Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método flexível de reengenharia de superfícies virais por meio da química do clique. Na primeira etapa deste procedimento, as células renais embrionárias humanas são infectadas com adenovírus tipo cinco e incubadas na presença do ácido aminoácido não natural ou homo alanina ou do parasita aceto açúcar N acetoacetil glucosamina. Após dois dias, as partículas de adenovírus marcadas com azida são colhidas e purificadas.

Em seguida, a edição ciclográfica Azi Aine específica para quimioterapia é usada para ligar sondas fluorescentes à superfície dessas partículas. Conforme explicado no protocolo escrito, isso é realizado usando um dos dois métodos de ligadura possíveis, cepa promovida ou cobre. Uma edição catalisada do ciclo azida.

Em aplicações terapêuticas, esses anexos podem incluir polipeptídeos, polímeros ou pequenas moléculas. Neste experimento, uma sonda fluorescente é usada para que a ligação da sonda nas proteínas do capsídeo possa ser demonstrada via página SDS. Há um interesse significativo no desenvolvimento de vírus como agentes de entrega de genes, particularmente no contexto de terapêutica, entrega de genes, terapia oncótica, tecnologia de vacinas.

Nesse contexto, ajustar a interface do hospedeiro do vírus é particularmente importante em termos de obter as propriedades apropriadas para esse tecido terapêutico direcionado à estimulação imunológica. Vários outros fatores são importantes em termos de ajuste da interface do vírus do hospedeiro. Nesse contexto, desenvolvemos um protocolo de rotulagem em duas etapas.

O primeiro passo é a introdução metabólica de aminoácidos não naturais ou açúcar não natural. Isso instala um ponto de ancoragem que podemos elaborar ainda mais com produtos químicos muito, muito seletivos que podemos anexar esses vírus com essencialmente qualquer funcionalidade que gostaríamos sem perturbar significativamente o vírus, a infectividade ou a aptidão geral, que é uma barra importante, um grande obstáculo a ser superado. Depois de esterilizar a coifa e o equipamento de laboratório, prepare 11 placas de cultura de 100 milímetros de células HEK 2 93 mantidas em meio de crescimento HEK a 37 graus Celsius.

Depois que a cultura de células se tornar 80 a 90% confluente, remova o meio de crescimento de um dos pratos e lave uma vez com tampão TD. Afrouxe as células com um mililitro de tripsina EDTA e incube por um minuto. Adicione nove mililitros de meio de crescimento e conte o número de células colhidas neste prato.

Usando um hemocitômetro, calcule o número de partículas de adenovírus necessárias para a infecção para cada uma das 10 placas de cultura restantes. Remova lentamente o meio de crescimento e lave com cinco mililitros de tampão TD. Adicione um mililitro de tampão de infecção e incube por uma hora durante este período.

Agite suavemente a louça de um lado para o outro a cada 15 minutos após a infecção. Adicione cuidadosamente nove mililitros de crescimento HEK, médio a cada prato, e incube por mais 18 horas. A partir de soluções concentradas de estoque de um HA em Sistina.

Prepare o meio de rotulagem HA de acordo com o protocolo escrito. Certifique-se de filtrar primeiro essas soluções de estoque com um filtro de seringa estilo 0,2 micrômetro. Esterilizar a solução-mãe de metionina para o controlo da mesma forma, remover cuidadosamente o meio de crescimento e lavar cada placa de cultura com cinco mililitros de tampão TD.

Substitua isso por 10 mililitros de um meio de marcação de HA e incube as células infectadas por mais seis horas. As proteínas virais do capsídeo serão agora traduzidas na presença de azo homo alanina e ausência de metionina. Substitua cuidadosamente o meio de rotulagem por 10 mililitros de crescimento fresco, meio e incube por mais 18 horas.

Após a conclusão desta etapa, prossiga para o procedimento de purificação na etapa três do vídeo. Alternativamente, as marcas azi podem ser introduzidas por meio de azi contendo açúcares em vez do aminoácido não natural HA.In este protocolo, o parasita relacionado ao n acetoacetil galacto um precursor metabólico do UDPN acetoacetil. A glucosamina é usada, cultivada na presença desse açúcar aceto.

O adenovírus tipo cinco apresentará grupos azi apenas na fibra para realizar a marcação de açúcar. Primeiro, siga o primeiro passo do vídeo até o prompt na tela. Isso corresponde à etapa 1.5 do protocolo escrito.

Prepare a solução de rotulagem de açúcar pipetando primeiro 100 microlitros de solução de estoque de açúcar ATO em tubos Falcon e permitindo que o metanol evapore. Em seguida, adicione 100 mililitros de meio de crescimento HEK. Cubra as células de cada prato com 10 mililitros deste meio de rotulagem de açúcar e incube a 37 graus Celsius por 44 horas.

Prossiga para a etapa três para purificação. Transferir o meio juntamente com as células infectadas da placa de cultura para dois tubos cónicos e centrifugar a 2000 G durante 10 minutos. A quatro graus.

Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em quatro mililitros de tampão TD usando nitrogênio líquido em um banho de 37 graus. Execute três ciclos de congelamento e descongelamento para eliminar as células infectadas. Misture a suspensão com um vórtice entre cada ciclo.

Centrifugue a suspensão de descongelamento a 2000 G por 10 minutos para precipitar os detritos celulares, pois o adenovírus usado para infecção na etapa um, continha uma atividade fluorescente do transgene GFP nesta etapa confirma a transdução e expressão do DNA viral. Prepare cuidadosamente um gradiente de densidade de cloreto de césio de 1,25 gramas por mililitro a 1,4 gramas por mililitro. Pipear a supernatin de células lisadas sobre o gradiente de densidade e centrifugar a 126 000 g durante uma hora a 15 graus Celsius.

Após a centrifugação, uma faixa larga e grossa deve estar presente no tubo da centrífuga. Este é o vírus modificado azi. Usando uma agulha estrela L, perfure o fundo do tubo para que o conteúdo coe gota a gota colete cuidadosamente esse vírus.

A banda dos dois métodos de ligadura demonstrou a tensão. A rota promovida envolve condições de reação mais simples, mas tem a desvantagem de uma seleção mais limitada de sondas disponíveis comercialmente para realizar a ligação promovida por cepa. Misture 50 microlitros de vírus modificado azi no tampão de armazenamento de vírus com 0,25 microlitros de solução de rotulagem Tamara BCN misturada batendo na parte inferior da tampa do tubo com papel alumínio e gire durante a noite em temperatura ambiente.

Purifique o vírus do clique usando a filtragem de subgel centris. Colunas giratórias equilibrando com buffer de armazenamento de vírus. A edição de ciclo catalisado de cobre desoxigenado desfruta de maior disponibilidade de sondas, mas tem a desvantagem de exigir equipamentos especializados para manter uma atmosfera desoxigenada.

Para realizar a ligadura catalisada de cobre. Primeiro, oxigene todos os materiais e soluções de reação em um porta-luvas de nitrogênio por seis horas Após esse período, prepare a solução de estoque de cobre e catalisador no porta-luvas para iniciar a reação. Adicione um microlitro desta solução de estoque de cobre a uma solução de 50 microlitros de sonda de vírus e agente quelante.

Deixe a reação de rotulagem prosseguir durante a noite no porta-luvas. Purifique a filtração aceita como na etapa quatro. Após a fervura, purificado, clicado vírus e tampão de amostra laly por 10 minutos.

Carregue os poços com o vírus clicado e os controles e execute a eletroforese. Mantenha o tanque coberto com papel alumínio para proteger a sonda fluorescente da luz. Após uma hora, use um scanner de gel fluorescente para escanear o gel.

Observe que os vírus intactos ou não marcados com I não devem substituir a marcação fluorescente significativa para um HA, rotulando os vírus produzidos na maior concentração de um HA demonstrando maior marcação fluorescente devido a um maior grau de incorporação de HA. Observe também que o vírus marcado com açúcar expressa marcas azi apenas na proteína do capsídeo da fibra A partir de 80% As células de confluência são responsáveis por dois dias para infecção na marcação azi, cinco horas para colheita e purificação do vírus marcado uma noite para a reação de clique e duas horas para análise de página SDS por um total de três dias e meio. Em resumo, dois tipos de métodos de marcação azi e duas reações químicas de clique azid alkin foram demonstrados.

Seu aplicativo e recursos devem determinar qual método ou métodos são mais adequados para sua finalidade. Embora todos os materiais neste protocolo estejam disponíveis comercialmente, descobrimos que a síntese de açúcares aceto HA e sondas INE é significativamente mais econômica e oferece maior flexibilidade nas modificações da superfície do vírus.