Name: Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a drenagem manual do líquido cefalorraquidiano embrionário de ventrículos cerebrais de zebrafish para estudar o papel do LCR no desenvolvimento neural e análise de fatores por espectrometria de massas.

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Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Um agradecimento especial ao Dr. Jen Gutzman, Amanda Dr. Dickinson e outros membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e Olivier Paugois para criação de peixes especialista.

1. Preparando agulhas microinjeção e Bonde celular <ol><li> Encha Eppendorf CellTram óleo aparelho microinjector com óleo mineral de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos. </li><li> Montar a agulha na micromanipulador Eppendorf CellTram conectado. </li><li> Parta cuidadosamente a ponta da agulha. Para tamanho da ponta uniforme, medir com um micrômetro, ou comparar a uma agulha de referência. </li><li> Encher o comprimento da agulha com óleo, usando o CellTram para empurrar para baixo o comprimento de petróleo, tendo o cuidado para evitar as bolhas. </li></ol> 2. Preparando os embriões <ol><li> Criar buracos em uma placa de agarose a 1%, revestida com uma ponta de pipeta de 1-200 uL, e remover tampões de agarose. Preencha prato com media de embriões (feita de acordo com Westerfield 25). </li><li> Utilizando uma pinça, embriões dechorionate sob estereomicroscópio. </li><li> Transferência de embriões dechorionatedem agarose prato revestido. </li><li> Para anestesiar os embriões, adicionar tricaina (0,1 mg / ml) ao prato de agarose até embriões parar de se mover (feito de acordo com Westerfield 25). </li></ol> 3. Drenagem do eCSF <ol><li> Orientar os embriões com as caudas dos orifícios da agarose e os seus lados posteriores mais próximos do micromanipulador, permitindo a visualização do lado dorsal do cérebro. </li><li> Posicionar a agulha no rhombomere 0/1 dobradiça-ponto ou ponto mais largo do cérebro posterior esquerdo (Figura 1A). </li><li> Cuidadosamente placa telhado perfurar do ventrículo rombencéfalo tendo a certeza de não passar a profundidade do cérebro para a gema. </li><li> Drenar o eCSF usando o CellTram e recolher fluido na agulha de microinjecção. Tenha cuidado para evitar quaisquer células. </li></ol> 4. Coletar a eCSF para análise de composição <ol><li> Uma vez que o eCSF é recolhida na agulha, cuidadosamente parar de aspiração do CellTram. </li><li> Move o prato para fora sob a agulha e posicionar a agulha com cuidado para um tubo que contém o tampão desejado. </li><li> Usando o CellTram, drenar o eCSF para fora da agulha para o buffer de tentar evitar a contaminação da solução com óleo. </li><li> A fim de eliminar as células que tenham aspirado juntamente com o, eCSF rotação eCSF a 10.000 x g. Colete contaminada eCSF (sobrenadante) e armazenar a -80 ° C até estar pronto para análise posterior. </li></ol> 5. Reintrodução de fatores selecionados <ol><li> Drenar o eCSF cada 2 horas durante o intervalo de tempo desejado, uma vez que o líquido é alimentado dentro desse período de tempo. Entre os pontos de tempo de drenagem, retire a agulha e armazenar os embriões a 28,5 ° C ou a temperatura desejada. </li><li> Carregar agulha micropipeta segundo com factor de teste. </li><li> Agulha lugar em micromanipulador ligado a microinjetor. </li><li> Ajustar o volume de injecção de 1 nl medindo o tamanho da gota de óleo e ajustamento do tempo de injecção e pressure. </li><li> Injetar 1-2 NL em ventrículos cerebrais, como descrito anteriormente 26. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A utilização desta técnica para drenar manualmente eCSF de ventrículos cerebrais zebrafish será útil para a determinação da exigência de eCSF durante o desenvolvimento. Além disso, esta técnica permite a descrição do perfil proteico eCSF ao longo do desenvolvimento embrionário. Identificação de proteínas diferentes durante este tempo irá permitir uma investigação mais aprofundada sobre a função do LCR e o seu papel potencial durante o desenvolvimento do cérebro. No amniotas, alguns factores identificados no eCSF (IGF2, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Eppendorf CellTram óleo </td><td> Eppendorf </td><td> 516 000.025 </td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td></tr><tr><td> Tricaina pó </td><td> Sigma </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Tubos capilares </td><td> FHC Inc. </td><td> 30-30-1 </td></tr></tbody></table>

drenagem manual dos zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contidas dentro dos ventrículos do cérebro. Encontra-se presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e persiste durante toda a vida. Adulto CSF é pensado para amortecer o cérebro, remover resíduos, e proceder secretado 1,2 moléculas. No embrião de adultos e mais velhos, a maioria dos CSF é feita pelo plexo coróide, uma série de regiões altamente vascularizadas secretoras colocadas junto dos ventrículos do cérebro 3-5. No peixe-zebra, o plexo coróide está completamente formado a 144 horas pós-fertilização (hpf) 6. Antes disso, em embriões de vertebrados tanto peixe-zebra e outros, incluindo ratinho, uma quantidade significativa de embrionário CSF ​​(eCSF) está presente. Estes dados e os estudos em pintainho sugerem que o neuroepitélio é secretória precoce no desenvolvimento e pode ser a fonte principal de eCSF antes do desenvolvimento do plexo coróide 7. eCSF contém cerca de três vezes mais proteína than adulto CSF, sugerindo que pode desempenhar um papel importante durante o desenvolvimento 8,9. Os estudos realizados em pintos e de rato demonstram que os factores secretados no eCSF, a pressão do fluido, ou uma combinação destes, são importantes para a expressão do gene neurogenesis sobrevivência, a proliferação de células, e células, no neuroepitélio 10-20. Análises proteômicas de rato, humano, mouse e eCSF garota identificaram muitas proteínas que possam ser necessárias para a função LCR. Estes incluem componentes da matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulam a pressão osmótica, e proteínas envolvidas na morte celular e proliferação 21-24. No entanto, as funções complexas do eCSF são largamente desconhecidos. Desenvolvemos um método para a remoção de eCSF ventrículos cerebrais zebrafish, permitindo assim a identificação de componentes eCSF e para a análise do requisito eCSF durante o desenvolvimento. Embora mais eCSF podem ser coletadas de outros vertebrados sistemas wom embriões maiores, eCSF podem ser coletadas desde os primeiros estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, e sob condições genéticas ou ambientais que levam ao volume anormal do cérebro ventrículo ou morfologia. Remoção e recolha de eCSF permite a análise de espectrometria de massa de inquérito, de função eCSF, e reintrodução de factores seleccionados para os ventrículos para ensaiar a sua função. Assim, a acessibilidade do embrião do peixe-zebra precoce permite a análise detalhada da função eCSF durante o desenvolvimento.

Um exemplo de um ventrículo cerebral drenado é mostrado na Figura 1B, C-. Ventrículos cerebrais são recolhidos como falta eCSF (Figura 1B vs C). Como se vê nas imagens dorsal (Figura 1B-C, e A Figura 2A-D) do neuroepitélio rombencéfalo retém a sua morfologia característica e parece ser aberta, apesar da falta de eCSF provavelmente devido à robustas dobradiças-pontos. No entanto, vistas laterais (Figura 2A&#39;-D &quot;) demonstram que o...

Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.

Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contido nos ventrículos cerebrais. Ele está presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e...

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema que careça de líquido céfalo-raquidiano ou LCR dentro do sistema ventricular cerebral embrionário. Isso é realizado primeiramente drenando manualmente o LCR embrionário ou LCRE dos ventrículos cerebrais de peixe-zebra. Em seguida, o LCRE é coletado para análise adicional do seu conteúdo.Então, fatores potenciais são reintroduzidos nas ventrículos cerebrais drenados. Por fim, analisa-se a remoção eficaz do LCE e a reintrodução de fatores no desenvolvimento cerebral. Em última instância, a função do LCE de peixe-zebra pode ser demonstrada mediante o monitoramento de aspectos do desenvolvimento cerebral, como divisão celular, morte celular e neurogênese.Além disso, o conteúdo do LCE pode ser determinado por espectrometria de massa. Com esta técnica, podemos começar a estudar a função do líquido cefalorraquidiano embrionário durante o desenvolvimento. Ela também pode ser aplicada a outros sistemas para melhor compreender doenças que alteram a composição e os volumes do LCR, como a hidrocefalia.Para começar, preencha um aparelho injetor de óleo com óleo mineral de acordo com as instruções do fabricante. Após puxar as agulhas de micr

manual-drainage-of-the-zebrafish-embryonic-brain-ventricles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste vídeo, demonstramos um método pelo qual para analisar o cérebro em desenvolvimento em embriões vertebrados zebrafish viver em resolução única célula por microscopia confocal. Isso inclui o método pelo qual injetamos o embrião do zebrafish de uma única célula e, posteriormente, montar e imagem do cérebro em desenvolvimento.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.

Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Nós descrevemos uma medição animal vivo todo quantitativa para a permeabilidade do cérebro de zebrafish embrionário. A técnica de análise da capacidade de retenção de fluido cerebrospinal e moléculas de diferentes pesos moleculares no interior do lúmen do tubo neural e quantifica o seu movimento para fora dos ventrículos. Este método é útil para a determinação de diferenças de permeabilidade epitelial e maturação durante o desenvolvimento e na doença.

Um ensaio para a permeabilidade do neuroepitélio Zebrafish Embryonic

Este vídeo descreve a técnica de microdissecção do cérebro de um peixe-zebra adulto. Este método ajuda na obtenção de neurosferas derivadas de todo o cérebro que podem ser estudadas mais a fundo.

Dissecção do cérebro do peixe-zebra: uma técnica de neurobiologia de peixes

Este vídeo demonstra a geração e diferenciação de neuroesferas primárias. As células-tronco neurais do peixe-zebra, na presença de fatores de crescimento, proliferam em neuroesferas flutuantes com capacidade de auto-renovação, que mais tarde se diferenciam em células gliais e neurônios.

Geração e Diferenciação de Neuroesferas Primárias a partir de Células-Tronco Neurais de Peixe-Zebra

Fonte: Schramm, P. et al. Imagem in vivo de tecido cerebral totalmente ativo em larvas e juvenis de peixe-zebra acordados por remoção de crânio e pele. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a imagem in vivo de neurônios cerebelares em larvas transgênicas de peixe-zebra, que expressam proteínas fluorescentes em neurônios de Purkinje. O processo envolve anestesiar as larvas, imobilizá-las em agarose e remover cuidadosamente a pele pigmentada para aumentar a penetração da luz e a intensidade da...

Imagem in vivo do cérebro larval de peixe-zebra para visualização de neurônios cerebelares

Imagem do desenvolvimento vascular cerebral em zebrafish larval é descrito. Técnicas para facilitar a imagens 3D e modificar o desenvolvimento vascular cerebral utilizando tratamentos químicos também são fornecidos.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Aprenda a drenagem manual do líquido cefalorraquidiano embrionário de ventrículos cerebrais de zebrafish para estudar o papel do LCR no desenvolvimento neural e análise de fatores por espectrometria de massas.

Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias

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