Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication

O objetivo geral do experimento a seguir é depositar eletricamente filmes biopoliméricos e funcionalizá-los com componentes biológicos, como proteínas e células. A eletrodeposição é obtida aproveitando a mudança de pH que ocorre localmente em um eletrodo polarizado em combinação com uma solução de polissacarídeo responsiva ao pH. Ao escolher uma estratégia de deposição catártica ou anódica, o eletrodo é polarizado para desencadear uma transição soul gel, que gera um filme fino com um padrão definido pela eletrogeometria.

Além disso, componentes biológicos, como proteínas e células, podem ser introduzidos ao longo do processo de deposição do eletrodo. Para funcionalizar biologicamente os filmes, são obtidos resultados que mostram que os componentes biológicos estão localizados nos filmes com base em imagens de fluorescência. Além disso, os componentes são funcionais e capazes de interagir com seu ambiente, demonstrados pela detecção eletroquímica da atividade enzimática e pelo uso da resposta da célula repórter.

A biofabricação fornece uma nova caixa de ferramentas para construir a interface entre biologia e eletrônica. Acreditamos que suas principais vantagens são sua simplicidade e sua capacidade de montar em condições fisiológicas próximas. A biologia é especialista em fabricar em nanoescala por meio de automontagem e meios enzimáticos Ao alistar essas capacidades, contornamos métodos de síntese complexos, perigosos e demorados que outras técnicas de montagem utilizam.

Nossa equipe colaborativa teve a ideia de construir a interface do dispositivo BioD usando materiais e mecanismos biológicos quando observamos que suas pipas poderiam ser depositadas em eletrodos. Kitan é um polissacarídeo formador de filme responsivo ao pH que pode reconhecer sinais elétricos impostos pelo dispositivo e depositar como um filme fino. Uma vez que vimos que o kitan poderia ser depositado com eletrodos, percebemos que poderíamos acessar um conjunto mais amplo de ferramentas de bioquímica e biologia molecular para construir uma interface de dispositivo BioD.

A aplicação de tal técnica se estende para configurações de chips de laboratório, onde componentes biológicos funcionais são necessários, pois fornecem uma maneira barata e fácil de localizar esses componentes em um eletrodo onde podem permanecer viáveis. A demonstração visual deste método é crítica, pois um filme biofabricado pode ser dedicado e facilmente danificado. Como tal, deve-se ter cuidado para não ser muito duro ao lavar ou filmar o filme.

Como o filme pode ser denominado facilmente perturbado. No entanto, como vantagem, os eletros podem ser reutilizados porque o filme é facilmente removido. Para iniciar este protocolo, conecte uma fonte de alimentação aos eletrodos fabricados sob medida por meio de cabos de conexão usando garras jacaré.

Uma lâmina de vidro coberta de óxido de índio e estanho ou ITO atuará como ânodo ou eletrodo de trabalho, a folha de platina servirá como o cátodo ou contra-eletrodo, posicione o eletrodo de modo que a superfície do IT o a ser funcionalizada se oponha ao contra-eletrodo de forma que a superfície do IT O seja posicionada verticalmente para ser mergulhada na solução ou horizontalmente, de modo que a solução possa ser contida na superfície. Em seguida, prepare uma solução de deposição de alginato misturando 1% de alginato e 0,5% de carbonato de cálcio em água destilada e autoclavando a mistura. Em seguida, rotule fluorescentemente o alginato com esferas de flúor misturando e vórtice.

Isso permitirá a imagem de fluorescência do filme resultante Após a autoclavagem, a solução submerge ambos os eletrodos na solução de deposição preparada aplica uma densidade de corrente constante de três amperes por metro quadrado por dois minutos. voltage mudará na faixa de dois a três volts Após dois minutos, desconecte o eletrodo e remova a solução sem depósitos. Enxágue suavemente o filme com cloreto de sódio para remover o alginato supérfluo.

Incube o filme brevemente em cloreto de cálcio 0,1 molar para fortalecer o gel. O filme é então incubado na solução de armazenamento desejada. Prossiga para a imagem do filme usando microscopia de fluorescência antes da co-deposição.

Cultive uma cultura de células emissoras de sinal e uma cultura de células receptoras de sinal, conforme indicado no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Em seguida, prepare uma solução de deposição de alginato e carbonato de cálcio. Misture a solução com cada cultura de células em uma proporção de um para um para uma concentração final de 1% de alginato e 0,5% de carbonato de cálcio com as células diluídas até cerca de metade da densidade de cultura.

Use uma lâmina de vidro padronizada com dois eletrodos ITO contidos por um poço de polidimetil silano e um contra-eletrodo de platina. Conecte um eletrodo ITO e o eletrodo de platina a uma fonte de alimentação. Como antes, mergulhe os eletrodos na solução de deposição contendo as células receptoras.

Defina a fonte de alimentação para uma corrente constante a uma densidade de três amperes por metro quadrado, onde a dimensão da área de superfície é definida pelo único eletrodo no qual a deposição ocorrerá. Aplicar a corrente durante dois minutos para permitir a co-deposição das células na matriz de alginato. Enxágue o filme com cloreto de sódio como antes, mude a conexão antic para o eletrodo ITO adjacente.

Repita o procedimento de deposição, mas desta vez. Apresentando a solução que contém as células emissoras. Incube o chip de dois eletrodos contendo as células codepositadas e o argenato de cálcio durante a noite a 37 graus Celsius em solução salina tamponada com fosfato.

Suplementado com 10% de LB e um cloreto de cálcio milimolar. Após a incubação, a imagem do chip usando um microscópio de fluorescência para iniciar a deposição do eletrodo de quitosana. Conecte a fonte de alimentação aos eletrodos.

Clipes de jacaré de fogo. Um chip de silício revestido de ouro atuará como cátodo e uma folha de platina servirá como ânodo. Posicione a superfície do eletrodo de ouro de forma que ela deponha o contra-eletrodo como antes.

Prepare uma solução de areia Kato misturando flocos de areia Kato em água e adicionando lentamente dois molares de cloreto de hidrogênio para dissolver os polissacarídeos. Seguindo o procedimento referenciado no texto, a solução de areia Kato pode ser marcada com fluorescência para obter imagens do filme depositado no eletrodo por microscopia de fluorescência Em seguida. Os eletrodos na solução kaizan submergindo completamente a área desejada para deposição.

Por dois minutos, aplique uma corrente constante calculada com densidade de quatro amperes por metro quadrado com base na área de superfície dos eletrodos de trabalho. Nesse caso, uma corrente de 16 microamperes é aplicada a um eletrodo de ouro quadrado de quatro milímetros, a tensão mudará dentro da faixa de dois a três volts após o enxágue no eletrodo com água deionizada para remover a quitosana supérflua. Prossiga para obter imagens do filme usando um microscópio de fluorescência, quitosana copos e glicose oxidase de uma solução a uma densidade de corrente de quatro rampas por metro quadrado em um eletrodo padronizado.

De acordo com o procedimento de deposição de eletrodo de quitosana, um filme kaizan aprisionado com glicose oxidase será gerado. Conecte o eletrodo tratado a um sistema de três eletrodos como eletrodo de trabalho, um fio de platina como contra-eletrodo e prata, cloreto de prata como eletrodo de referência, mergulhe os eletrodos em uma solução tampão de fosfato contendo cloreto de sódio. Conjugue eletroquimicamente a proteína ao filme Kazam aplicando uma voltagem constante por 60 segundos usando cronopirometria após a conjugação.

Coloque o chip em tampão fosfato e lave por 10 minutos em um agitador orbital para remover qualquer cloreto de sódio não reativo e glicose oxidase não conjugada. Recoloque o sistema de três eletrodos e mergulhe uma solução de glicose de cinco milimolares. Em seguida, defina os parâmetros desejados para a telemetria de vol cíclico para varrer o potencial em uma direção positiva para 0,7 volts.

Remova os eletrodos da solução de glicose e enxágue com tampão fosfato. Em seguida, coloque os eletrodos entre o béquer de 10 mililitros contendo oito mililitros de tampão fosfato em um viés de placa de agitação magnética. O GOX funcionalizou o chip para 0,6 volts para servir como eletrodo de trabalho.

Depois de definir os parâmetros desejados, colete uma gravação de linha de base. Adicione alíquotas de glicose ao tampão para aumentar a concentração de glicose em quatro milimolares para cada alíquota Neste experimento, alíquotas de 400 microlitros de glicose de 80 milimolares são adicionadas ao tampão. Correlacione a saída de corrente com cada concentração de glicose Para gerar uma curva padrão para realizar a funcionalização da proteína, use uma lâmina de vidro padronizada com um eletrodo adjacente de ouro e ITO contido em APDS.

Bem, polarize o eletrodo de ouro com um potencial catártico para o tizen de depósito do eletrodo, como mostrado anteriormente. Depois de enxaguar o filme, adicione uma solução de autoindutor azul marcado com fluorescência duas sintase suplementada com tirosinase. Após uma incubação de uma hora à temperatura ambiente.

Enxágue o filme com PBS como antes, aplique um potencial anódico ao eletrodo ITO imerso em uma solução de deposição de alginato contendo células receptoras. Continue com as mesmas etapas descritas na co-deposição de populações de células em alginato para gerar o sinal transmitido enzimaticamente. Após o enxágue dos filmes, adicione uma solução de cinco micromolares, SAH e PBS suplementados com 10% de LB e um milimolar.

O cloreto de cálcio cobre os eletrodos para evitar a evaporação da solução e incuba durante a noite a 37 graus Celsius. Isso permitirá uma resposta da célula receptora gerando uma proteína fluorescente vermelha DS eletrodos adjacentes vermelhos podem ser visualizados com microscopia de fluorescência por ajuste. Os filtros para capturar a fluorescência azul da também indutora duas sintase e a fluorescência vermelha expressa pelas células receptoras cooptadas impuseram sinais elétricos podem criar microambientes localizados próximos à superfície de um eletrodo e esses estímulos podem desencadear a automontagem de polissacarídeos como alginato e razan para se depositar como um filme de hidrogel na superfície do eletrodo.

Como essa transição soul gel ocorre na superfície do eletrodo, o filme resultante é eletroendereçado com sua geometria correspondente ao padrão do eletrodo. Usando alginato, populações de células únicas foram depositadas em endereços separados. A evidência de seus endereços de eletrodos é observada na interação entre a população de células emissoras e receptoras.

A molécula auto-indutora dois se difunde das células emissoras e é absorvida pelas células receptoras, resultando na expressão da proteína fluorescente vermelha DS. Aqui. A fluorescência vermelha é observada apenas no eletrodo onde os receptores são endereçados. Por outro lado, a enzima biossensorial glicose oxidase fornece a capacidade de detecção de glicose por meio de uma reação enzimática, produzindo peróxido de hidrogênio, que pode então ser oxidado eletroquimicamente para produzir uma corrente de saída.

Desta forma, um sinal químico pode ser transduzido para elétrico. Este gráfico mostra que os filmes nos quais o Geo X foi quimicamente conjugado produzem um forte sinal antic na presença de glicose, em oposição aos filmes que não contêm Geo X. Além disso, um aumento gradual em uma corrente ótica é produzido em resposta ao aumento das concentrações de glicose.

A curva padrão também presente mostra que os aumentos de passos ocorreram de forma quase linear, dependendo da quantidade de glicose adicionada. Esses resultados mostram que a enzima também retém sua sensibilidade após a conjugação ao filme de Razza, conforme ilustrado aqui, a I duas sintase inclui uma etiqueta de Pentatirosina. A tirosinase atua na etiqueta de tirosina oxidando os grupos fenólicos residuais em o quinonas, que então se ligam covalentemente à amina de kazan, evidência de funcionalização do filme Kazam dentro da ai dois sintase pela montagem da tirosinase é observada nesta imagem de fluorescência mostrando um filme kaza em ouro onde a I duas sintase funcionalizada foi marcada com fluorescência em azul porque uma I duas sintase gera um I dois do substrato SAH da mesma maneira como as células emissoras, sua proximidade com células receptoras cooptadas na presença de SAH também faz com que as células receptoras respondam fluorescentemente expressando DS.

A fluorescência vermelha vermelha das células receptoras demonstra novamente a interação entre os endereços devido à difusão de ai, dois de um para o outro, e indica ainda que 10 enzimas imobilizadas ao tizen retêm atividade uma vez ligadas covalentemente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como eletrodepositar filmes de polissacarídeos e como funcionalizá-los usando uma variedade de técnicas. Demonstramos a versatilidade nessas etapas de funcionalização, permitindo-nos trabalhar com uma infinidade de componentes biológicos em testes posteriores.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em apenas alguns minutos, a fim de gerar padrões de filme bem definidos nos quais os componentes biológicos podem ser enxertados com precisão. E assim, dessa forma, somos capazes de gerar facilmente superfícies biologicamente padronizadas e ativas em eletrodos designados, tudo feito de forma organizada e ainda capaz de alcançar interações biológicas complexas. Seguindo este procedimento, a criatividade pode ser empregada tanto no projeto do eletroarranjo quanto na escolha de componentes biológicos para alcançar a interação do projeto.

Nossa esperança é que as ferramentas de biofabricação unam dois campos díspares, biotecnologia e microeletrônica, cada um dos quais revolucionou individualmente nossas vidas. Ao fazer a interface entre esses dois campos, acreditamos que criaremos novas soluções para alguns dos problemas mais prementes da sociedade. Por exemplo, prevemos que a Biofabricação pode fornecer métodos simples e versáteis para novas formas de detecção, para ponto de atendimento, diagnóstico de doenças e detecção de ameaças biológicas e químicas.

Um exemplo de longo alcance pode ser que o próximo stent arterial de próxima geração também seria capaz de monitorar seu perfil metabólico, bem como manter sua artéria aberta.