Name: Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Aprenda a modificar superfícies virais usando química click bioortogonal com adenovírus tipo 5. Este método permite ligar sondas fluorescentes e aprimorar o direcionamento terapêutico de vetores virais.

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Consulte a Tabela 1 para a preparação de todos os suportes, tampões e soluções referenciadas neste protocolo. 1. Produção de Aha-Rotulado Adenovírus <ol><li> Preparar onze 100-mm pratos de cultura de tecidos de células de rim embrionário humano (HEK 293) mantidas em meio de crescimento HEK 293 célula (ver Tabela 1) a 37 ° C até terem atingido os 80 - 90% de confluência. (Nota:. As culturas com mais de 90% de confluência pode ser difícil de infectar e podem não produzir vírus como desejado) </li><li> Soltar as células em um dos pratos removendo primeiro o meio de crescimento, enxaguamento uma vez com 5 ml de tampão de TD, em seguida, incubando as células durante um min em 1 ml de tripsina-EDTA (1 ×). </li><li> Adicionar 9 ml de meio de crescimento HEK 293 célula, e usar um hemocitómetro para contar o número de células HEK 293 colhida a partir de este prato. Use esse número para calcular a quantidade de adenovírus tipo 5 (Ad5) necessária para a infecção usando um multiplicity de infecção valor (MOI) de 10 PFU / célula. Conta para o facto de, para Ad5 normal, o índice de infecciosidade (razão de partículas infecciosas para o número total de partículas) é tipicamente de 1:20. </li><li> Preparar 10 ml de tampão de infecção. </li><li> Lentamente remover o HEK 293 meio de crescimento de células a partir dos dez pratos de cultura restantes, em seguida, lava-se com 5 ml de tampão de TD. Adicionar 1 ml de tampão de infecção para cada prato e incubar a 37 ° C durante 1 hora. Durante este período de infecção, agite cada lado prato de cultura para o lado de 15 min de intervalo. </li><li> Após a infecção, adicionar 9 ml de meio de crescimento fresco HEK 293 célula e incubar a 37 ° C durante 18 hr. </li><li> Preparar 100 ml de meio de rotulagem Aha (ou Met meio de controlo para o controlo). Certifique-se de filtrar as soluções de concentrados com um filtro de seringa de 0,2 mM estéril antes de preparar os meios de comunicação de rotulagem. </li><li> Cuidadosamente (de modo a não lavar as células infectadas) remover o HEK 293 meio de crescimento celular após 18 hr umnd lavar cada prato de cultura com 5 ml de tampão de TD. </li><li> Remover a solução de lavagem TD tampão e adicionar 10 ml de meio Aha rotulagem para cada prato de cultura. Para um controle, meio de controlo de metionina deve ser utilizado em vez do meio de rotulagem Aha nesta etapa. </li><li> Incubar as células infectadas em meio de rotulagem, a 37 ° C durante 6 hr. Rotulagem pode ser realizada a qualquer momento entre 12-24 hr pós-infecção, mas não deve ser superior a 6 horas de duração. Este intervalo foi determinado para maximizar a sobreposição com a tradução de proteínas virais estruturais, enquanto assegurando a infecciosidade não é significativamente diminuída. 7 </li><li> Cuidadosamente remover o meio de rotulagem de modo a não perturbar as células. Adicionar 10 ml de meio de crescimento fresco HEK 293 células para cada prato e incubar as células a 37 ° C durante outra hora 18. Para minimizar a perda de células infectadas durante este passo, não é necessário para remover a solução de rotulagem inteiramente. O HEK 293 meio de crescimento de células contém um excesso de Met qual irá outcompete qualquer Aha residual. </li><li> Prossiga para a etapa 3 para a purificação. </li></ol> 2. Produção de Adenovirus azido-açúcar-Rotulado <ol><li> Seguir o procedimento intitulado Produção de Adenovírus Aha-Labeled até e incluindo passo 1,5. </li><li> Preparar 100 ml de azido-açúcar meio de rotulagem. </li><li> Cobrir as células com 10 ml de meio fresco rotulagem azido-açúcar e incubar a 37 ° C durante 44 hr. </li></ol> 3. Purificação de azida identificadas partículas adenovirais <ol><li> Remover os meios de comunicação, juntamente com as células infectadas de cada prato de cultura e transferência para tubos cónicos. Centrifugar a 2.000 g durante 10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de TD (usando 8 ml de tampão de TD por 10 pratos). </li><li> Lisar as células infectadas por repetidas (3 ou mais) ciclos de congelamento-descongelamento utilizando um frasco Dewar de azoto líquido e um banho de água a 37 ° C. Centrifugar a 2.000 g durante 10 mina 4 ° C para separar detritos de células a partir do sobrenadante. </li><li> Prepara-se uma densidade de CsCl tubo de centrífuga de gradiente por pipetagem primeira 2,5 ml de solução 1,25 g / ml de CsCl em um tubo de centrífuga Ultra Clear. Em seguida, utilizar uma pipeta com a sua ponta posicionada no fundo do tubo para adicionar lentamente 2,0 ml de 1,4 g / ml de solução de CsCl, tomando cuidado para não perturbar a interface do gradiente. </li><li> Pipetar o sobrenadante do passo 3,2 na parte superior do tubo de gradiente de densidade de CsCl, e se necessário adicionar tampão de TD para encher o tubo. Centrifugar as amostras num rotor balde oscilante em 125.000 g durante 1 hora a 15 ° C em uma ultracentrífuga. </li><li> Após a conclusão da ultracentrifugação, as partículas de vírus deve ser visível como uma banda espessa branca na interface das duas soluções de CsCl. Fazer uma pequena perfuração no fundo do tubo com uma agulha estéril para permitir que a solução escorra gota a gota. </li><li> Coletar a banda espessa e branca, que deve conter os rotulados Ad5 partículas, tomandocuidado para excluir g solução de CsCl em excesso. Evitar recolha proteínas celulares que irá banda acima da camada de vírus. Além disso excluir cápsides de viriões vazios, que formam uma camada mais leve ligeiramente acima da banda de vírus branco espesso. </li><li> Opcionalmente, executar uma purificação final sobre as rotulados Ad5 partículas. Adicionar a fracção recolhida a partir do passo 3,6 para um tubo de ultracentrifuga 4-ml e encher o tubo com 1,35 g / ml de solução de CsCl. Centrifugar a 125.000 g durante 18 hr a 15 ° C, e recolher o banda espessa branca que forma no meio do tubo, tal como descrito nos passos 3.5 e 3.6. (Note-se que se o título virai é baixo, uma faixa branca pode não ser visível após a segunda centrifugação, e não será possível recuperar o vírus rotulada). </li><li> Para o armazenamento das partículas de vírus durante longos períodos de tempo, a diálise do extracto vírus colhido deve ser realizada contra tampão de armazenamento de vírus. Armazenar as amostras de vírus dialisados ​​a -80 ° C. </li></ol> 4. Ligação de partículas adenovirais modificados com Sondas alcino utilizando a estirpe-Promovido cicloadição Azida-alcino (SPAAC) <ol><li> A uma solução de 50 ul de azida de Ad5-modificado em tampão de armazenamento de vírus, adicionar 0,25 ul de solução SPAAC rotulagem. (Consulte a tabela de reagentes para uma lista de vendedores de produtos comercialmente disponíveis alcinos tensas). </li><li> Permitir que a reacção de cicloadição estirpe promovidos-prosseguir durante a noite à temperatura ambiente. Se uma sonda sensível à luz (por exemplo, TAMRA) é usado, cobrir o vaso de reacção com folha de alumínio. </li><li> Purificar o vírus rotulada de acordo com a etapa 6. </li></ol> 5. A ligadura de Modificados Partículas adenovirais com Probes alcino usando cobre (I)-Catalisado cicloadição Azida-alcino (CuAAC) em atmosfera desoxigenado <ol><li> Mg lugar 7,2 de cobre (I), brometo de pó (CuBr) em um tubo de Eppendorf, coberto com folha de alumínio. </li><li> Pipeta de 1 ml de DMSO num tubo de Eppendorf segundo. </li><li> Preparar50 uL de solução de rotulagem CuAAC num tubo de Eppendorf terceiro. Cubra com papel alumínio se a sonda alcino é sensível à luz (por exemplo TAMRA-alcino). </li><li> Colocar os três tubos de Eppendorf, não nivelado, num saco de luva desoxigenada durante 6 horas. Todas as amostras devem permanecer no interior do saco de luvas até à conclusão da reacção CuAAC. </li><li> Preparar uma solução-mãe 50 × de CuBr por adição de 1 ml de DMSO a 7,2 mg de CuBr em pó, ambos os quais têm sido desoxigenada acordo com o passo 5.4. </li><li> Iniciar a reacção CuAAC pipetando 1 uL desta solução de reserva de CuBr a 50 uL da solução de rotulagem CuAAC, que foi desoxigenada acordo com o passo 5.4. Permitir que a reacção prosseguir durante 12 hr no interior do saco de luvas. </li><li> Purificar o vírus rotulada de acordo com a etapa 6. </li></ol> 6. Purificação e Armazenamento de partículas virais identificadas <ol><li> Purifique as amostras de vírus rotulados com Centri-Sep filtração em gel centrifugação columns equilibrada com tampão de armazenamento de vírus, seguindo as orientações do fabricante. </li><li> Alternativamente, a purificação pode ser realizada por diálise contra tampão de armazenamento de vírus. </li><li> As partículas de vírus com a etiqueta deve ser armazenada a -80 ° C. </li></ol> 7. SDS-PAGE de Adenovirus rotulada e Leitura Gel Fluorescente <ol><li> Adicionar 20 ul de tampão de amostra Laemmli (2 ×) a 20 ul de vírus purificado rotulados e ferver durante 10 min. Centrifugar as amostras durante 30 segundos para remover qualquer precipitados insolúveis. Se o cobre residual está presente após purificação, fervendo a amostra pode resultar em estrias de espessura de proteína sobre o gel de SDS-PAGE, causando dificuldades durante a visualização. Neste caso, renunciar de ebulição da amostra nesta etapa. </li><li> Anexar a cassete de gel de electroforese para a célula e adicionar tampão de corrida. Carregar o número necessário de poços com as amostras de proteína virais. Use um bem para carregar pré-stained moleculares marcadores de peso. Executar o gel durante 1 hora a 200 V. Manter a célula electroforese coberto com folha de alumínio durante todo o período de reduzir fotobranqueamento do rótulo fluoróforo. </li><li> Para uma melhor resolução e para remover todos fluoróforo livre, permitem que o corante de rastreamento para correr para fora do gel durante a eletroforese. Parar a electroforese e transferir rapidamente o gel para um digitalizador de gel fluorescente e digitalizar o gel para a emissão de fluorescência no comprimento de onda apropriado (574 nm para TAMRA). </li><li> O número de moléculas de corante conjugados a cada partícula viral pode ser quantificada através da medição da fluorescência de várias concentrações de Tamra padrão e comparando com a amostra a partir do passo 7.3. </li></ol> 8. Os resultados representativos Os resultados observados de SDS-PAGE e digitalização gel fluorescente de TAMRA conjugados Ad5 são mostrados na Figura 3. Embora estas verificações de gel fluorescentes foram realizados em amostras modicadas através CuAAC, os resultados devem ser comparáveis ​​quando as sondas são ligados via SPAAC. Esses exames gel indicam que os resultados de rotulagem AHA em modificação das três proteínas do capsídeo (Ad5 hexon, Penton, e Fibra), enquanto rotulagem açúcar modifica apenas a proteína da cápside Fibra. Além disso, um aumento da concentração do Aha (4 mM vs 32 mM) resulta em um maior grau de incorporação Aha, mas também tem sido mostrado para diminuir a infectividade. Resultados anteriores indicam que 7 para Ad5 produzido em 4 mM Aha, cerca de 5% de expostos sítios de metionina são TAMRA-modificado, com este número aumentando para 10% quando 32 mM Aha é usado. Isto corresponde a cerca de 280 e 510, respectivamente, de corantes-rotulados sítios por Ad5 partícula. Análise de açúcar rotulagem-1 indicou que cerca de 22 dos 36 locais de glicosilação em Ad5 são ocupados por um açúcar azido e, subsequentemente, rotulado com TAMRA. Se dez placas de cultura de tecidos são usados ​​para produzir a azida modificado Ad5, tal como descrito<html> neste protocolo, 200 - 300 ul de azida modificado vírus deve ser obtido a partir da faixa branca recolhidos no passo 3.6, com um título de aproximadamente 1,5 x 10 12 partículas / ml. Uma dificuldade comum deste procedimento é a ausência de uma banda viral neste passo de purificação, o que pode ser atribuída a título virai baixa. Este é geralmente o resultado de infectar células que estão acima ou sub-confluentes, ou por lavagem para retirar células - que tornam-se soltou da placa após a infecção - enquanto enxaguar durante a etapa 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Protocolo panorâmica. Azida contendo Aha ou GalNAz é primeiro incorporado em partículas de adenovírus. Ligadura com uma sonda fluorescente alcino é então realizada através de &quot;click&quot; química. Finalmente, a SDS-PAGE é usado para demonstrar a ligadura da sonda fluorescente. igura 2 &quot;/&gt; Figura 2. A ligadura de sonda alcino para azida-vírus modificado através de (a) SPAAC, (b) sob CuAAC de-oxigenado e (c) atmosfera oxigenado. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. Scans fluorescentes de SDS-PAGE de azida marcado com adenovírus tipo 5 (Ad5) após conjugação com CuAAC TAMRA-alcino. (A) Aha-rotulado Ad5, utilizando duas concentrações de Aha. Rotulagem parece ocorrer em hexon adenovírus, Penton e proteínas da cápside de fibra, com a extensão da rotulagem aumentando com a concentração Aha aumentada. (B) Ac adenovírus 4 GalNAz-rotulado parece ser rotulados apenas sobre a proteína da cápside de fibra. <table border="1"><tbody><tr><td> Solução </td><td> Preparação </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Ad5 tampão de armazenamento </td><td> 5 mM de Tris-HCl (pH 8,0) contendo 0,5 mM de MgCl2, 50 mM de NaCl, 25% (v / v) de glicerol, e 0,05% (w / v) albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 tampão infecção </td><td> 2% (v / v) de soro de vitelo bovino, 1 × solução de TC, Ad5 em tampão de armazenamento (volume determinado utilizando uma MOI de 10 PFU / célula e um índice de infecciosidade de 1:20). Levar a solução ao volume final usando TD tampão </td><td> Ad5 concentração pode ser determinada por meio de absorção de UV. </td></tr><tr><td> TC solução (200 ×) </td><td> 136 mM de CaCl2, 100 mM de MgCl2 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> TD tampão </td><td> 137 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,07 mM de Na 2 HPO 4, e 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 meio de crescimento de células </td><td> Meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro de vitelo bovino (BCS) e 1% (v / v) Pen Strep </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Solução estoque Cys (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 200 mM de L-cisteína </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Aha solução estoque (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 100 mM de L-Azidohomoalanine </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Aha rotulagem médio </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 10% de BCS, Aha solução stock (1 ×), 2 mM de L-cisteína </td><td> Preparar uma solução fresca antes do uso. Isto corresponde a uma 4 mM cONCENTRAÇÃO de Aha, embora diferentes concentrações podem ser utilizados (ver resultados representativos). </td></tr><tr><td> Met solução estoque (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 100 mM de L-Metionina </td><td> Preparar fresco e filtro com um filtro de seringa de 0,2 mícrons estéril antes da utilização. </td></tr><tr><td> Met meio controle </td><td> DMEM (-Met /-Cys) suplementado com 10% de BCS, Met solução stock (1 ×), 2 mM de L-cisteína </td><td> Preparar uma solução fresca antes do uso. </td></tr><tr><td> Ac 4 A solução estoque GalNAz (1.000 ×) </td><td> 50 mM peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) em metanol </td><td> Armazenar a 4 ° C. Ac 4 GalNAz é um precursor metabólico para GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido-açúcar de médio rotulagem </td><td> 100 ul de solução stock Ac 4 GalNAz, 100 ml de HEK 293 meio de crescimento de células </td><td> Permitir que a evaporar-se metanol antes da adição de HEK 293 meio de crescimento celular. </td></tr><tr><td> Soluções de cloreto de césio </td><td> CsCl dissolvido em tampão de TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml de H2O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml de H2O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml de H2O) </td><td> Gradientes de densidade de ultracentrifugação </td></tr><tr><td> Tampão de armazenamento vírus </td><td> Salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, contendo 0,5 mM de CaCl2, 0,9 mM de MgCl2, e 10% (v / v) de glicerol </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN solução rotulagem (SPAAC) </td><td> TAMRA-BCN em DMSO: <ol><li> Use UV absorbance (OD Ensaio 260) para determinar o título de vírus da solução no passo 4,1 </li><li> Determinar o número total de partículas virais na alíquota 50 ul (N Ad5) </li><li> A molaridade TAMRA-BCN (em M) é determinada utilizando: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) N = 6,022 Avo × 10 23 (De modo que a mistura de reacção preparada no Passo 4 contém 100 sondas alcino por virião) </li></ol></td><td> Strain-promovido sonda alcino Para SDS-PAGE, uma título virai de aproximadamente 10 12 partículas / ml é sugerido </td></tr><tr><td> TAMRA-alcino solução rotulagem (CuAAC) </td><td> 50 ul de azida de Ad5-modificado em tampão de armazenamento de vírus (N Ad5 determinada como acima), 1,5 mM Batho<html> fenantrolina dissulfonato (isto é, 1,5 × concentração CuBr final), TAMRA-alcino. TAMRA-alcino molaridade (em M) é determinada utilizando: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (De modo que a mistura de reacção preparada no Passo 5 contém 100 sondas alcino por virião) </td><td> Tampão Tris é conhecido por ser um ligando competitivo e inibidora de cobre. 8 </td></tr><tr><td> Tampão de amostra Laemmli (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) de SDS, 20% de glicerol (v / v), 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, e 0,004% (w / v) de azul de bromofenol </td><td></td></tr><tr><td> O tampão de corrida </td><td> 187 mM de glicina, 19 mM de Tris-HCl, 3,5 mM de SDS em H2O </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabela 1. Preparação dos tampões e soluções exigidas por este protocolo.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O desenvolvimento de reacções clique quimiosselectivas e bioorthogonal, incluindo os de azidas, é uma área em rápida evolução da investigação e, subsequentemente, há um número crescente de estas reacções a escolher para aplicações bioconjugação. Temos restringiu o âmbito deste protocolo para incluir apenas dois métodos, que foram escolhidos por causa de sua utilidade em nosso laboratório próprio e disponibilidade comercial de todos os reagentes. Na primeira via, tais - estirpe-promovido cicl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Adenovírus tipo 5 (Ad5) contendo um transgene GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Rim de embrião humano (HEK 293) células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), glucose elevada </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Modificação de Dulbecco Eagle Médium, não Metionina, não Cisteína (DMEM-Met /-Cys), glucose elevada </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Soro de vitelo </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicilina - estreptomicina 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% de tripsina-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 milímetros prato de cultura de células, cultura de tecidos de poliestireno tratada </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> De cultura de células incubadora de CO 2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biossegurança gabinete </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Estéril filtro de seringa (0,2 um, acetato de celulose) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti centrífuga JE </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Tubos cónicos (50 ml, esterilizada) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrífuga equipado com um 41 SW e SW 60 rOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf biopur Safe-Lock tubos, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrífuga 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep rotação gel colunas de filtração </td><td> Separações Princeton </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Agulha estéril, calibre 18 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saco de nitrogênio luva (se CuAAC desoxigenada deve ser realizado) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Frasco de Dewar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nitrogênio líquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Célula de eletroforese </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Scanner de gel fluorescente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pronto Gel de Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (At 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Batofenantrolina dissulfónico (BDA) sal dissódico </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Base Tris (tris (hidroximetil) aminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfato dissódico (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> HCl 1M </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecilsulfato de sódio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> De cloreto de césio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Brometo de cobre (I) (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de potássio (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (MgCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alcino sonda para * CuAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA alcino </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Sonda alcino tensa para * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO alcino </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * Os vendedores notáveis ​​de reagentes e kits de química clique incluem Invitrogen, Jena Biociências, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, clique em Ferramentas Química e Baseclick. Uma variedade de corantes alcino e ligandos de segmentação podem ser encontrados em catálogos estes fornecedores.

modificação de superfícies quimiosseletiva virais através química clique bioorthogonal

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

A modificação de partículas de vírus tenha recebido uma quantidade significativa de atenção para a sua enorme potencial para influenciar a terapia génica, as aplicações oncolíticos e desenvolvimento de vacinas. 1,2,3 As abordagens actuais para modificar superfícies virais, que são na sua maioria genética-based, geralmente sofrem de atenuação transdução de produção de vírus infeccioso, e celular. 4,5 Usando química clique quimiosselectiva, desenvolvemos uma abordagem alternativa simples que evita esses problemas, mantendo ao mesmo tempo altamente flexível e acessível. 1,2 O objectivo deste protocolo é demonstrar a eficácia da utilização de química do clique bioorthogonal para modificar a superfície do adenovírus tipo 5 partículas. Este processo de dois passos pode ser utilizado tanto terapeuticamente 1 ou analiticamente, 2,6, pois permite a ligadura quimiosselectiva de moléculas alvo, corantes ou outras moléculas de interesse para as proteínaspré-marcados com marcas de azida. As três principais vantagens deste método são que (1) marcação metabólica demonstra pouco ou nenhum impacto sobre a aptidão viral, 1,7 (2) uma vasta gama de ligandos efectoras podem ser utilizados, e (3) é extremamente rápido, fiável e de fácil acesso. 1,2,7 No primeiro passo deste procedimento, as partículas de adenovírus são produzidos tendo quer azidohomoalanine (Aha, um substituto de metionina) ou o açúcar não natural O-ligada N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos dos quais contêm a azida (-N 3) funcional grupo. Após a purificação das partículas de azida-vírus modificado, uma sonda contendo a porção alcino TAMRA fluorescente é ligada de uma maneira quimiosselectiva para as proteínas pré-marcados ou glicoproteínas. Finalmente, uma análise de SDS-PAGE é realizada para demonstrar a ligadura bem sucedida da sonda para as proteínas da cápside viral. Incorporação Aha é mostrado a rotular todos capsídeo viralproteínas (hexon, Penton e fibra), enquanto os resultados O-GlcNAz incorporação na rotulagem de fibra única. Neste campo em evolução, vários métodos para azida-alcino ligadura foram desenvolvidos com sucesso, no entanto apenas os dois que temos encontrado para ser mais conveniente são demonstrados aqui - estirpe promovido cicloadição azida-alcino (SPAAC) e cobre-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC) sob atmosfera desoxigenado.

Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via &quot;clique&quot; reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

A modificação de partículas virais tem recebido uma atenção significativa devido ao seu tremendo potencial de impactar a terapia gênica, a oncolítica...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método flexível de reengenharia de superfícies virais por meio da química click. Na primeira etapa deste procedimento, células renais embrionárias humanas são infectadas com o adenovírus tipo cinco e incubadas na presença do aminoácido não natural ácido homoalanina ou do açúcar acetilado N-acetoacetil glicosamina. Após dois dias, as partículas de adenovírus marcadas com azida são coletadas e purificadas.Em seguida, a cicloadição azida-ino específica é utilizada para ligar sondas fluorescentes à superfície dessas partículas. Conforme explicado no protocolo escrito, isso é realizado usando um dos dois métodos de ligação possíveis: por promoção de tensão ou catalisado por cobre.Em aplicações terapêuticas, esses acoplamentos podem incluir polipeptídeos, polímeros ou moléculas pequenas. Neste experimento, utiliza-se uma sonda fluorescente para demonstrar a ligação da sonda às proteínas do capsídeo por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Há grande interesse no desenvolvimento de vírus como agentes de entrega gênica, particularmente no contexto de terapêuticas, entrega gênica, terapia oncolítica e tecnologia de vacinas.Nesse contexto, ajustar a interface vírus-hospedeiro é particularmente importante em termos de obter as propriedades apropriadas para o estímulo imunológico direcionado ao tecido terapêutico. Uma série de outros fatores é importante em termos de ajustar a interface vírus-hospedeiro. Nesse contexto, desenvolvemos um protocolo de marcação em duas etapas.O primeiro passo é a introdução metabólica de um aminoácido não natural ou açúcar não natural. Isso instala um ponto de ancoragem que podemos então ampliar com químicas extremamente seletivas, permitindo que anexemos a esses vírus essencialmente qualquer funcionalidade desejada, sem perturbar significativamente o vírus, sua infectividade ou aptidão geral, o que representa uma grande barreira, um grande obstáculo a superar. Após esterilizar a cabine e os equipamentos de laboratório, prepare 11 placas de cultura de 100 milímetros com células HEK 293 mantidas em meio de crescimento para HEK a 37 °C.Após a cultura celular atingir 80 a 90% de confluência, remova o meio de crescimento de um dos recipientes e lave uma vez com tampão TD. Solte as células com um mililitro de tripsina-EDTA e incube por um minuto. Adicione nove mililitros de meio de crescimento e conte o número de células colhidas neste recipiente.Usando um citômetro de hemácias, calcule o número de partículas de adenovírus necessárias para infecção em cada um dos 10 pratos de cultura restantes. Remova lentamente o meio de crescimento, depois lave com cinco mililitros de tampão TD. Adicione um mililitro de tampão de infecção e incube por uma hora durante este período.Agite suavemente as placas de um lado para o outro a cada 15 minutos após a infecção. Adicione cuidadosamente nove mililitros de meio de crescimento para HEK a cada placa e incube por mais 18 horas. A partir de soluções estoque concentradas de uma HA em Sistine.Prepare um meio de marcação com HA de acordo com o protocolo escrito. Certifique-se de filtrar primeiro essas soluções estoque com um filtro de seringa de 0,2 micrômetros. Esterilize a solução estoque de metionina para o controle da mesma maneira e remova cuidadosamente o meio de crescimento, lavando cada placa de cultura com cinco mililitros de tampão TD.Substitua isso por 10 mililitros de um meio de marcação com HA e incube as células infectadas por mais seis horas. As proteínas do capsídio viral serão traduzidas na presença de azo homo alanina e na ausência de metionina. Substitua cuidadosamente o meio de marcação por 10 mililitros de meio de crescimento fresco e incube por mais 18 horas.Após a conclusão desta etapa, prossiga para o procedimento de purificação na etapa três do vídeo. Alternativamente, as marcas azi podem ser introduzidas por meio de açúcares contendo azi em vez do aminoácido não natural a HA. Neste protocolo, o precursor metabólico do parasita N-acetoacetil galactosamina, um precursor metabólico do UDPN-acetoacetil, é utilizado; o glucosamina é cultivado na presença desse açúcar aceto.O adenovírus do tipo cinco apresentará grupos azi apenas na fibra para realizar a marcação com açúcar. Primeiro, siga o passo um do vídeo até a solicitação na tela. Isso corresponde ao passo 1,5 do protocolo escrito.Prepare a solução de marcação com açúcar pipetando primeiro 100 microlitros da solução estoque de açúcar ATO em tubos tipo Falcon e deixando o metanol evaporar. Em seguida, adicione 100 mililitros do meio de crescimento para HEK. Cubra as células em cada placa com 10 mililitros deste meio de marcação com açúcar e incube a 37 graus Celsius por 44 horas.Prossiga para a etapa três para purificação. Transfira o meio juntamente com as células infectadas da placa de cultura para dois tubos cónicos e centrifugue a 2000 G durante 10 minutos. A quatro graus.Remova o sobrenatante e re-suspenda cada pellet em quatro mililitros de tampão TD usando nitrogênio líquido em um banho a 37 graus. Realize três ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células infectadas. Misture a suspensão com um vórtex entre cada ciclo.Centrifugue a suspensão descongelada a 2000 G durante 10 minutos para precipitar os detritos celulares, pois o adenovírus utilizado para infecção na etapa um continha um transgene GFP cuja atividade fluorescente nessa etapa confirma a transdução e expressão do DNA viral. Prepare cuidadosamente um gradiente de densidade de cloreto de césio de 1,25 gramas por mililitro a 1,4 gramas por mililitro. Aplique o sobrenadante celular lisado sobre o gradiente de densidade e centrifugue a 126.000 G por uma hora a 15 graus Celsius.Após a centrifugação, uma faixa espessa e larga deve estar presente no tubo de centrífuga. Esta é a amostra de vírus modificado com azi. Usando uma agulha esterilizada, fure a parte inferior do tubo para que o conteúdo escorra gota a gota; colete cuidadosamente este vírus.A banda dos dois métodos de ligação demonstrou a deformação. O método promovido envolve condições de reação mais simples, mas apresenta a desvantagem de uma seleção mais limitada de sondas comercialmente disponíveis para realizar a ligação promovida por deformação. Misture 50 microlitros de vírus modificado com azi no tampão de armazenamento de vírus com 0,25 microlitros da solução de marcação Tamara BCN, misturando batendo na parte inferior da tampa do tubo com folha de alumínio e gire durante a noite à temperatura ambiente.Purifique o vírus por meio da filtração em gel por centrifugação. Gire as colunas equilibradas com o tampão de armazenamento do vírus. A reação de cicloadição catalisada por cobre desoxigenado apresenta maior disponibilidade de sondas, mas tem a desvantagem de exigir equipamentos especializados para manter uma atmosfera desoxigenada.Para realizar a ligação catalisada por cobre. Primeiro, desoxigene todos os materiais e soluções da reação em uma câmara de gás inerte com nitrogênio por seis horas. Após esse período, prepare a solução estoque do catalisador de cobre I dentro da câmara de gás inerte para iniciar a reação. Adicione um microlitro dessa solução estoque de cobre a uma solução de 50 microlitros contendo a sonda viral e o agente quelante.Deixe a reação de marcação prosseguir durante a noite dentro da câmara de luvas. Purifique por filtração conforme no passo quatro. Após fervura, purifique o vírus submetido à reação "click" e adicione o tampão amostral por 10 minutos.Carregue os poços com o vírus clicado e os controles e realize a eletroforese. Mantenha o tanque coberto com papel alumínio para proteger a sonda fluorescente da luz. Após uma hora, use um leitor de géis fluorescentes para escanear o gel.Observe que vírus intactos ou não marcados com I não devem deslocar marcação fluorescente significativa para uma HA, marcando os vírus produzidos em maior concentração de uma HA, demonstrando maior marcação fluorescente devido a um grau mais elevado de incorporação de HA. Observe também que o vírus marcado com açúcar expressa apenas etiquetas azi na proteína da cápside do fibro. A partir de células com 80% de confluência, considere dois dias para infecção na marcação com azi, cinco horas para coleta e purificação do vírus marcado, uma noite para a reação *click* e duas horas para análise por SDS-PAGE, totalizando três dias e meio. Em resumo, dois tipos de métodos de marcação com azi e duas reações de química *click* azida-alcino foram demonstrados.Seu aplicativo e recursos devem determinar qual método ou métodos são mais adequados para sua finalidade. Embora todos os materiais deste protocolo estejam disponíveis comercialmente, verificamos que a síntese de açúcares de HA acetilados e de sondas INE é significativamente mais econômica e oferece maior flexibilidade nas modificações da superfície do vírus.

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Nós apresentamos um método para a rápida imobilização, reversível de moléculas pequenas e montagens de nanopartículas funcionalizadas para a superfície Plasmon Resonance (SPR) estudos, usando seqüencial on-chip química cicloadição bioorthogonal e antígeno-anticorpo de captura.

Microfluidic On-chip Reação Capture-cicloadição para imobilizar reversível pequenas moléculas ou estruturas multi-componentes para aplicações de biossensores

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Aqui, apresentamos um protocolo para introduzir sondas químicas específicas do local em um fragmento de anticorpo, incorporando geneticamente um aminoácido contendo azida e, subsequentemente, acoplando a azida a uma sonda química por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa (SPAAC).

Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

Temos engenharia da proteína do capsídeo do vírus de hepatite E como um theranostic de nanopartículas (HEVNP). HEVNP auto monta em uma gaiola icosahedral estável na entrega da mucosa. Aqui, descrevemos a modificação do HEVNPs para tumor definião mutando superfície exposta resíduos de cisteínas, que conjugue ligantes sintéticos que se ligam especificamente as células do tumor.

Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química

Um ensaio de fluorescência facile é apresentado para avaliar a eficiência de amino-acil-tRNA-sintetase/tRNA pares incorporando proteínas expressadas em células de mamíferos não-canônicos amino-ácidos (ncAAs). A aplicação de ncAAs estudar receptors G-proteína acoplada (GPCRs) é descrita, incluindo mapeamento de foto-reticulação de binding sites e opaco GPCR rotulagem em células vivas.

Otimizando a incorporação genética do produto químico sondas em GPCRs para mapeamento de foto-reticulação e opaco química em células de mamíferos vivas

Aqui, apresentamos um procedimento para funcionalizar fluorescente os dissulfetos na Qβ VLP com dibromomaleimide. Descrevemos Qβ expressão e purificação, a síntese de moléculas de dibromomaleimide-acrescida e a reação de conjugação entre dibromomaleimide e Qβ. A partícula de conjugado fluorescente amarela resultante pode ser usada como uma sonda de fluorescência no interior das células.

Fazendo induzida por conjugação fluorescentes peguilado vírus-como partículas pela química do bissulfeto de Dibromomaleimide

O protocolo descrito aqui permite que pesquisadores especificamente modificar capsids adenovírus em locais seleccionados pela química simples. Adenovírus blindado vectores partículas e vetores de transferência do gene redirecionada podem ser gerados, e interações do anfitrião de vetor podem ser estudadas.

Combinação de modificações genéticas e químicas de capsídeos em vetores de transferência gênica baseados em adenovírus para blindagem e direcionamento

Um protocolo para a síntese e a medida das propriedades fotoquímica de compostos Caged modulares com as metades clicáveis é apresentado.

Design, síntese e propriedades fotoquímicas de compostos de Caged clicáveis

O estudo da aciilação gordurosa tem implicações importantes nas interações e doenças das proteínas celulares. Apresentado aqui é um protocolo modificado para melhorar a detecção de química de cliques de proteínas acicladas gordurosas, que podem ser aplicadas em vários tipos celulares e combinadas com outros ensaios, incluindo perseguição de pulso e espectrometria de massa.

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Aqui, propomos um protocolo simples que combina engenharia de oligossacarídeos metabólicos, química de clique e microscopia de expansão que permite a bioimagem de N-glicoproteínas sialiladas intracelulares com resolução aprimorada usando equipamentos de microscopia de rotina.

Visualização da Sialilação Intracelular com Química Click e Microscopia de Expansão

Aprenda a modificar superfícies virais usando química click bioortogonal com adenovírus tipo 5. Este método permite ligar sondas fluorescentes e aprimorar o direcionamento terapêutico de vetores virais.

Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal

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