Name: Purificação Citometria de Fluxo com base em S. cerevisiae Zigotos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 9 s
Description: Aprenda a purificar zigotos de levedura Saccharomyces cerevisiae usando citometria de fluxo em dois passos. Este método alcança cerca de 90% de pureza, permitindo estudos detalhados sobre biologia de zigotos e transição haploide-diploide em células eucarióticas.

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Agradecemos ao Dr. Michael R. Sramkoski ajuda com citometria de fluxo, Purnima Dr. Jaiswal e Di Dr. Wu para início de entrada e Aylyarov Ilya ajuda com as ilustrações. Suportado pelo NIH Grant R01GM089872 e Citometria &amp; Imaging Core Facility Microscopia do Caso Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).

1. Crescimento Celular haplóide <ol><li> Crescer S. células de Saccharomyces do fundo S288C (BY4741) sob condições padrão 10. </li><li> Transformar haplóides para expressar qualquer uma das duas notáveis ​​marcadores fluorescentes 10. Os marcadores de escolha são GFP solúvel expressa no citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado com BglII 11) e uma única proteína ribossomal, RPL25, fundido com mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, a partir de A. Johnston). Prevemos que os protocolos equivalentes de duas cores de purificação pode fazer uso de outras proteínas fluorescentes brilhantes que são sintetizadas pelas células haplóides paternos. Em alternativa, a parede celular pode ser rotulado com lectinas fluorescentes. </li><li> No dia anterior ao do zigoto purificação, inocular 5 ml de culturas de cada tipo de célula e crescê-los com agitação durante a noite a 23 ° C até atingir A600 não superior a 1,0. Crescer transformantes GFP (ATY4442) em meio sintético completo incluindo 2% de glicose (CSM-glucose) umnd RPL25-mCherry transformantes (ATY4552) em meio selectivo sintético sem uracilo 10. Manter culturas paralelas de cada tipo de célula com agitação, à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Realização de uma Cruz <ol><li> Ajustar a densidade óptica (A600) de cada amostra para 1,0 em meio fresco. [1 Unidade Densidade Óptica ~ 3 x 10 7 células / ml] </li><li> Mistura de volumes iguais de ambas as culturas, vortex brevemente três vezes, seguido por um tempo de vórtice durante 10 seg. </li><li> Prepare CSM glicose placas. As placas são idênticos aos utilizados para o crescimento de rotina e foram secas 45 minutos após o vazamento e a solidificação do agar 10. </li><li> Distribuir até vinte gotas de 40 ml da mistura a 1 centímetro a partir do bordo da superfície de CSM-glucose placas. Quando as gotas são inicialmente aplicada à superfície de iniciar o temporizador para medir o tempo decorrido. Uma vez que o líquido ter sido absorvido (cerca de 30 min), cobrir as placas e deixar intacta a rooTemperatura m. </li></ol> 3. Preparações de colheita <ol><li> Colheita de amostras após 1,75-2,5 hr a 23 ° C por lavagem repetidamente individuais gotículas secas ao lado da placa com 150 ml de glucose-CSM frio, mantendo-se as placas em gelo. Repetidamente lavar a área de gotículas 10-20 vezes com o mesmo meio para maximizar a recuperação. Recolher em tubos de 15 ml Falcon em gelo. </li><li> Sondar sonicar as amostras 10x em amplitude de 60% com um sonicador Fisher FB120 (120watt, 120Volt, Freq 20KHz) em gelo. </li><li> Verificar em um microscópio de fase que poucos ou nenhuns agregados permanecem. 15-50% das células espera-se que se formaram zigotos neste ponto. </li><li> Deixar o tubo de células numa posição vertical em repouso sobre gelo durante 10 minutos, como medida de precaução adicional (para permitir que os agregados se estabelecer). </li><li> Recuperar os 90% mais alto do volume e filtrá-la através de uma malha de nylon (BD Falcon tubo de polipropileno com filtro tampa (Ref. 352235)). Numa experiência típica, 10 7 célulasrecuperado a partir de uma placa foram neste ponto diluídos em 4 mL de CSM-glucose. </li></ol> 4. Citometria de Fluxo <ol><li> Ordenar células usando o Sony Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo, (altamente automatizado Ordenar Paralela) HAPS1 com uma ponta mícron 100. Para a excitação da GFP, use o azul argônio-ion, 250 miliwatts de laser a 488 nm. Para excitação mCherry, use o laser de 100 miliwatts a 561 nm. Apesar de não ter experiência com outras máquinas, esperamos que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx ou Beckman Coulter MoFlo XDP ficaria bem quando equipado com os lasers corretas. </li><li> Base de dados de parâmetros de classificação em um gráfico de dispersão para a frente contra volta, a fim de porta em células viáveis. Estabelecer um plano de emissão de 615 + / - 30 nm filtro passa-banda (mCherry) versus 525 + / - 25 nm filtro passa-banda (GFP) para dividir os eventos em quatro quadrantes, &quot;Red + Verde&quot;, &quot;Vermelho + Verde +&quot;, &quot;Red- Verde-&quot;e&quot; + Red-Green &quot;(Figura S2). Utilização de células não fluorescente como um padrão fou determinação do &quot;vermelho-verde&quot; quadrante. </li><li> Ordenar as células com uma pressão de 21,5 psi bainha, uma frequência de 43.400 gota gotas / seg, e uma pressão da amostra de 20,5 psi. </li><li> Ordenar inicial (&quot;modo de recuperação&quot;): Recolha de amostras em tubos refrigerados Eppendorf contendo 250 ml de frio CSM-glicose. Sedimento 10 seg a velocidade máxima numa microcentrífuga refrigerada (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) e aspirar a solução de fluxo (fluxo de solução de revestimento de citometria (PBS com EDTA 1 mM) Catalog No. BioSure 1027). Ressuspender em 500 ml frio CSM-glucose. </li><li> Ordenar segundo (&quot;Modo de Pureza&quot;): Conduzir a espécie como para a classificação inicial, usando a &quot;pureza&quot; modo opção. O sedimento. Purificada células e ressuspender as pastilhas em 500 ml e 1,0 ml de glucose-CSM Agitar durante 15 minutos em placas de 24 poços a 23 ° C para permitir a recuperação metabólica. </li></ol> 5. Microscopia DeltaVision <ol><li> Preparar almofadas de agarose, como se segue: Leve uma suspensão de agarose 1,5% (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) em CSM-glucose a ferver, de forma breve vórtice, e depois aplicar 0,3 ml de amostras da solução de agarose para a superfície de lâminas de vidro horizontais normais e cobri-los de uma só vez com uma segunda corrediça (sem a aplicação de pressão). </li><li> Depois de arrefecimento durante 10 minutos, remover suavemente a corrediça superior, deslizando-a na horizontal, tendo o cuidado de deixar uma superfície lisa e não perturbar a camada de agarose. (Quando a lâmina superior tenha sido removido, a amostra de células deve ser aplicado dentro de 1-2 min. Quando mantido numa câmara húmida à temperatura ambiente, sem a remoção da lâmina superior, as almofadas podem ser armazenados durante até um dia antes do uso.) </li><li> Amostras de sedimentos e depósitos alíquotas de 1 ml da pelota em almofadas de agarose (sem tocar na superfície). Cobrir imediatamente a amostra com um quadrado No. 1 lamela. Aparar agarose excesso com uma lâmina de barbear única gumes. Selar as preparações com vaselina dispensados ​​a partir de uma seringa. </li><li> Imagem usando Deltavision (Applied Precision) com um objetivo 100x óleo de imersão sem binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5). </li><li> Deconvolve z pilhas usando o programa softWoRx 5.0.0 ( <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp</a> ) e processar minimamente. Sucessivas z-aviões eram geralmente coletados em intervalos de 0,2-0,4 mícron. </li></ol> 6. Resultados representativos Os níveis de intensidade de fluorescência em células haplóides transformadas: O nível de fluorescência nas haplóides é ilustrado na Figura S1. Antes da inquirição, epifluorescência demonstrado que essencialmente todas as transformantes GFP estavam verdes, e que todas as transformantes mCherry, embora muitas vezes fraca, estavam vermelhos. Para assegurar que todas as células utilizadas para a cruz eram realmente fluorescente, foi utilizada a sub-população mais brilhantes com o sinal fluorescente. Rendimento: Aepois de a classificação inicial, a amostra verde vermelho + + (Figura S2) inclui tipicamente 8-20% do número de células de entrada e um número excessivo de células haplóides, talvez devido à adesão célula-célula persistente. Uma vez que o enriquecimento de alta não é conseguido com uma única espécie, a amostra parcialmente purificada deve ser duas vezes a sonda de ultra-sons 60% de amplitude seguido por re-ordenação. (Tipo de recuperação duram tipicamente entre 1-2 horas, enquanto que o segundo tipo requer apenas 15 min.) Das células submetidas ao segundo tipo, os vermelho + verde + amostras incluíram 23-52% das células de entrada. Exame microscópico fase: Exame por microscopia de contraste de fase revelou que a pureza da preparação final, zigoto em média cerca de 90% ao longo de 21 preparações (variando de 86% a 91%). Os contaminantes ou eram haplóides verde ou vermelha, ou pares de haplóides que estavam em contacto uns com os outros. Figura 3 tabula a percentagem de zigotos que têmnão broto, brotos medial (Med), brotos laterais (Lat) ou botões terminais (Term), o número de haplóides emparelhados da mesma cor (&quot;2Same&quot;) ou de cor diferente (&quot;2Hap&quot;), bem como individuais (haplóides Hap). Quando as células foram colhidas após 1,75 hr, mais do que 50% foram não gemuladas e as outras subcategorias (medial, com gemas laterais ou terminais) foram igualmente representados. Depois de 2,5 horas, havia aproximadamente números iguais de zigotos em cada uma das quatro categorias (não gemuladas, com medial, gomos laterais ou terminais). As observações microscópicas (Figura 4): A estrutura de zigotos parece permanecer inalterado durante a purificação. De acordo com a duração da cruz, a população tinha diferentes proporções de zigotos e não gemuladas enxertada, como explicado acima. Uma vez que ambos os haplóides verdes e vermelhos mostrou uma variação considerável na intensidade do sinal fluorescente, alguns zigotos foram predominantemente vermelha, enquanto os outros foram predominantemente verde, como é observado por Comparing as imagens de uma só cor para as imagens combinadas na Figura 4. Note-se também que a GFP (MW 26kDa) entra no núcleo e pode ser encontrado no núcleo, mesmo quando os núcleos não se fundiram. Vacúolos destacam-se como negros não fluorescentes esferas. O produto final de purificação produz uma população diversa em diferentes fases de desenvolvimento. Zigotos rotulado Uma fusão não tenham sofrido. Zigotos Tipo B são não gemuladas. Tipo C tem um pequeno broto. Tipo D têm uma maior broto, e zigotos Tipo E está prestes a passar por citocinese. Note-se também que muitos dos zigotos anteriores continuam a mostrar um não-fluorescente linha de divisão medial (*), e que a &quot;estrutura de herança&quot; vacuolar (I) 12 podem ser vistos a estender a partir do zigoto para a raiz. Em alguns casos, o sinal verde foi redistribuído para o parceiro de uma extensão muito maior do que o sinal vermelho. Isto reflecte o atraso de transferência, que é característica de polissomas (Tartakoff, em preparação). 6 zigotos, o que é suficiente para muitas imunotransferência, utilizando os procedimentos de detecção quimioluminescente. Usando protocolos de fenol-clorofórmio isolamento extraímos cerca de 1,5 mg de RNA a partir deste número de células. Uma vez que os zigotos purificadas ter sido refrigerada, antes de análise adicional é recomendável a incubação a 23 ° C em meio de crescimento. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> Figura 1. Cronologia da formação do zigoto. Zigotos como um intermediário entre haplóides e diplóides. Este diagrama mostra a activação clássica (shmooing) de haplóides, a sua fusão e a formação da gema inicial. Gemas podem ser tanto medial (M), lateral (L) ou do terminal (T). <imgalt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg /&quot; /&gt; Figura 2. Esquemática do protocolo de purificação do zigoto. Após a incubação sobre a superfície de placas de agar, em meio completo com glucose, a mistura de células foi recuperado por lavagem e, em seguida, submetido a uma classificação inicial no &quot;modo de recuperação&quot;, seguido de um segundo tipo em &quot;modo de pureza. &quot; A cor amarela indica que tanto mCherry e sinais de GFP foram visíveis nos zigotos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> Figura 3. Variedades de zigotos nas misturas de acasalamento purificadas frações. Foram colhidas após 1,75 ou 2,5 horas para recuperar frações enriquecidas em zigotos relativamente precoces vs relativamente mais maduro. Oito experimentos independentes, designados pelas cores distintas, foram realizadas para cada ponto de tempo. Os gráficos indicam os números relativos de zigotos que have espacialmente padrões distintos de formação de gemas. Dada a curta duração da incubação (menos de 2,5 h à temperatura ambiente) os botões são observados eventos iniciais zigóticos de brotamento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> Figura 4. DeltaVision exame das fracções enriquecidas. Um campo típico foi examinada por microscopia Deltavision. As ilustrações mostram ou cores vermelhas e verde ou único. O vermelho corresponde à etiqueta polissomal (Rpl25p-mCherry) e o verde para GFP citosólica. Note-se a elevada enriquecimento de zigotos, e as características designadas subcelulares: os vacúolos (v), de botões (b), o núcleo (n), vacuolar &quot;estrutura de herança&quot; (i), e a divisória (*) que aparece para separar o parental domínios em zigotos relativamente cedo. A sua cor variável global reflecte a intensidade relativa dos haplóides que se fundiram. Nos casos em que os dois domínios retêm parentaisuma cor distinta, o equilíbrio dos marcadores (GFP citoplasmática, mCherry marcadas polissomas) estava incompleta. Time-lapse estudos em curso mostram que redistribui GFP solúveis antes polissomos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Legends suplementares <img alt="Figura S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> S1 figura. Fluorescência de células haplóides Extrema esquerda:. Células expressando polissomas mCherry-marcadas foram examinadas para detectar um sinal verde. A janela rectangular foi ajustado para evitar que as células negativas. Gráfico Médio: Células expressando GFP citosólica foram analisados, mostrando a população distintamente brilhante importante de aspectos positivos. Extrema direita: Células expressando polissomos mCherry-marcadas foram analisadas. O rectângulo (idêntico ao do extremo esquerdo) inclui as células brilhantes e permite que todosnegativos devem ser evitados. A designação &quot;R2&quot; indica a percentagem de células recuperadas no interior do rectângulo indicado. <img alt="Figura S2" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> Figura S2. Distribuição das células na primeira e segunda classificação. Estes gráficos de duas cores indicam a proporção de verde + vermelho + células no quadrante superior direito (R5). Essa proporção aumenta para 52% no segundo tipo. Eixo horizontal: sinal verde. Eixo vertical: sinal vermelho.

<ol><li>Herskowitz, I., Oshima, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerskowitz%2C+I+%22Control+of+cell+type+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Mating+type+and+mating-type+interconversion%22">Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion</a>. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).</li>
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<li>Weisman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelles+on+the+move%3A+insights+from+yeast+vacuole+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A disponibilidade de zigotos purificadas deve facilitar estudos bioquímicos incluindo transcriptômica, proteômica e lipidómica, bem como de investigação de mecanismos pelos quais se submetem zigotos ciclo celular re-entrada, remodelamento da parede celular, características de brotamento e de herança, etc Alternativamente, os zigotos podem ser gerados a partir com estirpes de portadores de mutações características em um ou ambos os pais. Além disso, os zigotos purificados, assim como para células haplóides ou diplóides, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Equipamento </td><td> Fonte </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, codificando GFP citoplasmática 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, codificação RPL25 fundido a mCherry </td><td> A. Johnston </td><td></td></tr><tr><td> Fisher sonicador FB120 </td><td> Fisher Scientific </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de polipropileno com filtro tampa </td><td> BD Falcon </td><td> Ref 352235 </td></tr><tr><td> Microcentrífuga refrigerada </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> Fluxo da solução bainha citometria </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo </td><td> Sony </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision microscópio deconvolução </td><td> P aplicadorecision </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de epifluorescência ereta </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> Formulação de glucose CSM Notas: Para placas de agar, simplesmente incluir 2% de agar (Difco) </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

purificação citometria de fluxo com base em<em&gt; s. cerevisiae</em&gt; zigotos

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zigotos são intermediários essenciais entre haplóides e diplóides estados do ciclo de vida de muitos organismos, incluindo levedura (Figura 1) 1. S. cerevisiae zigotos resultado a partir da fusão de células haplóides de tipo de acasalamento diferente (MATa, MATalpha) e dar origem aos correspondentes diplóides estáveis ​​que geram sucessivamente até 20 descendentes diplóides, como resultado das suas divisões mitóticas notavelmente assimétricas 2. Formação do zigoto é orquestrado por uma sequência complexa de eventos: Neste processo, os factores de acasalamento solúveis se ligam a receptores de cognato, desencadeando mediados por receptores cascatas de sinalização que facilitam a interrupção do ciclo celular e culmina na fusão célula-célula. Zigotos podem ser considerados um modelo para progenitor ou a função das células estaminais. Embora muito se aprendeu sobre a formação de zigotos e, apesar de zigotos foram utilizados para investigar células-moleculares questões de interesse geral significance, quase todos os estudos fizeram uso de misturas de acasalamento em que os zigotos estão misturadas com uma população de maioria de células haplóides 3-8. Muitos aspectos da bioquímica da formação do zigoto ea vida continua do zigoto, portanto, permanecem sem investigação. Relatos de purificação de zigotos levedura descrevem protocolos baseados nas suas propriedades de sedimentação 9, no entanto, este procedimento de sedimentação baseada não produziram cerca de 90% de pureza em nossas mãos. Além disso, ele tem a desvantagem de que as células são expostas ao sorbitol hipertónica. Por conseguinte, desenvolveram um processo de purificação versátil. Para este propósito, os pares de células haplóides que expressam proteínas de vermelho ou verde fluorescentes foram co-incubadas para permitir a formação do zigoto, colhidas a vários tempos e os zigotos resultantes foram purificadas utilizando um protocolo de triagem de citometria de fluxo com base. Esta técnica fornece uma avaliação visual conveniente de pureza e de maturação. A pureza médiada fracção é de cerca de 90%. De acordo com o tempo de colheita, os zigotos de diferentes graus de maturidade podem ser recuperados. As amostras purificadas fornecer um conveniente ponto de partida para &quot;-OMIC&quot; estudos, para a recuperação da progênie inicial, e para a investigação sistemática desta célula progenitora.

Para purificar de zigotos<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, Células haplóides do tipo de acasalamento oposto foram projetados para expressar vermelho ou verde proteínas fluorescentes, co-incubados, para permitir a formação do zigoto, e fracionado em um fluxo de protocolo de citometria de base. A fração altamente enriquecido permite posterior &quot;-mico&quot; estudos de recuperação, de progênie inicial, e investigação sistemática da morfogênese zigoto.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zigotos são intermediários essenciais entre os estados haploide e diploide no ciclo de vida de muitos organismos, incluindo leveduras (Figura 1) 1. S. cerevisiae ...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar uma população purificada de zigotos de levedura. Isso é alcançado primeiramente pela expressão de zonas polares marcadas com GFP citoplasmático ou M cherry. Em células haploides de tipos de acasalamento opostos, as células são cultivadas até a fase logarítmica, depois combinadas e co-incubadas para permitir a formação de zigotos.A mistura de cruzamento é então colhida e separada por citometria de fluxo no modo de recuperação para isolar células duplamente positivas para vermelho e verde. Esta subpopulação inclui tanto entidades pré-zigóticas quanto zigóticas. Para purificar ainda mais a amostra, a população duplamente positiva para vermelho e verde é submetida a uma segunda rodada de separação por citometria de fluxo.Utilizando o modo de pureza. Este procedimento resulta em uma pureza média de 90% de zigotos com base na análise visual e na quantificação das células por microscopia fluorescente. As vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes, como a purificação baseada em sedimentação, são as seguintes.Primeiro, esta técnica fornece uma avaliação visual conveniente da pureza e maturação do zigoto. Segundo, em nossas mãos, a pureza média da fração zigótica é de aproximadamente 90%, muito maior do que a de outros métodos existentes. Nosso método de purificação pode ajudar a responder perguntas biológicas fundamentais sobre a transição haploide para diploide em células eucarióticas em nível molecular, pois existe uma considerável conservação entre eucariotos inferiores e superiores.Portanto, o estudo de zigotos de levedura deve promover uma compreensão geral da biologia do zigoto. Argumenta-se que os zigotos também podem ser considerados um modelo para a função de células progenitoras ou células-tronco. Cresça s. cerevisiae, VCA, Matt A e Matt alpha BY4741. Isole células estriando alíquotas congeladas de levedura em meio de crescimento sólido com ágar e incube as placas à temperatura ambiente ou a 30 graus Celsius até a formação de colônias, no dia anterior à purificação dos zigotos. Rotule dois tubos cónicos de 50 mililitros para o cultivo de tablóides transformados como GFP solúvel e RPL25-M.Cherry. Inocule um cultivo com tablóides transformados expressando GFP solúvel no citoplasma e outro com tablóides transformados expressando uma única proteína ribossômica.RPL 25 fundido com m-cherry. Incube as culturas com agitação durante a noite a 23 graus Celsius para atingir uma A 600 não superior a 1,0. Em seguida, para realizar um cruzamento, comece ajustando a densidade óptica de cada amostra para 1,0 em meio fresco, aproximadamente equivalente a três vezes 10 elevado à sétima células por mililitro.Em seguida, misture volumes iguais das duas culturas em meio fresco, em um tubo cônico de 50 mililitros. Agite brevemente três vezes em vórtex, depois agite por 10 segundos em vórtex. Em seguida, posicione a ponta de uma pipeta um centímetro acima da superfície de uma sala.Placa de glicose CSM a temperatura ambiente. Inicie um cronômetro para contagem regressiva de 30 minutos e distribua imediatamente gotas de 40 microlitros das culturas mistas ao longo da periferia da placa, cobrindo a circunferência. Deixe as placas secarem na bancada com a tampa removida por cerca de 30 minutos.Uma vez que o líquido tenha sido absorvido, cubra as placas e deixe-as em repouso, sem perturbar, à temperatura ambiente por 1,75 a 2,5 horas. O processo de crescimento polarizado cria a morfologia característica semelhante a um schmo. Durante a fase schmo, as duas células haid continuam a crescer em direção uma à outra até alcançar o contato célula-célula.A fusão subsequente das células resulta na formação do zigoto. O zigoto recém-formado então reinicia o ciclo celular mitótico, originando seu primeiro broto diplóide. Após a incubação, coloque as placas sobre gelo e colete as amostras lavando as áreas individuais das gotas secas de 10 a 20 vezes com 150 microlitros de glicose CSM fria.Colete a solução de lavagem em tubos cónicos de 15 mililitros sobre gelo. Em seguida, mantendo as amostras sobre gelo, sonique cada um dos tubos com sonda 10 vezes a 60% de amplitude. Após a sonicação, verifique em um microscópio de contraste de fase que poucos ou nenhum agregado permanece; espera-se que 15 a 50% das células tenham formado zigotos. Neste momento, deixe o tubo de células em posição vertical, sem perturbação sobre gelo, durante 10 minutos como precaução para permitir que quaisquer agregados remanescentes sedimentem.Recupere os 90% superiores do volume e filtre através de um tubo de polipropileno com malha de náilon e tampa com peneira. Em um experimento típico, recupera-se 10 elevado à sétima células de uma placa e quatro mililitros de CSM. A separação celular por glicose é realizada usando um citômetro de fluxo modelo Sony Eyesight Reflection com HAPS um com ponteira de 100 mícrons.Inicie selecionando os lasers de excitação no software win list 3D para excitação de GFP. Utilize o laser azul de íon Argonne de 500 miliwatts em 488 nanômetros para excitação de M cherry. Utilize o laser de 100 miliwatts em 561 nanômetros no software de controle HAPS.Certifique-se de que o modo de recuperação esteja selecionado e que a pressão da camisa para separação esteja definida em 21,5 libras por polegada quadrada, com uma frequência de gotas de 43.400 gotas por segundo e uma pressão de amostra de 20,5 libras por polegada quadrada. Baseie os parâmetros de separação em um gráfico de dispersão direta versus dispersão traseira para selecionar as células viáveis. Observe que o equipamento Sony Iysight utilizado aqui indica exclusivamente o gráfico de dispersão lateral como dispersão traseira, mas essa dispersão traseira é funcionalmente equivalente à dispersão lateral. Estabeleça um gráfico de emissão de M cherry versus GFP para dividir os eventos em quatro quadrantes.Vermelho positivo, verde positivo, vermelho negativo, verde negativo, vermelho positivo verde positivo, vermelho negativo verde negativo e vermelho negativo verde positivo. Utilize células não fluorescentes como padrão para a determinação do quadrante vermelho negativo verde negativo. Para a separação inicial.Selecione o modo de recuperação e colete as amostras em tubos de microcentrifugação refrigerados contendo 250 mililitros de glicose CSM fria. Após a coleta, sedimente as células por 10 segundos na velocidade máxima em uma microcentrífuga refrigerada. Após a centrifugação, aspire a solução sobrenadante e re-suspenda-as em 500 microlitros de glicose CSM fria.Como o alto enriquecimento não é alcançado com uma única ordenação, sonda brevemente e sonique a amostra parcialmente purificada duas vezes em 60% de amplitude. Ordene as células novamente, desta vez utilizando a opção de modo de pureza com o gate em células viáveis e estabeleça um gráfico de emissão de M cherry versus GFP no sedimento, nas células purificadas e re-suspenda os pellets em 0,5 a 1,0 mililitros de CSM com glicose. Após a centrifugação, transfira 0,5 mililitros para cada um dos poços de placas de 24 poços e então agite as células por 15 minutos.Em placas de 24 poços a 23 graus Celsius para permitir a recuperação metabólica. Para preparar os suportes de ágar, aqueça até fervura uma suspensão de 1,5% de ágar em glicose CSM em um tubo cônico de 15 mililitros. Vortexe a solução brevemente e, em seguida, aplique amostras de 0,3 mililitro da solução de ágar sobre a superfície de pelo menos dois a três lâminas de vidro padrão, cobrindo imediatamente as lâminas com uma segunda lâmina.Não aplique pressão. Deixe as lâminas esfriarem por 10 minutos. Se os suportes aros não forem usados imediatamente, coloque-os em uma câmara umidificada à temperatura ambiente sem remover a lâmina superior.Estes podem ser armazenados por até um dia. Em seguida, remova cuidadosamente a lâmina superior deslizando-a horizontalmente. Tendo o cuidado de deixar uma superfície lisa e de não perturbar a camada de aros, deposite rapidamente, dentro de um a dois minutos, alíquotas de um microlitro de células sedimentadas sobre os suportes de aros sem tocar a superfície.Cubra imediatamente a amostra com uma lamínula quadrada e, com uma lâmina de bisturi de corte único, retire o excesso de agarose. Use uma seringa para aplicar vaselina ao longo das bordas da lamínula. Capture imagens usando o sistema Delta Vision com uma objetiva de imersão em óleo de 100x, sem binning. Um campo ideal é aquele que mostra uma única camada de células com espaço suficiente entre elas para distinguir células individuais. Adquira imagens com intervalos de 0,2 a 0,4 mícrons. Assim que a aquisição de imagens for concluída.Devolveu-se Zacks utilizando o programa e processo soft works 5.0 0.0 com deconvolução padrão mínima de 20 ciclos. Ajustou-se a intensidade da fluorescência vermelha em relação à verde para minimizar qualquer sinal de fundo nas imagens DeVol, a fim de avaliar a expressão de proteínas fluorescentes nas células transformadas. As células foram analisadas por citometria de fluxo antes e depois de realizar um cruzamento, anteriormente ao cruzamento. Essencialmente, todos os transformantes M cherry foram vermelhos e todos os transformantes GFP foram verdes.Observe que, embora o sinal de M cherry fosse menos intenso que o sinal de GFP, ele foi detectado tanto por citometria quanto por microscopia de fluorescência. As células foram classificadas e as células mais brilhantes, que aparecem no quadrante R dois, foram selecionadas e cultivadas com a transformação GFP por 2,5 horas, como pode ser visto aqui. A amostra positiva para vermelho e verde representou 8,89% da população total após o cruzamento.Isso foi enriquecido para 52,4% após a primeira classificação de recuperação, sendo posteriormente mais enriquecido com a segunda classificação de pureza, quando 21 preparações semelhantes de células vermelhas positivas e verdes positivas foram examinadas por microscopia de contraste de fase. Para avaliar o número de zigotos, a pureza média foi de 90%. Os contaminantes eram haploides verdes ou vermelhos, ou pares de haploides em contato, para determinar a cinética do surgimento inicial do broto zigótico, bem como a incidência e distribuição das localizações medial, lateral e terminal dos brotos zigóticos. Os haploides foram cruzados por 1,75 horas ou 2,5 horas, classificados por citometria de fluxo e então examinados por microscopia epifluorescente.Quando as células foram colhidas após 1,75 horas, mais de 50% estavam sem botões e com posição mediana. Botões laterais ou terminais foram igualmente representados após 2,5 horas. No entanto, havia aproximadamente números iguais de zigotos em cada uma das quatro categorias: sem botões com posição mediana, lateral ou terminal.A estrutura dos zigotos parece permanecer inalterada durante a purificação. Observe que a GFP entra no núcleo e pode ser encontrada no interior do núcleo mesmo quando os núcleos ainda não se fundiram. As ES se destacam como esferas pretas não fluorescentes.O produto final da purificação resulta em uma população diversa em vários estágios de desenvolvimento. Os zigotos rotulados como A não passaram pela fusão. Os zigotos do tipo B não são fecundados.Os do tipo C possuem um broto pequeno, os do tipo D têm um broto maior e os zigotos do tipo E estão prestes a sofrer citocinese; observe também que muitos dos zigotos mais precoces ainda exibem uma linha de divisão medial não fluorescente e que a estrutura de herança valar frequentemente pode ser vista estendendo-se do zigoto para o broto. Ao realizar este procedimento, é importante incluir tanto a classificação de recuperação quanto a classificação subsequente de pureza. Descobrimos que a segunda classificação é fundamental para aumentar a pureza zigótica do produto final.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um cruzamento, gerar zigotos purificados por citometria de fluxo, avaliar a pureza por métodos microscópicos e como montar e fotografar zigotos utilizando microscopia de desconvolução com fluorescência.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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