Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

O objetivo geral deste procedimento é comparar a composição de polímeros da parede celular em uma ampla variedade de plantas ou tipos de tecidos utilizando microarranjos de glicanos. Primeiro, colete os tecidos vegetais de interesse. Após a homogeneização, prepare os resíduos insolúveis em álcool.

Em seguida, extraia sequencialmente os glicanos da parede celular usando CDTA e hidróxido de sódio. Depois imprima os extratos de glicanos da parede celular em um microarranjo utilizando um robô. Processe os microarranjos com anticorpos monoclonais direcionados aos glicanos da parede celular e quantifique os sinais dos pontos nos microarranjos.

No final, os resultados podem ser utilizados para determinar a abundância relativa de epítopos de glicanos em um conjunto de amostras de interesse. Desenvolvemos este método de microarranjo quando reconhecemos a necessidade de obter uma visão global da ocorrência de glicanos da parede celular em diversos tipos de tecidos vegetais simultaneamente e detectar diferenças composicionais. Assim, a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos tradicionais, como a análise de monossacarídeos, é que se trata de uma plataforma baseada em microarranjo na qual centenas de amostras podem ser analisadas simultaneamente. Este é um método rápido e abrangente para o perfilamento da composição da parede celular. Para cada tecido de interesse, inicie com amostras em triplicata de 100 miligramas de peso fresco dos tecidos vegetais, utilizando nitrogênio líquido.

Homogeneíze as amostras até obter um pó fino, depois transfira o homogenato para tubos cónicos plásticos de 10 mililitros para preparar o material da parede celular. Ressuspenda o homogenato em 10 mililitros de etanol a 80% à temperatura ambiente e vortexe vigorosamente durante dois minutos. Centrifugue as amostras a 3.500 × g e descarte o sobrenadante.

Repita as lavagens com etanol 70% pelo menos três vezes ou até que o sobrenadante fique claro. Em seguida, realize uma lavagem final com acetona 100%. Colete os resíduos insolúveis em álcool e seque ao ar durante a noite para obter um pó fino e homogêneo. Peneire as amostras de resíduo insolúvel em álcool com uma malha de 0,4 milímetros quadrados.

Em seguida, pese 10 miligramas das amostras de resíduo insolúvel em álcool em tubos microcentrífugos que contenham uma esfera de vidro de três milímetros para homogeneização. Para a extração de pectinas e polímeros associados às pectinas, adicione 500 microlitros de CDTA 50 milimolar a cada amostra, vortexe brevemente os tubos e, em seguida, homogeneíze-os utilizando o tissue izer durante três horas a oito hertz. Centrifugue as amostras a 12.000 × g.

Remova cuidadosamente os sobrenadantes e armazene a quatro graus Celsius. Lave os pellets duas vezes com um mililitro de água deionizada. Remova todo o líquido dos tubos do pellet restante de parede celular.

Prossiga com a extração de glicanas de ligação cruzada usando 500 microlitros de hidróxido de sódio quatro molar com 0,1% de hidreto de sódio. Utilizando o processo de extração descrito anteriormente, armazene os sobrenadantes contendo glicanas de ligação cruzada a quatro graus Celsius. Lave os pelétulos duas vezes com água desionizada.

Em seguida, utilizando 500 microlitros de Cain. Extraia polímeros residuais, como celulose, por centrifugação, e recolha os sobrenadantes contendo os polímeros da parede celular extraídos para remover qualquer material particulado. Em seguida, carregue 50 microlitros de cada amostra em uma placa de microtitulação de 384 poços em polipropileno, usando um layout personalizado previamente projetado no qual as amostras são organizadas de acordo com o tipo de tecido e o tipo de extração.

Em seguida, dilua as amostras de polímeros da parede celular com água desionizada para preparar diluições seriadas de cinco e 25 vezes. Defina parâmetros como altura do pino, coleta e tempo de permanência e etapas de lavagem para o microarranjo. Controle a umidade da câmara de impressão em 60% para prevenir a evaporação da amostra.

Agora inicie a impressão. O robô utiliza pinos de canal capilar para imprimir soluções da placa de amostra sobre uma membrana de celulose nitrosa fixada a uma placa plana na máquina. Cada ponto na matriz contém 15 nanolitros de solução e é impresso em triplicata.

Imprima microarranjos idênticos lado a lado na membrana e corte-os em arranjos individuais. Para reduzir a ligação não específica, bloquee cada microarranjo em solução de 5% de leite em pó desnatado, por duas horas, à temperatura ambiente.

Adicione os anticorpos monoclonais específicos para glicanos da parede celular, epítopos, e incube por duas horas. Agora, para remover a ligação inespecífica, lave as micromatrizes três vezes em PBS por cinco minutos. Em seguida, sonda as micromatrizes com anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano silvestre por duas horas após três lavagens em PBS de cinco minutos.

Desenvolva as micromatrizes utilizando substratos cromogênicos ou quimioluminescentes. Digitalize as micromatrizes individuais usando um scanner de mesa de alta resolução. Salve as imagens como arquivos TIFF negativos de 16 bits.

Calcule a intensidade integral de cada ponto utilizando um software de processamento de imagens equipado com uma ferramenta de grade automatizada. Em seguida, exporte os dados da grade de cada micromatriz como um arquivo de texto. Importe manualmente o arquivo de dados para uma planilha do Excel para análise.

Calcule a média da intensidade integral do ponto entre as réplicas de impressão e diluições para obter um valor de intensidade média do ponto para cada amostra. Represente graficamente as intensidades médias relativas entre diferentes amostras como um mapa térmico utilizando formatação condicional no Excel ou um gerador de mapas térmicos online. Ferramentas para remover o sinal de fundo e falsos positivos para cada tipo de anticorpo, corrigir os dados para 100 e aplicar um valor de corte de 5%.

Utilizou-se a análise abrangente por microarranjo de polímeros para medir a abundância relativa de glicanos em seis tipos de tecidos: filamentos estaminais, grãos de pólen, ovários, pétalas, estiletes e estigmas de nicotiana. Em grande parte das flores analisadas, o microarranjo foi sondado com o anticorpo monoclonal JIM cinco, específico para um epítopo em polissacarídeos pécticos. Observe que o epítopo JIM cinco é detectado em extratos CDTA de todos os tecidos florais.

No entanto, é mais alta no pólen e mais baixa no tecido estigmático. Curiosamente, o epítopo JIM cinco também é detectado nos extratos de hidróxido de sódio do pólen, mas não nos de outros tecidos. Informações quantitativas são obtidas pela geração de curvas padrão dos diferentes polissacarídeos purificados que foram processados como padrões internos na microplaca em tecido de ovário.

Presente em cada amostra, aproximadamente 157 microgramas de hoog contendo o epítopo JIM cinco correspondiam a cerca de 1,5% dos resíduos totais da parede celular, enquanto 625 microgramas de hoog Ronin contendo o epítopo JIM cinco estavam presentes no tecido do pólen, correspondendo a aproximadamente 6,25% do resíduo total da parede celular. A abundância relativa de 15 epítopos de glicanos em todos os tipos de tecidos é resumida em um mapa de calor. A intensidade das barras de cor é proporcional à intensidade média ajustada do sinal para cada amostra.

Uma representação pictórica desses dados permite uma interpretação rápida das diferenças na ocorrência de epítopos de glicanos entre os diferentes tecidos florais. Esses resultados indicam que epítopos de glicanos individuais estão distribuídos de maneira única entre diversos tipos de flores. Por exemplo, o epítopo LM 13 é mais abundante nos filamentos anteriores e nos tecidos SE L em comparação com outros tecidos.

Esse padrão é fortemente contrastante com o dos epítopos de cadeia mais curta, preferencialmente detectados pelo MAB LM seis. Glicanos de ligação cruzada também apresentam padrões distintos de ocorrência em diversos tipos de flores. Por exemplo, o epítopo LM 10 é abundante no tecido do estigma em comparação com outros tecidos, mas está ausente no tecido do ovário.

Os epitopos de glicanos LM 15 xog são mais altos em pétalas e filamentos de antera em comparação com outros tecidos, enquanto os heteromananos são mais abundantes nos filamentos de antera. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como extrair e determinar a abundância relativa de glicanos da parede celular em uma ampla gama de plantas e tipos de tecidos. Usando microarranjos, uma vez dominada a técnica, ela pode ser concluída em três dias.

É importante lembrar de tratar as amostras e réplicas de maneira consistente em cada etapa após este procedimento. Outros métodos, como ensaios com ácido acético-nítrico, podem ser realizados para investigar questões adicionais. Por exemplo, qual é o teor absoluto de celulose remanescente após a extração sequencial de pectinas e hemiceluloses usando CDTA e hidróxido de sódio?

Esta técnica possui ampla aplicabilidade na área da biologia celular vegetal para comparar rapidamente a ocorrência de glicanos em plantas modelo, como Arabidopsis e Fisca, Nutella, bem como em outras, como algodão, trigo, eucalipto e tabaco.