Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método flexível de reengenharia de superfícies virais por meio da química click. Na primeira etapa deste procedimento, células renais embrionárias humanas são infectadas com o adenovírus tipo cinco e incubadas na presença do aminoácido não natural ácido homoalanina ou do açúcar acetilado N-acetoacetil glicosamina. Após dois dias, as partículas de adenovírus marcadas com azida são coletadas e purificadas.

Em seguida, a cicloadição azida-ino específica é utilizada para ligar sondas fluorescentes à superfície dessas partículas. Conforme explicado no protocolo escrito, isso é realizado usando um dos dois métodos de ligação possíveis: por promoção de tensão ou catalisado por cobre.

Em aplicações terapêuticas, esses acoplamentos podem incluir polipeptídeos, polímeros ou moléculas pequenas. Neste experimento, utiliza-se uma sonda fluorescente para demonstrar a ligação da sonda às proteínas do capsídeo por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Há grande interesse no desenvolvimento de vírus como agentes de entrega gênica, particularmente no contexto de terapêuticas, entrega gênica, terapia oncolítica e tecnologia de vacinas.

Nesse contexto, ajustar a interface vírus-hospedeiro é particularmente importante em termos de obter as propriedades apropriadas para o estímulo imunológico direcionado ao tecido terapêutico. Uma série de outros fatores é importante em termos de ajustar a interface vírus-hospedeiro. Nesse contexto, desenvolvemos um protocolo de marcação em duas etapas.

O primeiro passo é a introdução metabólica de um aminoácido não natural ou açúcar não natural. Isso instala um ponto de ancoragem que podemos então ampliar com químicas extremamente seletivas, permitindo que anexemos a esses vírus essencialmente qualquer funcionalidade desejada, sem perturbar significativamente o vírus, sua infectividade ou aptidão geral, o que representa uma grande barreira, um grande obstáculo a superar. Após esterilizar a cabine e os equipamentos de laboratório, prepare 11 placas de cultura de 100 milímetros com células HEK 293 mantidas em meio de crescimento para HEK a 37 °C.

Após a cultura celular atingir 80 a 90% de confluência, remova o meio de crescimento de um dos recipientes e lave uma vez com tampão TD. Solte as células com um mililitro de tripsina-EDTA e incube por um minuto. Adicione nove mililitros de meio de crescimento e conte o número de células colhidas neste recipiente.

Usando um citômetro de hemácias, calcule o número de partículas de adenovírus necessárias para infecção em cada um dos 10 pratos de cultura restantes. Remova lentamente o meio de crescimento, depois lave com cinco mililitros de tampão TD. Adicione um mililitro de tampão de infecção e incube por uma hora durante este período.

Agite suavemente as placas de um lado para o outro a cada 15 minutos após a infecção. Adicione cuidadosamente nove mililitros de meio de crescimento para HEK a cada placa e incube por mais 18 horas. A partir de soluções estoque concentradas de uma HA em Sistine.

Prepare um meio de marcação com HA de acordo com o protocolo escrito. Certifique-se de filtrar primeiro essas soluções estoque com um filtro de seringa de 0,2 micrômetros. Esterilize a solução estoque de metionina para o controle da mesma maneira e remova cuidadosamente o meio de crescimento, lavando cada placa de cultura com cinco mililitros de tampão TD.

Substitua isso por 10 mililitros de um meio de marcação com HA e incube as células infectadas por mais seis horas. As proteínas do capsídio viral serão traduzidas na presença de azo homo alanina e na ausência de metionina. Substitua cuidadosamente o meio de marcação por 10 mililitros de meio de crescimento fresco e incube por mais 18 horas.

Após a conclusão desta etapa, prossiga para o procedimento de purificação na etapa três do vídeo. Alternativamente, as marcas azi podem ser introduzidas por meio de açúcares contendo azi em vez do aminoácido não natural a HA. Neste protocolo, o precursor metabólico do parasita N-acetoacetil galactosamina, um precursor metabólico do UDPN-acetoacetil, é utilizado; o glucosamina é cultivado na presença desse açúcar aceto.

O adenovírus do tipo cinco apresentará grupos azi apenas na fibra para realizar a marcação com açúcar. Primeiro, siga o passo um do vídeo até a solicitação na tela. Isso corresponde ao passo 1,5 do protocolo escrito.

Prepare a solução de marcação com açúcar pipetando primeiro 100 microlitros da solução estoque de açúcar ATO em tubos tipo Falcon e deixando o metanol evaporar. Em seguida, adicione 100 mililitros do meio de crescimento para HEK. Cubra as células em cada placa com 10 mililitros deste meio de marcação com açúcar e incube a 37 graus Celsius por 44 horas.

Prossiga para a etapa três para purificação. Transfira o meio juntamente com as células infectadas da placa de cultura para dois tubos cónicos e centrifugue a 2000 G durante 10 minutos. A quatro graus.

Remova o sobrenatante e re-suspenda cada pellet em quatro mililitros de tampão TD usando nitrogênio líquido em um banho a 37 graus. Realize três ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células infectadas. Misture a suspensão com um vórtex entre cada ciclo.

Centrifugue a suspensão descongelada a 2000 G durante 10 minutos para precipitar os detritos celulares, pois o adenovírus utilizado para infecção na etapa um continha um transgene GFP cuja atividade fluorescente nessa etapa confirma a transdução e expressão do DNA viral. Prepare cuidadosamente um gradiente de densidade de cloreto de césio de 1,25 gramas por mililitro a 1,4 gramas por mililitro. Aplique o sobrenadante celular lisado sobre o gradiente de densidade e centrifugue a 126.000 G por uma hora a 15 graus Celsius.

Após a centrifugação, uma faixa espessa e larga deve estar presente no tubo de centrífuga. Esta é a amostra de vírus modificado com azi. Usando uma agulha esterilizada, fure a parte inferior do tubo para que o conteúdo escorra gota a gota; colete cuidadosamente este vírus.

A banda dos dois métodos de ligação demonstrou a deformação. O método promovido envolve condições de reação mais simples, mas apresenta a desvantagem de uma seleção mais limitada de sondas comercialmente disponíveis para realizar a ligação promovida por deformação. Misture 50 microlitros de vírus modificado com azi no tampão de armazenamento de vírus com 0,25 microlitros da solução de marcação Tamara BCN, misturando batendo na parte inferior da tampa do tubo com folha de alumínio e gire durante a noite à temperatura ambiente.

Purifique o vírus por meio da filtração em gel por centrifugação. Gire as colunas equilibradas com o tampão de armazenamento do vírus. A reação de cicloadição catalisada por cobre desoxigenado apresenta maior disponibilidade de sondas, mas tem a desvantagem de exigir equipamentos especializados para manter uma atmosfera desoxigenada.

Para realizar a ligação catalisada por cobre. Primeiro, desoxigene todos os materiais e soluções da reação em uma câmara de gás inerte com nitrogênio por seis horas. Após esse período, prepare a solução estoque do catalisador de cobre I dentro da câmara de gás inerte para iniciar a reação. Adicione um microlitro dessa solução estoque de cobre a uma solução de 50 microlitros contendo a sonda viral e o agente quelante.

Deixe a reação de marcação prosseguir durante a noite dentro da câmara de luvas. Purifique por filtração conforme no passo quatro. Após fervura, purifique o vírus submetido à reação "click" e adicione o tampão amostral por 10 minutos.

Carregue os poços com o vírus clicado e os controles e realize a eletroforese. Mantenha o tanque coberto com papel alumínio para proteger a sonda fluorescente da luz. Após uma hora, use um leitor de géis fluorescentes para escanear o gel.

Observe que vírus intactos ou não marcados com I não devem deslocar marcação fluorescente significativa para uma HA, marcando os vírus produzidos em maior concentração de uma HA, demonstrando maior marcação fluorescente devido a um grau mais elevado de incorporação de HA. Observe também que o vírus marcado com açúcar expressa apenas etiquetas azi na proteína da cápside do fibro. A partir de células com 80% de confluência, considere dois dias para infecção na marcação com azi, cinco horas para coleta e purificação do vírus marcado, uma noite para a reação *click* e duas horas para análise por SDS-PAGE, totalizando três dias e meio. Em resumo, dois tipos de métodos de marcação com azi e duas reações de química *click* azida-alcino foram demonstrados.

Seu aplicativo e recursos devem determinar qual método ou métodos são mais adequados para sua finalidade. Embora todos os materiais deste protocolo estejam disponíveis comercialmente, verificamos que a síntese de açúcares de HA acetilados e de sondas INE é significativamente mais econômica e oferece maior flexibilidade nas modificações da superfície do vírus.