Neurais culturas de explante de Xenopus laevis

O objetivo deste procedimento é cultivar cones de crescimento de Xenopus Lavis para posterior análise de imagens de alta resolução. Isso é feito injetando primeiro sapos fêmeas com hormônio para estimular a produção de ovos. O segundo passo é coletar e fertilizar os óvulos e, em seguida, injetá-los com mRNA ou outras construções de interesse.

No dia seguinte, os embriões são dissecados e os tubos neurais são isolados, cortados e revestidos em lamínulas. A etapa final é obter imagens dos axônios e cones de crescimento que crescem. Em última análise, a microscopia de fluorescência de alta resolução pode ser usada para mostrar mudanças na localização de proteínas em cones de crescimento ao longo do tempo.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as dissecções do tubo neural podem ser difíceis de aprender lendo uma seção do método sem observar a técnica em primeira mão. Obter óvulos de rãs fêmeas previamente injetadas com 400 unidades de gonadotrofina coriônica 12 a 14 horas antes. Colete os ovos em uma solução de campainha modificada com marcas X.

Em seguida, fertilize o X coletado in vitro com testículos picados conforme descrito anteriormente e adicione 0,1 XMMR após pelo menos 20 minutos. Remova o meio e incube os embriões em 2% de cisteína em um XMMR a pH 7,8 por três a cinco minutos para remover a camada gelatinosa do embrião. Em seguida, despeje os embriões em um copo.

Em seguida, lave os embriões com 0,1 XMMR ou 0,1 x solução salina modificada três a cinco vezes após a lavagem final. Mantenha os embriões em 0,1 XMMR à temperatura ambiente até à injeção ou se desejado. Coloque os embriões a 14 a 18 graus Celsius para retardar o desenvolvimento antes da injeção.

Diluir o RNA tampado previamente preparado até uma concentração final de 50 a 200 picogramas de litro de banana com água bidestilada e, em seguida, armazenar em gelo até a microinjeção. Em seguida, prepare a agulha de injeção puxando um capilar de silicato bo usando um extrator de suter ou instrumento similar. Em seguida, sob um microscópio, use uma pinça para quebrar a ponta da agulha em um ângulo para gerar uma forma de pena e preencha a agulha com 0,5 a um microlitro da solução de RNA diluída.

Monte a agulha no micromanipulador O injetor PLI 100 PICO de um sistema médico é usado aqui. Agora, coloque os embriões fertilizados no estágio de uma a quatro células em um prato de plástico contendo 5% fol em 0,1 XMMR. Calibre o volume de injeção para cada nova micropipeta usando um micrômetro radical ou de estágio.

Em seguida, defina o injetor pico para fornecer a quantidade desejada de RNA para cada injeção. Aqui, um volume de injeção de um nanolitro é usado. Segure os embriões com uma pinça ou, se preferir, coloque em uma plataforma de retenção e injete o volume desejado nos blasters de animais.

Distribua as injeções em vários locais ao longo do embrião para obter uma distribuição uniforme de RNA. Uma a duas injeções são feitas em cada blaster para um embrião de estágio de quatro células, enquanto duas a quatro injeções são usadas para um embrião de estágio de duas células. Após as injeções, transfira os embriões injetados para um prato de plástico contendo 0,1 XMMR e deixe-os se desenvolver até os estágios 20 a 23.

Dependendo da velocidade de desenvolvimento desejada, os embriões são incubados a uma temperatura de 14 a 22 graus Celsius revestir placas de cultura tratadas com PLL com 10 microgramas por mililitro de laminina em PBS e colocar as placas a 37 graus Celsius por uma hora. Decorrido o tempo de incubação, lave as placas três vezes com PBS, tomando cuidado para não deixar a superfície revestida com laminina ficar exposta ao ar após a lavagem final. Substitua o PBS por meios de cultura.

Por fim, prepare três pratos revestidos com agros, revestindo o fundo de um prato cultivado com 1%aros em 0,1 XMMR e deixando-o endurecer. Uma vez endurecido, encha uma placa com a variabilidade do meio de steinberg na expressão do mRNA injetado pode fazer com que os embriões exibam um mosaico de fluorescência antes de realizar dissecações. Rastreie os embriões quanto à presença de fluorescência e identifique os embriões que expressam a proteína de fusão fluorescente no tubo neural.

Em seguida, transfira os embriões fluorescentes nos estágios 20 a 23 para o prato de plástico revestido com agros contendo a mídia de Steinberg. Coloque o prato sob um microscópio de dissecação e use uma pinça fina para remover a membrana vitelina. Então, enquanto uma pinça segura o embrião no lugar, use a segunda para fazer uma incisão na lateral do embrião e expor o interior oco.

Em seguida, use os dois conjuntos de pinças para beliscar o tecido entre as metades dorsal e ventral do embrião para cortar o embrião ao meio e isolar a porção dorsal que contém o tubo neural. Coloque a explanação do X dorsal em um tubo de microcentrífuga contendo dois miligramas por mililitro, colagenase em meio de Steinberg e coloque em um rotador por 15 a 20 minutos. Em seguida, transfira o explanante dorsal para um prato agro revestido cheio de meios de steinberg frescos.

Enquanto trabalha sob o microscópio, disseque o tubo neural da epiderme dorsal e do Noor ventral, deslizando a ponta da pinça entre a epiderme e o tecido subjacente e puxando lentamente a epiderme para trás. Em seguida, use uma pinça para segurar o tecido e outra para remover o tecido ao redor do tubo neural. Em seguida, transfira o tubo neural dissecado para um prato revestido com agros cheio de meios de cultura frescos.

Depois que vários tubos neurais forem coletados, você afia agulhas ou pinças de tungstênio para cortar cada tubo em cerca de 20 pedaços. Em seguida, coloque os pedaços nas placas de cultura revestidas com laminina, espalhando as berinjelas uniformemente em fileiras. Depois de banhar os tubos neurais, os pratos não devem ser movidos, pois isso perturbará a fixação das células.

Incube a explicação do tubo neural banhado a 20 a 22 graus Celsius. Uma incubadora de cultura de células não é necessária para a cultura de neurônios XUS lavis 12 a 24 horas após o plaqueamento de neurônios de imagem e cones de crescimento à temperatura ambiente. Lembre-se de que a expressão variável de RNA pode resultar em uma faixa de níveis de fluorescência entre os cones de crescimento.

Esta imagem DIC mostra axônios e neuritos crescendo fora da explicação X no canto superior esquerdo do campo de visão. A barra de escala nesta imagem e nas imagens a seguir representa 10 mícrons. Este filme de maior ampliação mostra o cone de crescimento na ponta de um axônio em crescimento.

Finalmente, este filme de microscopia de fluorescência mostra a expressão de EB um GFP em um cone de crescimento. Enquanto aqui, fornecemos o exemplo de imagem, a proteína de fusão de ponta positiva EB uma GFP. Este método de explante neural pode ser aplicado a qualquer número de proteínas para elucidar seus comportamentos dentro do cone de crescimento durante o crescimento de neuritos.