Name: Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda uma técnica cirúrgica para injeção intratraqueal em fetos de camundongo Mus musculus, permitindo entrega eficiente de agentes bioativos aos pulmões fetais sem diluição no fluido amniótico.

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MC e AVDP são bolsistas de doutorado suportados por verbas do Instituto para a Promoção da Inovação através da Ciência e da Tecnologia na Flandres (IWT-Vlaanderen). JT mantém um part-time Bolsa de Investigação Clínica (Koor) da UZ Leuven. DV é um doutorado apoiado por uma subvenção da KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC é um doutorado apoiado por uma concessão do Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) e Erasmus Mundus. A pesquisa foi financiada pela navegação fluvial-Vlaanderen, pela concessão CE DIMI (LSHB-CT-2005-512146) e pelo In vivo Molecular Imaging Research grupo (IMIR) da KU Leuven. Gostaríamos de agradecer o Núcleo Vector UPenn fundada por James M. Wilson para seu presente tipo da embalagem AAV6.2 plasmídeo para rAAV produção vetor.

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<li>Senoo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+in+utero+gene+transfer+in+mice+and+guinea+pigs%3A+tissue+distribution+of+recombinant+adenovirus+determined+by+quantitative+TaqMan-polymerase+chain+reaction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Metab%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay.</a> Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).</li>
<li>Carlon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+mouse+lung+by+fetal+intratracheal+injection+of+rAAV2%2F6.2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2.</a> Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).</li>
<li>Schmiedl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+injury+is+more+pronounced+in+fetal+transgenic+ErbB4-deleted+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).</li>
<li>Buckley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+adenovirus-mediated+airway+transduction+in+fetal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice.</a> Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Etapas críticas <ul><li> A cepa do mouse optamos por trabalhar com camundongos NMRI é porque eles têm um abundante número de filhotes (tamanho da ninhada média de 14,4 ± 1,8, dados próprios), tolerar intervenções bem e têm boas características maternas. </li><li> Colocar o fio de bolsa através da parede uterina e as membranas fetais é um passo crítico como você só quer expor a cabeça do feto e não os ombros, caso contrário, o reposicionamento é quase impossível sem causar trauma. </li><li> Uma ótima posição da cabeça f...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Camundongos NMRI </td><td> Janvier, Le Genest St Isle, França </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Reino Unido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prolene 6-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vicryl 5-0 </td><td> Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 pL de Hamilton seringa de vidro, Modelo 1710,5 TLLX SYR </td><td> Hamilton, Reno, NV, EUA </td><td> 5495-20 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de 30G afiada </td><td> Hamilton, Reno, NV, EUA </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Xilocaína 2% </td><td> AstraZeneca, Zoetermeer, na Holanda </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo fetal

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Administração pulmonar de células pré-natal, genes ou agentes farmacológicos pode proporcionar a base para novas estratégias terapêuticas para uma variedade de doenças genéticas e adquiridas. Para além de anomalias congénitas ou herdada com o requisito de longo prazo da expressão do gene entregue, vários não-herdadas condições perinatais, onde a curto prazo a expressão do gene ou a intervenção farmacológica é suficiente para atingir os efeitos terapêuticos, são considerados como possíveis indicações futuras para esse tipo de abordagem. Doenças candidatos para a aplicação de curto prazo da terapia pré-natal poderia ser a deficiência transitória neonatal do B surfactante proteína causando 1,2 síndrome da angústia respiratória neonatal ou lesões hiperóxicas do pulmão neonatal 3. Doenças candidatos à correção terapêutica permanente são Fibrose Cística (FC) 4, variantes genéticas de deficiência de surfactante 5 e α1-antitripsina 6. &lt;classe p = &quot;jove_content&quot;&gt; Geralmente, uma vantagem importante da terapia genética pré-natal é a capacidade para iniciar a intervenção terapêutica no início do desenvolvimento, ou mesmo menos antes de manifestações clínicas no paciente, evitando assim danos irreparáveis ​​no indivíduo. Além disso, os órgãos fetais têm uma taxa de proliferação aumentada das células, em comparação com órgãos adultos, o que pode permitir a um gene ou a transferência mais eficaz de células estaminais para o feto. Além disso, no útero de entrega de genes é realizada quando o sistema imunitário do indivíduo não está completamente madura. Assim, o transplante de células heterólogas ou suplementação de uma proteína não funcional ou ausente com uma versão correcta não deve causar sensibilização imunológica à célula, vector ou produto do transgene, que foi recentemente provado ser o caso com as terapias celulares e genéticas 7 . No presente estudo, investigamos o potencial de alvejar diretamente da traquéia fetal em uma m ratoodelo. Este procedimento está em uso em animais de grande porte, como coelhos e ovelhas 8, e até mesmo em um ambiente clínico 9, mas tem a data ainda não foi realizado antes em um modelo de rato. Ao estudar o potencial da terapia gênica fetal para doenças genéticas, como a CF, o modelo de rato é muito útil como uma primeira prova-de-conceito por causa da grande disponibilidade de diferentes linhagens de camundongos transgênicos, a embriogênese bem documentado e desenvolvimento fetal, menos rigorosas normas éticas, gestação curto e tamanho da leitegada grande. Vias de acesso têm sido descritos para atingir o pulmão fetal de roedores, incluindo a injeção intra-amniótica 10-12, (ultra-sonografia) intrapulmonar injeção 13,14 e administração intravenosa para os vasos do saco vitelino 15,16 ou veia umbilical 17. Nosso novo procedimento cirúrgico permite aos pesquisadores injetam o agente de escolha diretamente na traquéia do rato fetal que permitepara uma entrega mais eficaz para as vias aéreas do que as técnicas existentes 18.

Nós desenvolvemos uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioactivos para o feto de rato. A via de entrega é mais eficiente na segmentação dos pulmões do rato fetal do que o normalmente usado injecção intra-amniótica. Este procedimento tem a data ainda não foi descrita em um modelo de rato.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

A entrega pulmonar pré-natal de células, genes ou agentes farmacológicos poderia fornecer a base para novas estratégias terapêuticas para diversas doenças genéticas e...

O objetivo geral do experimento a seguir é poder injetar um agente de escolha diretamente na traqueia fetal de camundongo, o que permite uma entrega mais eficiente às vias aéreas do que as técnicas existentes. Isso é conseguido exteriorizando a cabeça fetal por meio de uma histerotomia e acessando a traqueia fetal. Em seguida, é feita uma incisão cervical vertical para visualizar a traqueia e uma agulha é inserida com orientação visual. Em seguida, esferas fluorescentes ou um vetor viral são injetados na traqueia para entregar eficientemente a substância de escolha às vias aéreas fetais. A análise microscópica de cortes de tecido dos pulmões tratados mostra que a injeção intratraqueal resulta em uma entrega mais eficiente de moléculas fluorescentes ou vetores virais às vias aéreas fetais, em comparação com a via de administração intra-amniótica mais comumente utilizada. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como a injeção fetal intra-amniótica, é que se evita a diluição da substância injetada no líquido amniótico.Isso maximiza o efeito da quantidade de partículas presentes no pulmão fetal de camundongo. Em geral, pessoas novas nesta tecnologia encontrarão extremamente desafiador realizar uma injeção endotraqueal perfeita. Isso ocorre porque a traqueia fetal é extremamente frágil e, como tal, pode ser perfurada com muita facilidade.Quando você fizer isso, realizará uma injeção por traqueia e, assim, deixará de atingir o pulmão fetal. Mas, como sempre, a prática leva à perfeição. Em preparação para a injeção intra-traqueal ou injeção it, amarre camundongos grávidos e submeta-os à ressonância magnética. Assim, eles terão 18 dias de gestação no momento da cirurgia, antes e após a cirurgia.Eles são mantidos em gaiolas com tampa filtrante, à temperatura ambiente normal e sob luz natural normal, com livre acesso a água e ração. Após anestesiar o camundongo com isoflurano, coloque-o sobre uma plataforma aquecida a 37 graus Celsius para manter a temperatura corporal e verifique o nível de anestesia realizando uma pinça no dedo do pé. Desinfete o abdômen com iodopovidona e realize uma laparotomia mediana para expor o útero gestante, exteriorizar os dois cornos uterinos e contar o número de sacos gestacionais.Um feto por cornu é operado com base na posição ideal para a exteriorização da cabeça fetal. Para fixar o feto dentro do útero a partir dos ombros, passa-se seis pontos de seda de prolina por fio, com aproximadamente um centímetro de diâmetro, através da parede uterina e das membranas fetais sobre a área onde a cabeça fetal será exposta. Em seguida, faz-se uma incisão na parede uterina dentro do ponto de bolsa, de aproximadamente 0,8 centímetros, utilizando pequenas tesouras com ponta afiada.Em seguida, comprima suavemente a cabeça e o pescoço do feto através da histerotomia. Depois, puxe delicadamente o cordão, feche o ponto em bolsa de seda firmemente ao redor do pescoço e utilize duas pinças micro mosquito. Para fixar na posição, utilize cinco o poliactina.Use nove pontos de sutura 10 em duas pinças colocadas na boca ao redor da mandíbula superior para manter a cabeça fetal em hiperextensão sob um microscópio estereoscópico. Visualize a traqueia utilizando dissecação fina e romba para fazer uma incisão vertical no pescoço; dissecar ainda mais o tecido subjacente para alcançar a traqueia. Utilizando uma seringa de vidro Hamilton de 50 microlitros com uma agulha fina de 30 graus, injete um volume total de 30 microlitros da substância.Entrada mínima do líquido injetado após a remoção da agulha garante que a injeção foi realizada corretamente. Para reposicionar a cabeça no útero, aplique pressão suave sobre o nariz. Primeiro, o pescoço retorna ao útero, seguido pela cabeça.E, finalmente, o nariz. Insira uma agulha contendo soro fisiológico na incisão dentro do ponto de sutura em bolsa de seda. Feche a histerotomia apertando o ponto em bolsa de seda e injete um volume total de aproximadamente 500 microlitros de soro fisiológico na cavidade amniótica para prevenir oligoidrâmnio.Após reposicionar o útero na cavidade abdominal, utilize uma sutura contínua de Vicryl 5-0 em duas camadas separadas. Para fechar a parede abdominal materna, infiltre a incisão com Xilocaína 0,2% para alívio da dor pós-operatória. Mantenha o camundongo sobre uma placa aquecida até que se recupere completamente para realizar uma injeção intra-amniótica ou IA fetal.Após anestesiar o camundongo grávido, use iodopovidina para desinfetar o abdômen e realize uma laparotomia mediana para expor o útero gestante, exteriorize os dois cornos uterinos e conte o número de bolsas gestacionais. Utilizando uma seringa de vidro Hamilton de 50 microlitros com agulha fina de 30 graus, insira a agulha na bolsa, próximo à boca do feto, sem entrar em contato com o feto, e injete 30 microlitros da solução no líquido amniótico.Após a injeção em todos os fetos, reposicione o útero no abdômen e utilize sutura Vicryl 5-0 na parede abdominal e na pele. Após a eutanásia da mãe, 36 horas após a intervenção fetal, retire os fetos por meio de cesariana e avalie sua viabilidade verificando a presença de batimento cardíaco, coloração rosada da pele e movimentos espontâneos. Coloque as crias próximas a uma fonte de oxigênio para estimular a respiração e a absorção de oxigênio.Em seguida, marque os filhotes na base da cauda. Usando tinta chinesa, pode-se avaliar uma injeção bem-sucedida mediante eutanásia de um feto operado e dissecação dos pulmões para avaliar macroscopicamente a presença do corante visível nos pulmões em comparação com os pulmões controles não injetados. A seguir, cubra os demais filhotes que atendem aos critérios de viabilidade.Material de cama contendo fezes e urina de uma mãe adotiva com filhotes de um dia de idade e coloque os filhotes junto à ninhada da mãe adotiva. Deixe no máximo 10 filhotes no total na ninhada da mãe adotiva. Em seguida, coloque a gaiola em um ambiente tranquilo e sem perturbações por 12 horas e avalie a taxa de sobrevivência do aleitamento para determinar o volume ideal para isso.Os volumes de injeção de 10, 20 e 30 microlitros de moléculas vermelhas fluorescentes de 100 nanômetros foram escolhidos empiricamente. São apresentadas aqui imagens confocais de cortes pulmonares fixados com coloração de núcleos. Embora no momento da cirurgia fetal um refluxo tenha sido detectado apenas após a injeção de 30 microlitros, indicando um excesso de fluido injetado, o volume de 30 microlitros proporcionou a maior quantidade de sinal fluorescente no parênquima pulmonar, conforme quantificado pela medição da fluorescência relativa mostrada aqui; essa injeção resultou em uma entrega significativamente maior de esferas fluoradas para o pulmão fetal em comparação com a raiz I A.O trato gastrointestinal também foi positivo tanto para os animais injetados por via IT quanto para os injetados por via IA. Nenhuma fluorescência vermelha foi observada em outros tecidos dos fetos tratados ou nos animais controle negativo para avaliar a eficácia da transdução viral após a injeção; as injeções IT e IA foram realizadas com vetores RAAV com revestimento ENC que expressam a luciferase de vaga-lume sob o controle do promotor do beta-actina de frango na idade de uma semana. O fluxo total de fótons para o grupo IT foi significativamente maior do que para os filhotes IA e para o controle negativo.Para distinguir entre uma injeção IT correta e incorreta, realizou-se uma combinação de imagens por ressonância magnética ou MRI e imagens por bioluminescência ou BLI para obter uma imagem sobreposta que combina o sinal de BLI da superfície com uma visualização das estruturas anatômicas mais profundas provenientes da imagem de RM, conforme mostrado aqui. Na idade de uma semana, a imagem de BL revelou um sinal proveniente da região do pescoço e torácica.A co-registração de RNM com BLI localizou a expressão do gene luciferase na região pulmonar após uma injeção correta, mas nas áreas do pescoço e abdominal após uma injeção incorreta. A análise histológica por coloração ex gal confirmou a co-registração in vivo. Após dominar todo o procedimento, a injeção intratraqueal pode ser realizada em meia hora, desde a incisão até o fechamento no animal mãe.Um tempo curto de operação resultará em maior sobrevivência fetal e em um maior número de animais que podem ser estudados após o nascimento.

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Este vídeo descreve uma abordagem intrabrônquica para administrar um agente experimental seletivamente nos pulmões distal direito e esquerdo. No protocolo apresentado, administraremos bleomicina intrabrônquica em um camundongo para obter um melhor modelo de fibrose pulmonar.

Entrega intrabrônquica: uma técnica para administrar um agente experimental seletivamente em um pulmão de camundongo

Fonte: Venuprasad, K., et al. Administração intratraqueal de Haemophilus influenzae em modelos de camundongos para estudar a inflamação das vias aéreas. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a entrega intratraqueal de um inóculo bacteriano patogênico pulmonar em um camundongo anestesiado para modelar a infecção do trato respiratório inferior.

Realizando a entrega bacteriana intratraqueal em um modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o procedimento de oclusão traqueal transuterina de um feto de camundongo em um camundongo prenhe. Este modelo pode ser usado para estudar o impacto da traqueia ocluída no desenvolvimento pulmonar.

Modelagem da Oclusão Traqueal Fetal Transuterina em Modelo Murino: Um Procedimento Cirúrgico para Ligadura da Traqueia Fetal em um Camundongo Grávida

Nós desenvolvemos um método simples, confiável e relativamente barata para a intubação traqueal em ratos através de laringoscopia direta utilizando um otoscópio com um espéculo 2,0 mm. Esta técnica é não traumático e pode ser usado para as medições repetidas em experiências crónicas. Achamos superior à traqueostomia ou relatado anteriormente técnicas não cirúrgicas.

Entubação endotraqueal em Ratos<em&gt; Via</em&gt; Laringoscopia direta Usando um otoscópio

A utilização de um modelo que simula a condição de doenças pulmonares em humanos é fundamental para o estudo da fisiopatologia e / ou etiologia de uma doença em particular e para o desenvolvimento da intervenção terapêutica. Aqui um método de intubação orotraqueal não invasivo que pode entregar diretamente materiais exógenos aos pulmões do rato é apresentado.

Não invasiva Intratraqueal intubação para estudar a Patologia e Fisiologia do Rato Lung

Este artigo apresenta um método rápido e simples para a administração de bleomicina diretamente na traquéia do mouse através de intubação. As principais vantagens deste método é que ele é altamente reprodutível, fácil de dominar, e não requer equipamento especializado ou tempos de recuperação longos.

Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos

A administração intratraqueal (TI) de agentes experimentais em camundongos geralmente resulta em parto assimétrico para os pulmões distais.  Neste relatório, nós descrevemos uma aproximação intrabronchial direta (IB) para canular cada pulmão em ratos vivos não-operatively.  Essa abordagem pode ser usada para administrar seletivamente agentes a um pulmão ou pode ser adaptada para melhorar a entrega do agente simétrico para ambos os pulmões.

Administração Intrabronquial direta para melhorar a deposição do agente seletivo dentro do pulmão do rato

Essa técnica de incutir drogas diretamente na traqueia de roedores neonatais é importante no estudo do impacto de medicamentos ou biológicos administrados localmente em doenças pulmonares neonatais. Além disso, este método também pode ser usado para induzir lesões pulmonares em modelos animais.

Um método minimamente invasivo para a instilação intratraqueal de drogas em roedores neonatais para tratar doenças pulmonares

Diversos modelos animais de hérnia diafragmática congênita e oclusão traqueal fetal apresentam vantagens e desvantagens em relação a questões éticas, custo, dificuldade cirúrgica, tamanho, taxas de sobrevivência e disponibilidade de ferramentas genéticas. Este modelo fornece uma nova ferramenta para estudar o impacto da oclusão traqueal e do aumento da pressão luminal no desenvolvimento pulmonar.

Modelo de oclusão traqueal fetal transuterina em camundongos

Neste trabalho, propomos um protocolo para a administração intratraqueal de lipopolissacarídeo (LPS) via intubação endotraqueal orofaríngea não invasiva. Este método minimiza o trauma do procedimento cirúrgico para o animal e entrega com precisão LPS para a traqueia e, em seguida, para os pulmões.

Instilação não invasiva de lipopolissacarídeo intratraqueal em camundongos

Este protocolo apresenta como o posicionamento ideal de um mouse e a inserção de um otoscópio baseado em câmera por via transoral permitem a visualização da glote, intubação rápida com trauma tecidual mínimo e entrega consistente de líquido aos pulmões.

Metodologia aprimorada para administração de líquido ao pulmão de camundongo: intubação usando um otoscópio de consumidor

Aprenda uma técnica cirúrgica para injeção intratraqueal em fetos de camundongo Mus musculus, permitindo entrega eficiente de agentes bioativos aos pulmões fetais sem diluição no fluido amniótico.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

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