Reparação de um modelo de defeito crítico porte calvária Usando derivadas de tecido adiposo células do estroma colhidas lipoaspirado

O objetivo geral deste procedimento é obter células estromais multpotentes do tecido adiposo com a finalidade de diferenciação osteogênica, utilizando um modelo in vivo de defeito calvarial em camundongo. Isso é realizado primeiramente isolando células progenitoras da camada vascular estromal do tecido adiposo, que pode ser obtida após um procedimento de lipoaspiração. O próximo passo é preparar uma estrutura tridimensional e, em seguida, semear as células nesse suporte.

O passo final é a criação de um defeito calvarial de tamanho crítico em um modelo murino, no qual são colocados a estrutura tridimensional e as células. Em última análise, os resultados mostram que as células estromais multipotentes isoladas do tecido adiposo possuem potencial para regeneração esquelética in vivo. As aplicações desta técnica abrangem um amplo espectro de possíveis aplicações clínicas devido à escassez de tecido disponível para regeneração esquelética.

Embora os enxertos ósseos autólogos sejam o padrão-ouro, a falta de sítios doadores e a morbidade do sítio doador limitam esta opção. Enxertos alogênicos e materiais estranhos podem ser utilizados, mas são limitados pelo custo, má integração e risco de infecção.

O possível uso do tecido adiposo ou gorduroso para o isolamento de células progenitoras na engenharia de tecidos esqueléticos é empolgante. O procedimento será demonstrado por mim e por Michael Chung do laboratório Long Anchor. Primeiro, obtenha tecido adiposo subcutâneo humano a partir de procedimentos eletivos de lipoaspiração.

E observe as duas camadas no aspirado lipídico. O sobrenadante contém a grande maioria do material celular do processo. A camada inferior é composta principalmente pelo soro fisiológico injetado.

As células estromais derivadas do tecido adiposo podem ser obtidas de qualquer camada, mas o rendimento é muito maior a partir do sobrenadante. Para isolar o fração vascular estromal ou lavagem de SVF, lave extensivamente o aspirado de lipoaspiração com volumes iguais de solução salina tamponada com fosfato 1x ou PBS contendo 2,5% de Betadine, aspire um volume igual de PBS 1x sem Betadine. Deixe a lavagem precipitar.

Certifique-se de manter uma técnica estéril durante todo o processo para evitar contaminação com tecido humano processado. Em seguida, aspire a camada inferior e descarte após cada lavagem, então transfira 15 mililitros de tecido adiposo para tubos cónicos Falcon de 50 mililitros. Em seguida, digira o tecido adiposo em 15 mililitros filtrados de 0,075% filtrado.

Digira com colagenase tipo II em solução salina balanceada de Hank ou HBSS a 37 graus Celsius em banho-maria por 60 minutos sob agitação constante, certificando-se de ventilar os tubos a cada 15 minutos. Em seguida, neutralize a atividade enzimática com 15 mililitros de PBS contendo 10% de soro bovino fetal ou FBS e centrifugue. Para obter um pellet denso de SVF, o pellet será uma mistura de células-tronco derivadas de adipócitos e eritrócitos.

Descarte primeiro a camada de gordura do sobrenatante e, em seguida, descarte a camada líquida do sobrenatante sem perturbar o pellet. Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio de crescimento tradicional. Em seguida, combine três tubos em um único tubo cônico limpo de 50 mililitros por meio de um filtro de 100 mícrons e centrifugue.

Descarte o sobrenatante sem perturbar o precipitado e, em seguida, ressuspenda o precipitado. Em cinco mililitros de meio de crescimento tradicional, combine dois tubos cônicos de 50 mililitros por uma placa de 10 centímetros ou cinco tubos cônicos de cinco mililitros por uma placa de 15 centímetros. Estabeleça culturas primárias durante a noite a 37 graus Celsius com 21% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação durante a noite, lave as placas com PBS para remover os glóbulos vermelhos residuais não aderentes. As populações celulares resultantes são células estromais derivadas de adipócitos. Mantenha as células em níveis subconfluentes para prevenir a diferenciação espontânea.

A 37 graus Celsius, 21% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Em meio de crescimento, as células geralmente precisam ser repassadas a cada três a quatro dias em meio de crescimento regular. Quando semeadas em 50% de confluência, prepare o suporte conforme explicado no manuscrito acompanhante.

Quando as células atingirem níveis de subconfluência, lave as células duas vezes com PBS e tripsinize. Conte as células para quantificá-las. Para semeadura, prepare-se para semear as células em scaffolds pré-cortados com diâmetro de quatro milímetros, utilizando 1,5 vezes 10 à quinta células.

Coloque um suporte individual em um poço de uma placa de 96 poços, em seguida ressuspenda as células em meio de crescimento regular com uma concentração de aproximadamente 1,5 vezes 10 à quinta células por 20 microlitros de meio. Semee o suporte pipetando 20 microlitros da solução diretamente no suporte e coloque-o no incubador de cultura celular por 30 minutos.

Após 30 minutos, adicione 200 microlitros de meio e deixe as células incubarem sobre o suporte durante a noite. Antes da cirurgia, não é necessário garantir a adesão das células ao suporte como parte da semeadura. Um número suficiente de células assegurará que a maioria delas se fixe ao suporte.

Após anestesiar um camundongo CD1 nu adulto com 60 dias de idade, esterilize o local cirúrgico com Betadine e álcool três vezes e aplique lubrificante sobre os olhos dos camundongos. Em seguida, faça uma incisão sagital mediana no couro cabeludo do camundongo para expor o osso parietal direito. Remova a periana do osso parietal direito com raspagem romba.

Em seguida, crie um defeito unilateral de quatro milímetros de espessura total no osso parietal direito não associado à sutura. Utilizando uma broca com ponta revestida de diamante, tenha extremo cuidado para não perturbar a dura-máter subjacente, pois a espessura do crânio do camundongo é inferior a 0,3 milímetros antes do implante. Lave as estruturas com PBS estéril para evitar a transferência de fatores de crescimento derivados do meio.

Coloque o suporte no defeito. Por fim, feche a pele com sutura e monitore o animal conforme os protocolos pós-operatórios estabelecidos. Realize tomografia computadorizada micro para o camundongo e obtenha uma imagem tridimensional reconstruída utilizando o software microview.

Use o Adobe Photoshop para redimensionar as imagens para uma altura padrão. Normalmente, medimos a regeneração craniana a cada duas semanas. Os camundongos são anestesiados durante a aquisição de imagens para acompanhamento de longo prazo e, eventualmente, eutanasiados.

Para análise histológica, utilize a ferramenta de varinha mágica para medir os pixels do defeito craniano. Determine a porcentagem de cicatrização do defeito por meio de tomografias computadorizadas subsequentes. Meça a área do defeito craniano, determine o número de pixels e divida-o pelo número original de pixels do defeito; realize coloração de múltiplas seções ao longo da extensão do defeito utilizando corantes histológicos como azul de anilina e caneta vermelha para indicar a formação óssea.

Utilize o Adobe Photoshop para recortar todas as áreas que não estão no defeito calvarial e use a ferramenta de seleção mágica para determinar o número de pixels correspondentes à formação óssea de novo na área do defeito, comparando isso com controles ou outras variáveis. Abaixo, há uma visão geral da coleta e aplicação do aspirado de lipoaspiração, desde o isolamento de células estromais derivadas do tecido adiposo até sua expansão, diferenciação e uso in vitro e in vivo. Aqui, uma microtomografia computadorizada mostra a cicatrização in vivo de um defeito calvarial de tamanho crítico com a aplicação de células estromais adiposas por meio de uma matriz de hidroxiapatita, observada na linha inferior.

Os controles, mostrados na linha superior, incluem ausência de scaffold e defeito. A linha do meio mostra o defeito com a colocação do scaffold sem células. LS mostrado aqui é a quantificação da cicatrização óssea a partir da micro-TC, que mostra um aumento significativo da cicatrização no grupo A SC.

Esta é uma imagem histológica que mostra o aumento da formação óssea do grupo A SC por meio de andal. Em azul e caneta AROM, coloração para al. Em azul, o osteoide cora em azul escuro para pen arom.

O ossoide corado de amarelo mostrado aqui são ASCs humanas marcadas com GFP, que foram semeadas em uma matriz e sacrificadas após duas semanas. A coloração foi realizada com um anticorpo marcado com GFP para mostrar as células humanas contribuindo para a regeneração na área do defeito. É mostrada aqui a imuno-histoquímica para antígeno nuclear humano, demonstrando a prevalência de células humanas na área do defeito após duas semanas.

Uma vez dominado, o processamento do tecido adiposo pode ser realizado em até quatro horas, e o procedimento cirúrgico pode levar cerca de 10 minutos por camundongo. É importante lembrar que o osso parietal é arredondado, enquanto a broca é plana, portanto, é necessário ter cuidado para atravessar toda a circunferência do defeito de quatro milímetros. Lembre-se de proceder lentamente para evitar lesar a dura-máter no cérebro.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar as camadas progenitoras do tecido adiposo. Semear essas células em um suporte e colocá-las no camundongo.