Colmatar a interface Bio-eletrônico com Biofabrication

O objetivo geral do seguinte experimento é depositar eletricamente filmes biopoliméricos e funcionalizá-los com componentes biológicos, como proteínas e células. O eletrodepósito é obtido aproveitando a mudança de pH que ocorre localmente em um eletrodo polarizado em combinação com uma solução de polissacarídeo sensível ao pH. Após escolher uma estratégia de deposição catódica ou anódica, o eletrodo é polarizado para desencadear uma transição sol-gel, o que gera um filme fino com um padrão definido pela geometria eletroquímica.

Além disso, componentes biológicos como proteínas e células podem ser introduzidos durante todo o processo de deposição do eletrodo. Para funcionalizar biologicamente o filme, são obtidos resultados que demonstram a localização dos componentes biológicos nas películas com base em imagens de fluorescência. Adicionalmente, os componentes são funcionais e capazes de interagir com seu ambiente, conforme demonstrado pela detecção eletroquímica de atividade enzimática e pelo uso da resposta de células repórter.

A biofabricação fornece uma caixa de ferramentas inovadora para construir a interface entre biologia e eletrônica. Acreditamos que suas principais vantagens são a simplicidade e a capacidade de montagem em condições próximas às fisiológicas. A biologia é especialista na fabricação em escala nanométrica por meio de autoorganização e processos enzimáticos. Ao recrutarmos essas capacidades, contornamos métodos de síntese complexos, perigosos e demorados utilizados por outras técnicas de montagem.

Nossa equipe colaborativa teve a ideia de construir a interface do dispositivo BioD usando materiais e mecanismos biológicos ao observar que suas pipetas poderiam ter depósito eletroquímico. O quitan é um polissacarídeo formador de filme com resposta ao pH que pode reconhecer sinais elétricos impostos pelo dispositivo e se depositar como uma película fina. Assim que verificamos que o quitan poderia ser eletrodepositado, percebemos que poderíamos acessar um conjunto mais amplo de ferramentas da bioquímica e da biologia molecular para construir uma interface de dispositivo BioD.

A aplicação de tal técnica estende-se a configurações de laboratório em chip onde são necessários componentes biológicos funcionais, pois eles oferecem uma maneira barata e simples de localizar esses componentes em um eletrodo onde podem permanecer viáveis. A demonstração visual deste método é fundamental, pois um filme biofabricado pode ser delicado e facilmente danificado. Assim, deve-se ter cuidado para não ser muito rigoroso durante a lavagem ou manipulação do filme.

Como o filme pode ser facilmente perturbado. No entanto, como vantagem, os eletrodos podem ser reutilizados porque o filme é facilmente removido. Para iniciar este protocolo, conecte uma fonte de alimentação aos eletrodos fabricados sob encomenda por meio de cabos de conexão usando clipes de jacaré.

Um lâmina de vidro revestida com óxido de estanho e índio, ou ITO, atuará como ânodo ou eletrodo de trabalho; uma folha de platina servirá como cátodo ou eletrodo auxiliar. Posicione os eletrodos de modo que a superfície do ITO a ser funcionalizada fique voltada para o eletrodo auxiliar, de forma que a superfície do ITO seja posicionada verticalmente para ser mergulhada na solução ou horizontalmente, de modo que a solução possa ser contida sobre a superfície. Em seguida, prepare uma solução de deposição de alginato misturando 1% de alginato e 0,5% de carbonato de cálcio em água destilada e autoclavando a mistura. Então, marque o alginato com fluorescência utilizando esferas fluoradas, misturando e agitando em vórtex.

Isso permitirá a imagem de fluorescência do filme resultante. Após a autoclave, submergir ambas as eletrodos na solução de deposição preparada e aplicar uma densidade de corrente constante de três amperes por metro quadrado durante dois minutos. A voltagem variará na faixa de dois a três volts. Após dois minutos, desconecte o eletrodo e remova a solução com os depósitos não aderidos. Enxágue suavemente o filme com cloreto de sódio para remover alginato em excesso.

Incube brevemente a película em cloreto de cálcio 0,1 molar para fortalecer o gel. Em seguida, incube a película na solução de armazenamento desejada. Prossiga para obter a imagem da película utilizando microscopia de fluorescência antes da co-deposição.

Cultive uma cultura celular emissora de sinal e uma cultura celular receptora de sinal conforme indicado no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Em seguida, prepare uma solução de deposição de alginato e carbonato de cálcio. Misture a solução com cada cultura celular em uma proporção de um para um, até uma concentração final de 1% de alginato e 0,5% de carbonato de cálcio, com as células diluídas a cerca de metade da densidade de cultivo.

Utilize uma lâmina de vidro com um padrão contendo dois eletrodos de ITO confinados por um poço de silano de poli dimetil e um eletrodo contraponto de platina. Conecte um dos eletrodos de ITO e o eletrodo de platina a uma fonte de alimentação. Como antes, imerja os eletrodos na solução de deposição contendo as células receptoras.

Configure a fonte de alimentação para uma corrente constante com uma densidade de três amperes por metro quadrado, em que a dimensão da área superficial é definida pelo único eletrodo no qual a deposição ocorrerá. Aplique a corrente por dois minutos para permitir a coprecipitação das células na matriz de alginato. Enxágue o filme com cloreto de sódio como anteriormente e troque a conexão antic para o eletrodo ITO adjacente.

Repita o procedimento de deposição, mas desta vez introduza a solução contendo as células doadoras. Incube o chip com dois eletrodos contendo as células co-depositadas e arginato de cálcio durante a noite a 37 graus Celsius em solução salina tamponada com fosfato.

Suplementado com meio LB 10% e cloreto de cálcio de um milimolar. Após a incubação, visualize o chip utilizando um microscópio de fluorescência para iniciar a deposição do eletrodo de quitosana. Conecte a fonte de alimentação aos eletrodos.

Conecte as pinças de jacaré. Um chip de silício revestido com ouro atuará como cátodo e uma folha de platina servirá como ânodo. Posicione a superfície do eletrodo de ouro de modo que deposite o eletrodo contrário como antes.

Prepare uma solução de Kato sand misturando as lâminas de Kato sand em água e adicionando lentamente ácido clorídrico dois molar para dissolver os polissacarídeos. Seguindo o procedimento referenciado no texto, a solução de Kato sand pode ser marcada com fluorescência para visualizar o filme depositado no eletrodo por microscopia de fluorescência. Em seguida, coloque os eletrodos na solução de kaizan, submergindo completamente a área desejada para deposição.

Durante dois minutos, aplique uma corrente constante calculada com densidade de quatro amperes por metro quadrado com base na área de superfície do eletrodo de trabalho. Neste caso, uma corrente de 16 microamperes é aplicada a um eletrodo de ouro de quatro milímetros quadrados; a tensão se deslocará na faixa de dois a três volts. Após enxaguar o eletrodo com água deionizada para remover o quitosano em excesso, prossiga para imagens do filme utilizando um microscópio de fluorescência, depositando quitosano e glicose oxidase a partir de uma solução com densidade de corrente de quatro amperes por metro quadrado sobre um eletrodo padronizado.

De acordo com o procedimento de deposição eletroquímica de Quitosana, será gerada uma película de Kaizan imobilizada com glicose oxidase. Fixe o eletrodo tratado a um sistema de três eletrodos, utilizando-o como eletrodo de trabalho, um fio de platina como eletrodo auxiliar e prata/cloreto de prata como eletrodo de referência. Mergulhe os eletrodos em uma solução tampão fosfato contendo cloreto de sódio. Conjugue eletroquimicamente a proteína à película de Kaizan aplicando uma tensão constante durante 60 segundos, utilizando cronopirômetria após a conjugação.

Coloque o chip em tampão fosfato e lave por 10 minutos em agitador orbital para remover qualquer cloreto de sódio não reagido e glicose oxidase não conjugada. Reconecte o sistema de três eletrodos e imerja em uma solução de glicose cinco milimolar. Em seguida, ajuste os parâmetros desejados para voltametria cíclica para varrer o potencial no sentido positivo até 0,7 volts.

Remova os eletrodos da solução de glicose e enxágue com tampão fosfato. Em seguida, coloque os eletrodos em um béquer de 10 mililitros contendo oito mililitros de tampão fosfato sobre uma placa de agitação magnética com viés. Aplique no chip funcionalizado com GOX uma tensão de 0,6 volts para atuar como eletrodo de trabalho.

Após ajustar os parâmetros desejados, realize um registro de linha de base. Adicione alíquotas de glicose ao tampão para aumentar a concentração de glicose em quatro milimolares por alíquota. Neste experimento, são adicionadas ao tampão alíquotas de 400 microlitros de glicose 80 milimolares. Correlacione a saída de corrente a cada concentração de glicose para gerar uma curva padrão. Para realizar a funcionalização proteica, utilize uma lâmina de vidro com um eletrodo de ouro e ITO adjacentes, contidos dentro de A-P-D-M-S.

Polarize o eletrodo de ouro com um potencial catódico para eletrodepositar o tizen conforme demonstrado anteriormente. Após enxaguar o filme, adicione uma solução de autoindutor fluorescente azul marcado, suplementada com a enzima tirosinase. Incube por uma hora à temperatura ambiente.

Lave a película com PBS como antes, aplique um potencial anódico ao eletrodo de ITO imerso em uma solução de deposição de alginato contendo células receptoras. Prossiga com os mesmos passos descritos na co-deposição de populações celulares em alginato para gerar o sinal transmitido enzimaticamente. Após lavar as películas, adicione uma solução de cinco micromolar, SAH e PBS suplementada com meio LB a 10% e um milimolar.

Cloreto de cálcio cobre os eletrodos para prevenir a evaporação da solução e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Isso permitirá uma resposta nas células receptoras por meio da geração de uma proteína fluorescente vermelha DS red; eletrodos adjacentes podem ser analisados por microscopia de fluorescência ajustando os filtros para capturar a fluorescência azul do indutor também sintetase e a fluorescência vermelha expressa pelas células receptoras cooptadas. Sinais elétricos impostos podem criar microambientes localizados próximos à superfície do eletrodo, e esses estímulos podem desencadear a automontagem de polissacarídeos, como alginato e razan, depositando-se como um filme de hidrogel na superfície do eletrodo.

Como essa transição sol-gel ocorre na superfície do eletrodo, o filme resultante é eletroendereçado com sua geometria correspondendo ao padrão do eletrodo. Utilizando alginato, populações celulares únicas foram coprecipitadas em endereços separados. A evidência de seu eletroendereçamento é observada mediante a interação entre as populações celulares emissora e receptora.

A molécula indutora automático dois difunde-se a partir das células emissoras e é absorvida pelas células receptoras, resultando na expressão da proteína fluorescente vermelha DS. Aqui, a fluorescência vermelha é observada apenas no eletrodo onde as células receptoras estão localizadas. Por outro lado, a enzima biossensora glicose oxidase confere a capacidade de detecção de glicose por meio de uma reação enzimática que produz peróxido de hidrogênio, o qual pode então ser eletroquimicamente oxidado para gerar uma corrente de saída.

Dessa forma, um sinal químico pode ser transduzido em um sinal elétrico. Este gráfico mostra que filmes nos quais o Geo X foi quimicamente conjugado produzem um forte sinal antic na presença de glicose, ao contrário dos filmes que não contêm Geo X. Esses resultados indicam que o Geo X pode ser montado sobre um filme de zam depositado e ainda reter atividade catalítica. Além disso, um aumento em degrau na corrente otica é produzido em resposta ao aumento das concentrações de glicose.

A curva padrão também apresentada mostra que os aumentos ocorreram de forma quase linear, dependente da quantidade de glicose adicionada. Esses resultados demonstram que a enzima mantém sua sensibilidade mesmo após a conjugação ao filme Razza, como ilustrado aqui, em que a I dois sintase inclui uma etiqueta de penta tirosina. A tirosinase atua sobre a etiqueta de tirosina, oxidando os grupos fenóis dos resíduos a o-quinonas, que então se ligam covalentemente às evidências de aminas do filme Kazan. Há evidência de funcionalização do filme Kazam pela montagem da I dois sintase mediada por tirosinase, observada nesta imagem de fluorescência que mostra um filme kaza sobre ouro, onde a I dois sintase funcionalizada foi marcada fluorescentemente em azul. Como a I dois sintase gera I dois a partir do substrato SAH da mesma maneira que as células emissoras, sua proximidade com células receptoras recrutadas na presença de SAH também faz com que essas células respondam fluorescentemente, expressando ds.

A fluorescência vermelha das células receptoras novamente demonstra a interação entre as unidades devido à difusão do ai-2 de uma para a outra, e indica ainda que as 10 enzimas imobilizadas ao tizen retêm atividade após ligação covalente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como eletrodepositar filmes de polissacarídeos e como funcionalizá-los utilizando diversas técnicas. Demonstramos a versatilidade dessas etapas de funcionalização, permitindo-nos trabalhar com uma grande variedade de componentes biológicos em testes posteriores.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em apenas alguns minutos, a fim de gerar padrões bem definidos de filme sobre os quais componentes biológ游戏副本

Nossa expectativa é que as ferramentas de biofabricaoção sirvam de ponte entre dois campos distintos — a Biotecnologia e a Microeletrônica —, cada um dos quais já revolucionou nossas vidas individualmente. Ao integrar essas duas áreas, acreditamos que poderemos criar novas soluções para alguns dos problemas mais urgentes da sociedade. Por exemplo, imaginamos que a Biofabricaoção possa oferecer métodos simples e versáteis para novas formas de detecção, no ponto de atendimento, no diagnóstico de doenças e na detecção de ameaças biológicas e químicas.

Um exemplo de grande alcance seria que o stent arterial da próxima geração também pudesse monitorar seu perfil metabólico, além de manter sua artéria aberta.