do câncer e da formação de metástases. Na metástase óssea, os fatores angiogênicos são fundamentais para a célula tumoral...

Este experimento utiliza técnicas de imagem complementares para avaliar não invasivamente a angiogênese em um modelo de rato de câncer de mama. Para metástase óssea, injete primeiramente células humanas de câncer de mama na artéria epigástrica superficial para induzir metástases ósseas osteolíticas em localização específica na pata traseira de ratos nu.Em seguida, utilize os dados morfológicos e funcionais complementares provenientes dessas modalidades de imagem para descrever diferentes aspectos da vascularização em lesões osteolíticas. Os resultados obtidos incluem a arquitetura de vasos macroscópicos, volume sanguíneo local, perfusão e permeabilidade, bem como a imagem em tempo real da vascularização em metástases ósseas. Esses métodos podem ajudar a responder questões fundamentais sobre o papel da angiogênese na patogênese da metástase óssea, o que tem implicações para o diagnóstico por imagem e o tratamento de lesões ósseas malignas.Para o modelo animal descrito aqui, não há necessidade de utilizar uma linhagem celular subespecífica óssea N-D-A-M-B 2 3 1, pois a taxa de enxertia tumoral é superior a 90%. Inicie com uma cultura logarítmica de células de câncer de mama humano em RPMI 1640. O meio suplementado com 10% de soro bovino fetal. Após colher as células tumorais subconfluentes com tripsina, conte as células utilizando uma câmara de Neubauer e suspenda-as em RPMI 1640. Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal Governamental responsável. Anestesie a rata de seis a oito semanas de idade conforme descrito no texto fornecido para o procedimento cirúrgico.Utilize um microscópio cirúrgico binocular apropriado com uma ampliação de 16 vezes. Comece cortando a pele e o tecido subcutâneo na região inguinal em um comprimento de dois a três centímetros. Em seguida, dissecar todas as artérias que se ramificam da artéria femoral, colocar clipes na artéria femoral proximal à origem da S CA, bem como na DGA, PA e S SA para ocluir temporariamente o fluxo sanguíneo local.Em seguida, ligue a AEA em sua parte distal para permitir a abertura deste vaso sem sangramento. Corte a AEA proximalmente à ligadura e administre uma solução de pipen 1% sobre a AEA. Agora, corte aproximadamente metade do diâmetro do vaso com uma tesoura e, enquanto segura a extremidade cortada do vaso com uma pinça, insira uma agulha na luz do vaso.Se possível, fixe a agulha em um dispositivo externo para reduzir movimentos irregulares que poderiam levar à perfuração da parede do vaso. Em seguida, conecte uma seringa à agulha. Remova o clipe da artéria femoral distal e coloque-o na artéria safena.Prossiga com a injeção lenta de 0,2 mililitros das células de câncer de mama MDA-MB-231 na artéria epigástrica superficial. Observe que, em virtude dos clipes, as células são direcionadas para a DGA e pa. Remova a agulha e ligue a artéria epigástrica superficial para prevenir sangramento antes de retirar os clipes arteriais.Após fechar a ferida e interromper a anestesia inalatória, permita um período de crescimento tumoral de 25 a 30 dias no animal. Utilize um scanner de RM experimental dedicado ou um sistema de RM humano com uma bobina apropriada para animais, como esta bobina caseira, para excitação e detecção de radiofrequência. Após anestesiar a rata com oxigênio e fluoreto de ISO, introduza um cateter na veia da cauda e fixe-o na cauda.Usando fita, conecte uma seringa contendo o agente de contraste. Em seguida, coloque a rata no sistema de RM, mantendo a anestesia inalatória. Inicie com uma sequência de RM morfológica para localizar a metástase óssea.Em seguida, determine uma fatia da metástase óssea com o maior diâmetro e inicie a sequência de D-C-E-M-R-I após aproximadamente 30 segundos. Comece a injetar o agente de contraste ao longo de um período de 10 segundos. Escolha um sistema de TC apropriado, seja um scanner clínico ou experimental.Aqui utilizamos um protótipo de um tomógrafo computadorizado volumétrico equipado com painel plano. Após anestesiar a rata com oxigênio e isoflurano, introduza um cateter na veia da cauda e fixe-o à cauda usando fita adesiva. Em seguida, conecte uma seringa contendo agente de contraste.Agora coloque a rata na plataforma do scanner sob anestesia inalatória. Defina os parâmetros de varredura para VCT. Vários sistemas ultrassonográficos experimentais e clínicos estão disponíveis para esse fim.Após anestesiar o rato com oxigênio e isoflurano, posicione um cateter na veia da cauda e fixe-o na cauda utilizando uma fita adesiva. Em seguida, conecte uma seringa contendo um agente de contraste por microbolhas. Fixe o transdutor de ultrassom na pata traseira correspondente utilizando um tripé e aplique gel de ultrassom entre o transdutor e a pata traseira.Em seguida, realize a transmissão de imagem no modo B. Para determinar o diâmetro maior da metástase óssea e fixar o transdutor nesta posição, adicione o sinal Doppler às imagens no modo B para obter informações sobre a perfusão tecidual. Tenha em mente que apenas lesões que rompem o osso cortical são acessíveis às ondas ultrassonoras.Para a ultrassonografia com contraste dinâmico, configure o aparelho de ultrassom no modo cadence com sequenciamento de pulsos para contraste, injete os microbolhas e grave um loop contínuo de 90 segundos de duração. Processe as informações morfológicas derivadas da M-R-I-V-C-T e da ultrassonografia para caracterizar o tumor de partes moles e a destruição óssea das metástases ósseas. Em seguida, determine a localização e o volume das metástases ósseas utilizando um visualizador DICOM para angiografia.Utilizando o visualizador DICOM eRx, considere os dados de VCT para obter o padrão de ramificação dos vasos em metástases ósseas. Reconstrua imagens 2D ou 3D usando as informações da fase arterial com ou sem técnicas de subtração. Para quantificar os parâmetros funcionais da vascularização a partir de D-C-M-R-I-D-C-E-V-C-T e ultrassonografia com contraste dinâmico, utilize ferramentas de software específicas para cada modalidade.Para a D-C-E-M-R, utilizo o Dyna Lab para determinar os parâmetros vasculares associados ao volume sanguíneo e à constante de taxa de troca relacionada à perfusão e à permeabilidade vascular em metástases ósseas. Para quantificar os dados de D-C-E-V-C-T, realize uma análise descritiva dos dados para calcular parâmetros como a área sob a curva ou o realce máximo. Além disso, quantifique as informações provenientes do ultrassom DCE em tempo real, utilizando um software de análise quantitativa mediante a análise de loops cinematográficos. De acordo com o modelo de injeção em bólus implementado, posicione a região de interesse sobre a metástase óssea para determinar fatores descritivos, como a área sob a curva, ou parâmetros quantitativos provenientes de mapas codificados por cores.A injeção intra-arterial de células M-D-A-M-B 2 31 na AEE foi utilizada para desenvolver metástases ósseas específicas no membro traseiro correspondente do rato nu. Esta imagem mostra o padrão de ramificação da artéria femoral, incluindo a artéria epigástrica superficial, a artéria femoral descendente, a artéria poplítea e a artéria safena. Os clipes arteriais são colocados na AE, na AP e na AF proximal, bem como na ligadura da AEE.A AVE foi então seccionada proximalmente à ligadura e, após a adição de papaina, o músculo da parede vascular é relaxado com o uso de pinça. A AVE é incisada e uma agulha é inserida na AVE utilizando um dispositivo externo de fixação da agulha. Células tumorais de câncer de mama humana são injetadas através da AVE e direcionadas para a ADG e pa.Devido às lesões osteolíticas provocadas pelo clipse, restritas ao fêmur, tíbia e fíbula, pode-se obter imagens não invasivas por RNM, TC e ultrassom a partir de aproximadamente 25 a 30 dias após a injeção, com acompanhamento por várias semanas. As três modalidades de imagem podem ser usadas sequencialmente no mesmo rato. A RNM mostra a morfologia do tecido mole metastático ósseo, inicialmente confinado à cavidade da medula óssea e, posteriormente, expandindo-se além do osso cortical ao longo do desenvolvimento.Nestas secções axiais, a imagem de ressonância magnética ponderada em T dois mostra a parte de tecido mole da metástase óssea e os mapas de cor D-C-E-M-R-I exibem os valores de amplitude A e da constante de taxa de troca dentro da estrutura óssea da lesão; em particular, alterações osteolíticas nas metástases são avaliadas em alta resolução pela VCT, complementando os achados de RNM. Lesões OSTEOLÍTICAS localizam-se adjacentes ao crescimento tumoral intramedular. A angiografia por VCT revela a arquitetura alterada dos vasos macroscópicos nas metástases ósseas e a D-C-E-V-C-T exibe os respectivos aspectos da microcirculação devido à destruição local do osso cortical em lesões metastáticas. O ultrassom é aplicável para avaliar características morfológicas e funcionais do tumor de tecido mole mediante o uso das técnicas modo B e Doppler.Após a aplicação de microbolhas, o ultrassom com contraste dinâmico permite a obtenção de imagens em tempo real da vascularização em metástases ósseas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como inoculá-las células tumorais para câncer de mama específico do local, metástases ósseas para imagens dos aspectos morfológicos e funcionais da angiogênese nessas lesões. De forma não invasiva.

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