Name: Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprenda a produzir seda sintética de aranha em escala laboratorial, imitando o processo natural de fiagem. Este método utiliza proteínas recombinantes expressas em bactérias e oferece vantagens como menor custo e potencial para produção em larga escala de biomateriais.

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Este trabalho foi financiado pela NSF RUI Grants MCB-0950372 e 1105310 DMR-intitulado &quot;Caracterização Molecular de Silks aranha viúva negra e comportamento mecânico de Spider Silks cola&quot;, respectivamente.

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<li>La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+minor+ampullate+silk+proteins+are+constituents+of+prey+wrapping+silk+in+the+cob+weaver+Latrodectus+hesperus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus.</a> Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).</li>
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Não há conflitos de interesse declarados.

As fibras sintéticas fiados a partir desta metodologia são mecanicamente sobre a mesma ordem de grandeza em comparação com as fibras naturais. Diminuindo a quantidade de erro humano por mecanização da spooling e processos pós tração de spin, a variação experimental entre as amostras são mais controlada e grandemente reduzida. A nossa metodologia oferece o potencial para investigar as propriedades mecânicas de outras fibras que são fiados a partir de proteínas recombinantes codificados a part...

A seda da aranha tem extraordinárias propriedades mecânicas que se realiza vários materiais sintéticos, incluindo aço de alta resistência, Kevlar e Nylon. 1 Spiders girar pelo menos 6-7 diferentes tipos de fibras que exibem diversas propriedades mecânicas, cada um projetado com quantidades variadas de resistência à tração e extensibilidade para executar tarefas específicas biológicos. 2 cientistas da pesquisa são rapidamente buscar a utilização de sedas aranha como biomateriais próxima geração devido às suas excelentes propriedades mecânicas, a sua biocompatibilidade, ea sua natureza não-tóxico e verde-de material. 3,4 Devido à canibalista e natureza venenosa de aracnídeos, a colheita sedas de aranhas através da agricultura não é uma estratégia prática para atender as demandas necessárias para a fabricação em escala industrial. Portanto, os cientistas virou-se para a produção de proteínas recombinantes de seda em organismos transgénicos acoplado com in vitro fiação de fibras sintéticas a partir doproteínas purificadas. si só, 5-8 Expressão de full-length proteínas recombinantes de seda de aranha foi tecnicamente difícil, dadas as propriedades intrínsecas de suas seqüências de genes, que incluem sua natureza altamente repetitiva e comprimentos físicos (&gt; 15 kb), GC-rica de conteúdo e tendenciosa alanina e glicina utilização de codões. 9-11 Até à data, a maioria dos laboratórios têm-se centrado na expressão formas truncadas das proteínas principais ampullate seda MaSp1 ou MaSp2 utilizando sequências parciais de cDNA ou genes sintéticos. 12-15 Spinning sintético aranha sedas é um processo difícil que requer domínio e conhecimento em várias disciplinas científicas, e as complexidades do processo de fiação não foram totalmente revelados ao público em geral pela representação de vídeo. Na verdade, apenas um punhado de laboratórios em todo o mundo têm a expertise para expressar os cDNAs de seda de aranha, purificar as proteínas da seda, girar fibras sintéticas e fazer a pós spin-draw, e, finalmente, testar suas propriedades de biomateriais. 8,16,17 diferentes abordagens para fiação de fibras sintéticas abrangidas fiação úmida e seca, bem como métodos electrospinning 16,18,19 Todos os procedimentos têm um objetivo em comum -. Desenvolvimento de um protocolo que produz seda de aranha sintética com propriedades mecânicas que rivais tópicos naturais para grande escala processos de fabrico comercial. Aqui descrevemos o procedimento para gerar seda de aranha artificial em escala de laboratório usando uma metodologia de extrusão húmida. Em relação a outros métodos girando, girando molhadas tem produzido os resultados mais consistentes para a análise de fibra. Nós delinear este início procedimento com a expressão das proteínas recombinantes de seda em bactérias, seguido por sua purificação, e, em seguida, descrevem os passos de preparação de proteína para a fiação, incluindo uma metodologia draw pós-rotação aplicado à &quot;tal como fiados&quot; fibras que dá o tópicos com propriedades dos materiais que abordam a qualidade da seda de aranha naturais. Nosso METODOLÓGICASy é projetado para imitar o processo natural de fiação de fibras de seda e baseia a nossa experiência da arquitetura e da função das glândulas produtoras de seda do orbe e cob-aranhas tecendo 20-22. Além disso, podemos concluir com o necessário passos para determinar as propriedades do material das fibras sintéticas usando um tensometer para traçar curvas tensão-deformação, que permitem que os investigadores para calcular a resistência à tracção, a estirpe final, tenacidade e de fibras. Por último, mas de valor significativo, os aparelhos de fiação, o spooling e desenho podem ser construídos em casa usando as peças disponíveis no mercado, ao invés de comprar elaborado e caro equipamento personalizado.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> pBAD / TOPO Kit Expression ThioFusion </td><td> Invitrogen </td><td> K370-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak reagente lise celular, 10x </td><td> Promega </td><td> V857C </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA Agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td> Inclui instruções para buffers </td></tr><tr><td> ProteoSilver Kit Prata Stain </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> PROTSIL1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> FreeZone liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7960041 </td><td> FreeZone 12Plus </td></tr><tr><td> Hexafluoroisopropanol (HFIP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52512 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa </td&gt; <td> Hamilton </td><td> 7657-01 </td><td> 250 uL </td></tr><tr><td> Agulha </td><td> Hamilton </td><td> 7780-01 </td><td> Medidor de 26s, Blunt ponta de agulha removível </td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 702208 </td><td> 11Plus </td></tr><tr><td> Digital Caliper </td><td> Carrera </td><td> CP5906 </td><td> 0-150 mm Gama </td></tr><tr><td> Fórceps em aço inoxidável </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 501764 </td><td> Mini Dumont # M5S </td></tr><tr><td> Motor </td><td> Moinho Natureza </td><td> 7090529 </td><td> 12VDC, 2 rpm </td></tr><tr><td> Atuador Linear </td><td> Warner Elétrica </td><td> 01-D024-0050-A06-LP-IP65 </td><td> 24VDC variando de 6 polegadas </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> Digital Microsccâmera ope </td><td> Leica Microsystems </td><td> DFC320 </td><td> Software: Leica Application Suite v2.8.1 </td></tr><tr><td> Vannas tesoura </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 500260 </td><td></td></tr><tr><td> Microtensometer </td><td> Aurora Científico </td><td> 310C </td><td> 5N Sistema Dual-Mode </td></tr></tbody></table>

produção de seda sintética aranha em escala de laboratório

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

Como a sociedade progride e os recursos se tornam escassos, está se tornando cada vez mais importante para cultivar novas tecnologias que os biomateriais engenheiro de próxima geração com propriedades de alto desempenho. O desenvolvimento destes novos materiais estruturais deve ser rápida, custo-eficiente e envolvem metodologias de processamento e produtos que sejam ecologicamente corretos e sustentáveis. Aranhas giram uma multidão de diferentes tipos de fibra, com diversas propriedades mecânicas, oferecendo uma rica fonte de materiais de engenharia de última geração para biomimicry que rivalizam com os melhores materiais sintéticos e naturais. Como a coleta de grandes quantidades de seda de aranha natural é impraticável, a produção de seda sintética tem a capacidade de fornecer aos cientistas o acesso a um suprimento ilimitado de tópicos. Portanto, se o processo de fiação pode ser simplificado e aperfeiçoado, fibras artificiais de aranha têm o potencial de uso para uma ampla gama de aplicações que vão desde armaduras, sutura cirúrgicas, cordas e cabos, pneus, cordas para instrumentos musicais, e compósitos para a aviação e tecnologia aeroespacial. A fim de avançar o processo de produção de seda e sintéticos para produzir fibras que exibem variação baixa em suas propriedades materiais de rotação para girar, foi desenvolvido um protocolo de extrusão húmida que integra a expressão de proteínas recombinantes de seda de aranha em bactérias, purificação e concentração das proteínas , seguido por extrusão de fibras e um pós-tratamento de spin-mecânico. Esta é a primeira representação visual que revela um processo de passo-a-passo para girar e analisar fibras de seda artificial numa escala de laboratório. Ele também fornece detalhes para minimizar a introdução de variabilidade entre as fibras fiadas a partir da mesma droga de fiação. Coletivamente, estes métodos irá impulsionar o processo de produção de seda artificial, levando a fibras de alta qualidade que superam as sedas naturais de aranhas.

Apesar das propriedades mecânicas excelentes e bioquímicos da aranha sedas, este material não pode ser colhido em grandes quantidades por meios convencionais. Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para produzir fibras de seda de aranha artificial, que é um processo importante para os investigadores que estudam a produção de seda de aranha e sua utilização como a próxima geração de biomateriais.

Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório

À medida que a sociedade progride e os recursos tornam-se mais escassos, torna-se cada vez mais importante cultivar novas tecnologias que desenvolvam a próxima geração de...

O objetivo geral deste procedimento é produzir seda sintética de aranha imitando o processo natural de fiagem da seda de aranha, a fim de replicar em laboratório o processo de fiação da seda. Grandes quantidades de proteína de seda recombinante são produzidas em bactérias, seguidas de purificação por cromatografia e concentração por liofilização. A proteína é solubilizada e a solução de fiação é empurrada através de uma seringa com uma agulha de pequeno diâmetro em um banho de álcool desidratante.Por fim, as fibras sintéticas recém-fabricadas são submetidas a um estiramento pós-fiação para melhorar a orientação molecular das cadeias proteicas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como eletrofiação ou fiação a seco, é o menor custo, facilidade de manipulação e o potencial de ampliar o procedimento para um formato de produção em larga escala. As implicações desta técnica estendem-se para o desenvolvimento de uma nova classe de biomateriais.Esses materiais podem ser utilizados em uma ampla gama de aplicações diferentes, como suturas, armaduras corporais e cordas para instrumentos musicais. Embora este método possa fornecer informações sobre as propriedades materiais das sedas de aranha, ele também pode ser aplicado ao estudo de outros tipos de biopolímeros produzidos a partir de proteínas recombinantes. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica terão dificuldades, pois ela exige expertise em diversas disciplinas, incluindo bioengenharia, biofísica, biologia celular e molecular e bioquímica.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando precisamos imitar o processo natural de fiar realizado pela aranha, na tentativa de produzir fibras sintéticas. Para gerar o plasmídeo que será usado na produção de seda de aranha, o cDNA desejado da seda de aranha é amplificado utilizando conjuntos específicos de primers e ligado a um vetor de expressão prócariota, como o PBA topo thio fusion. Este vetor possui uma marcação terminal N-terminal de tiorredoxina para facilitar a solubilização da proteína da seda e uma marcação C-terminal de seis x his para purificação da proteína.Uma vez ligados, os produtos da ligação são transformados em células competentes de E. coli e uma colônia contendo o plasmídeo é cultivada. A expressão da proteína da seda de aranha é então induzida pela adição de aose, e as células são centrifugadas e armazenadas a menos 80 graus Celsius até o uso para lisar as células bacterianas. Adicione 20 mililitros de tampão de lise 1x ao pellet celular para ressuspendê-las completamente. Em seguida, para promover maior lise celular, adicione lisozima até uma concentração de um miligrama por mililitro para digerir o DNA cromossômico, o que reduz a viscosidade da solução em 100 microgramas de DNA.Em seguida, coloque a amostra em um agitador orbital e agite suavemente por 20 minutos à temperatura ambiente. Soneque a solução por um minuto no nível 19 para clarificar a solução, centrifugue a 16.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, verifique se o sobrenadante está não viscoso e claro; se a solução estiver viscosa e turva, adicione mais DNA, soneque novamente e recupere o sobrenadante.Uma vez que o sobrenadante esteja claro, transfira-o para uma coluna limpa de 25 mililitros BioRad Poly-Prep para cromatografia de afinidade com níquel NTA. Para purificar a proteína de fusão, adicione um mililitro de suspensão de níquel NTA contendo 0,5 mililitro de perlas à coluna, feche bem a tampa e a torneira, e em seguida coloque a coluna em um agitador durante uma hora para equilibrar e permitir a ligação da marcação seis X his às perlas de níquel NTA. Posicione a coluna verticalmente em um suporte e deixe as perlas de níquel NTA sedimentarem por aproximadamente dois minutos.Quando as esferas estiverem completamente sedimentadas, uma camada azul-clara poderá ser observada no fundo. Remova a tampa e permita que a solução escoe através da torneira de fechamento. Colete a solução em um tubo cônico de 15 mililitros.Para análises adicionais, adicione 20 mililitros de tampão de lavagem 1x e deixe as beterrabas sedimentarem. Abra a torneira e colete o fluxo inicial em quatro alíquotas de cinco mililitros. Para análises adicionais, armazene as alíquotas a quatro graus Celsius ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento de curto ou longo prazo, respectivamente.Observe que volumes adicionais de lavagem podem ser utilizados para reduzir a proteína contaminante, no entanto, isso pode diminuir o rendimento total de proteína. Em seguida, adicione 20 mililitros de tampão de eluição 1x e deixe o resina sedimentar, abra a torneira e permita que a solução escoe. Colete esta solução, que contém 20 mililitros, em quatro alíquotas de cinco mililitros para análise adicional.Armazene a quatro graus Celsius ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento curto ou prolongado, respectivamente. Observe que volumes adicionais de eluição podem ser coletados da resina de níquel NTA, se necessário. Em seguida, separe as proteínas com base em suas massas moleculares.Utilizando análise por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, visualize as proteínas com prata ou azul de Comassie brilhante R-250; apenas frações puras devem ser utilizadas para as etapas seguintes. Confirme a identidade da proteína purificada por meio de análise por Western blot; para remover sais e concentrar a proteína, realize diálise e liofilize a amostra de acordo com as instruções no documento anexo, armazenando as amostras liofilizadas a menos 80 graus Celsius. O objetivo das próximas etapas é preparar a solução polimérica e a seringa para o processo de fiação, trabalhando sob uma cabine de segurança.Adicione cuidadosamente a quantidade apropriada de HEXA fluoro, ISOPROPANOL ou HFIP a cada tubo com o pó proteico seco para obter entre 200 miligramas por mililitro e 500 miligramas por mililitro, ou de 20% a 50% peso por volume. Tampe o tubo o mais rapidamente possível após a adição de HFIP, filme os tubos e coloque-os em um agitador para solubilizar a proteína com auxílio de vórtex, facilitando a solubilização. Isso pode levar até dois dias.Uma vez solubilizado, centrifugue a amostra a 16.000 Gs por dois a três minutos. Quando a proteína estiver em solução, é chamada de dope em rotação. A solução será incrivelmente viscosa.Certifique-se de que não há agregados presentes, pois eles podem entupir a seringa. Na próxima etapa, carregue cuidadosamente pelo menos 25 microlitros da solução de fiação em uma seringa Hamilton Gast tight, equipada com uma agulha de 127 micrômetros de diâmetro interno, segurando a seringa com a agulha voltada para cima para pressionar o êmbolo. Para remover quaisquer bolhas de ar, é muito importante eliminar as bolhas de ar, pois elas causarão inconsistências na fibra.Em seguida, fixe a seringa em um aparelho Harvard, bomba de seringa 11 plus. Coloque um béquer de 400 mililitros contendo isopropanol a 95% sobre um suporte móvel de forma que a ponta da seringa rompa levemente a superfície do álcool. Ajuste a bomba de seringa para 15 microlitros por minuto e pressione iniciar.A extrusão da fibra deve levar cerca de um a dois minutos, dependendo do volume inicial da solução de fiação. Após toda a solução ter sido transformada em fibra, deixe a fibra em repouso no isopropanol por 20 minutos para que atinja plenamente o equilíbrio.Em seguida, a amostra é coletada usando um dispositivo de enrolamento. O dispositivo de enrolamento utilizado aqui foi criado colando pentes metálicos em um paquímetro digital. Conforme mostrado nesta imagem, aplique fita adesiva dupla face em ambos os lados do pente no dispositivo de enrolamento.Em seguida, fixe o dispositivo de enrolamento a um motor. Ajuste o motor para enrolar os fios a duas RPM. Depois, usando uma pinça, segure suavemente uma das extremidades da fibra e puxe-a lentamente do isopropanol.Fixe-o na borda de um dos braços do pente no carretel. Usando a fita dupla face, realize os próximos passos sem interrupção para evitar que as fibras sequem. Ligue o motor e use uma haste de vidro para guiar suavemente a fibra para o dispositivo de enrolamento.Não permita que a fibra se dobre e empilhe. A fita dupla face deve impedir que toda a fibra escorregue e permite o alongamento seletivo dos segmentos internos das fibras dentro dos braços do paquímetro.Uma vez que toda a fibra esteja enrolada, desacople o carretel do motor e aplique cola na borda de cada fibra de seda na fita dupla face. Isso fixa a seda de aranha no aparelho. Conecte o carretel ao atuador linear para realizar a tração pós-fiação.Determine o comprimento inicial das fibras utilizando o C. Este é o comprimento interno da fibra. Ele não inclui o comprimento colado e enrolado ao redor do carretel. Mergulhe o carretel em um banho de isopropanol a 75%.Deixe as fibras equilibrarem por 10 minutos. Ajuste a velocidade do atuador linear para 1,5 milímetro por segundo. Com base no comprimento inicial, calcule o comprimento final para a razão de estiramento desejada após o bin.A quantidade de alongamento pode ser controlada com base na velocidade ou no comprimento, dependendo da configuração. Por exemplo, com um comprimento inicial de 15 milímetros e uma razão de alongamento desejada de três x, o comprimento final deve ser de 45 milímetros. Isso também pode ser calculado como acionar o atuador linear por 20 segundos a uma taxa de 1,5 milímetro por segundo.Segundo, uma vez concluída a retirada do pós-binário, levante lentamente o carretel do isopropanol. Aguarde a evaporação das gotículas de isopropanol por um minuto para coletar as amostras. Primeiro, corte uma extremidade da fibra enquanto segura a outra extremidade com pinças.Corte essa extremidade e monte a fibra em molduras de cartolina ou folha metálica para fins de teste. Se forem desejadas relações de estiramento adicionais após o banho, abaixe novamente o carretel na banheira com 75% de isopropanol. Deixe as fibras equilibrarem por 10 minutos e, em seguida, prossiga para o próximo banho pós-estiramento.Proporção de estiramento. Registre a umidade e a temperatura, que podem afetar as fibras. Propriedades mecânicas.Deixe as amostras coletadas equilibrarem-se com o ambiente padrão do laboratório. Umidade de 40% e 25 graus Celsius são ideais por pelo menos uma hora antes do ensaio mecânico. Com a fibra montada na moldura de cartolina, aplique cola super forte nas bordas da cartolina ou do papel alumínio para fixar a fibra na moldura.Observe o tamanho da abertura da moldura. Este é o comprimento inicial da fibra testada. Uma moldura com abertura de uma polegada é mostrada aqui utilizando um microscópio óptico com aumento de 100 x ou superior para obter medidas de diâmetro ao longo do eixo longitudinal da fibra.Devem ser registradas pelo menos três medições. Quanto maior a ampliação utilizada e o número de medições realizadas, melhor será a precisão. Fixe o quadro de cartolina em um quadro mecânico de carga tipo estirador.Em seguida, corte o quadro em ambos os lados para que a tensão passe apenas pela fibra. Rompa o tênsil e colete os dados. Recomenda-se uma taxa de deformação padrão de 2% por segundo.O procedimento de coleta de dados mecânicos pode variar dependendo da marca do estirador utilizado nos estudos. Com os dados coletados sobre o diâmetro médio, pode-se traçar uma curva tensão-deformação no Microsoft Excel. A fibra rompida pode agora ser montada em um microscópio eletrônico de varredura, Stu, para análise morfológica e medições do diâmetro no ponto de ruptura.O segmento da fibra distante do ponto de ruptura pode ser usado para estimar e verificar o diâmetro inicial medido pelo microscópio óptico. A proteína da seda de aranha MASP1 foi expressa e purificada a partir de bactérias para determinar a pureza da proteína antes da produção da fibra; as proteínas foram submetidas à fracionamento por tamanho. Utilizando análise por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS, seguida de visualização com coloração por prata, conforme mostrado aqui, as seis soluções revelam que a maior parte da amostra é eluída nas primeiras quatro frações.A proteína de seda de aranha TUSP1 também foi produzida de acordo com o protocolo apresentado aqui e transformada em fibras para determinar as propriedades mecânicas das sedas sintéticas em forma tubular. As fibras foram fiadas e submetidas a razões crescentes de pós-estiramento. As cores nesta imagem mostram fibras que foram submetidas a diferentes razões de pós-estiramento, variando de 2,5× a 6×. As fibras exibem baixa variação dentro de cada grupo de razão.À medida que as razões de puxador aumentam, a resistência da fibra aumenta, enquanto a extensibilidade diminui. No entanto, as fibras exibiram níveis equivalentes de tenacidade para avaliar a ultraestrutura das fibras por microscopia eletrônica de varredura; imagens de fibras produzidas a partir de proteínas recombinantes tsp1 foram obtidas, como pode ser visto aqui. A superfície externa lisa pode ser observada com ampliação de 500 x e 5.000 x.O núcleo interno denso pode ser observado a partir de uma ruptura natural da fibra. Isso sugere que as proteínas recombinantes estão se montando e empacotando adequadamente durante o processo de extrusão. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 10 dias, se executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante remover todo o sal da proteína recombinante purificada antes da etapa de liofilização e também garantir que a concentração correta da solução espinnable seja utilizada para evitar o entupimento da agulha durante o processo de extrusão. Após o desenvolvimento, outras fibroínas, como mes, P one TUSB one e P ysb one, podem ser transformadas em fibras individuais ou como compósitos, a fim de produzir uma ampla gama de biomateriais. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de bioengenharia e ciência dos materiais explorassem o uso de sedas sintéticas de aranha em aplicações com implicações nas áreas médica militar, artística, atlética e automotiva.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão melhor de como produzir fibras de seda sintéticas ou materiais compostos utilizando proteínas purificadas de bactérias. Não se esqueça de que trabalhar com AFib pode ser extremamente perigoso e que precauções, como trabalhar sob uma capela de exaustão, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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