Name: High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-31T11:45:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprenda a validar múltiplos biomarcadores plasmáticos para doença enxerto-versus-hospedeiro aguda usando ELISA sequencial de alta vazão. Este método minimiza ciclos de congelamento e preserva amostras preciosas.

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Suportado pelo NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​a Fundação Hartwell, e Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny é um investigador do Hartwell Eric fundo ea Amy Strelzer Programa de Pesquisa Manasevit.

1. Dia experimento 0: Preparação de amostras e ELISA Revestimento placa de teste com anticorpo de captura para a IL-2Ra, e HGF REG3α <ol><li> Amostras de alíquotas de plasma a ser analisadas serão puxados, descongelada e centrifugada a 12000 rpm durante 10 min para separar os coágulos, na parte inferior e na parte superior lipidos do plasma. 150 ul de plasma não diluído irão ser plaqueadas a partir de cada amostra para uma placa de 96 poços de fundo V-(placa de fonte) por pipetagem manual de acordo com os mapas pré-definidos. As alíquotas será enrolado em parafilme e mantida numa câmara húmida a 4 º C durante todo o processo, não mais do que 72 h. </li><li> IL-2Ra e anticorpos de captura de HGF será reconstituído e diluído por a especificação do fabricante e 50 uL irá semeadas em cada cavidade de 96 cavidades respectivas de alta ligação semi-poços que são então seladas e incubadas durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, as placas de visita pode ser seco a 37 ° C e armazenados a 4 ° C para utilização posterior, dependemção sobre a estabilidade da proteína. </li><li> Anticorpo de captura REG3α será diluído de acordo com o protocolo do fabricante utilizando tampão fabricante de revestimento e 25 ul serão semeadas em cada poço de uma de 384 poços Nunc Maxi Sorp-placa, que é então selado e incubado durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Dia Experiência 1: IL-2Ra ELISA (Figura 1) <ol><li> A placa de teste de IL-2Ra foi lavada, bloqueadas com BLOTTO em TBS, e o padrão é reconstituído e uma curva padrão de 8 pontos é preparado segundo o protocolo do fabricante. </li><li> Após lavagem da placa após o passo de bloqueio, 50 ul de plasma não diluído é plaqueada em duplicado da placa de fonte para a placa de ELISA, e 50 ul de cada padrão é plaqueada em duplicado. A placa é selado e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente num agitador rotativo placa fixada em 300 rpm. </li><li> O plasma é recuperado a partir da placa de ensaio de ELISA IL-2Ra e colocados de volta no undiluído placa da fonte de plasma. O ELISA é completado por protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas de jogo para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 3. Dia Experiência 1: REG3α ELISA (Figura 1) <ol><li> 10 ul de plasma não diluído é transferido para uma placa de fonte separada v inferior. 90 ul de tampão fornecido pelo fabricante de diluição é adicionada a cada poço para criar uma placa de diluição 1:10 fonte. </li><li> O ELISA é realizado por REG3α protocolo do fabricante (com volumes ajustado para 384 poços) e a densidade óptica de cada poço será lido utilizando um leitor de placas definido para 450-620 nm, e os dados serão guardados e analisados. </li></ol> 4. Dia Experimento 1: Elafin e TNFR1 Revestimento placa de teste com anticorpo de captura <ol><li> Elafin e anticorpos de captura TNFR1 será reconstituído e dilbuída por especificações do fabricante e 50 uL irá semeadas em cada cavidade de 96 cavidades respectivas de alta ligação semi-poços que são então seladas e incubadas durante a noite à temperatura ambiente durante Elafin, e a 4 ° C para TNFR1. </li></ol> 5. Experiment Dia 1-2: HGF ELISA (Figura 1) <ol><li> Após completar o ensaio ELISA IL-2Ra e assegurando o teste não necessita de ser repetida, 60 ul de plasma não diluído será transferida para uma placa nova fonte e, em seguida, 60 ul de BSA a 1% em 1 x PBS é adicionado a cada poço para tornar um 01:02 prato fonte diluída plasma. </li><li> A placa de teste é lavada HGF, bloqueadas com BLOTTO em TBS, e o padrão é reconstituído e uma curva padrão de 8 pontos é preparado segundo o protocolo do fabricante. </li><li> Após lavagem da placa após o passo de bloqueio, 50 ul de 1:2 de plasma diluído é plaqueadas em duplicado na placa de ELISA, e 50 ul de cada padrão é plaqueada em duplicado. A placa é selada eincubadas durante a noite à temperatura ambiente num agitador rotativo placa ajustada para 300 rpm. </li><li> O plasma diluído 1:02 é recuperado a partir da placa de teste ELISA HGF e colocada de volta na placa de fonte diluída de 1:02 de plasma. O ELISA é completado por protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas de jogo para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 6. Dia Experimento 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 ul de plasma não diluído é transferido para uma placa nova fonte e, em seguida, 190 ul de BSA a 1% em 1 x PBS serão adicionados a cada poço para tornar 200 ul de plasma 1:20 dluted. </li><li> O ELISA Elafin como realizado de acordo com o protocolo do fabricante (com volumes ajustado para metade poços), e a densidade óptica de cada poço será lido utilizando um leitor de placas definido para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 7. Da experiênciay 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 ul de BSA a 1% em PBS, será adicionado à placa de fonte de 1:20 (agora contendo 100 uL de plasma de 1:20) para obtenção de 125 ul de plasma diluído 1:25. </li><li> O ELISA é completado por TNFR1 protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas definido para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> 8. Dia Experiência 2: IL-8 ELISA <ol><li> 60 ul de 1:2 de plasma diluído será transferida para uma placa nova fonte e, em seguida, 180 ul de IL-8 diluente é adicionado a cada poço para fazer uma placa de fonte diluída de 1:06 de plasma. </li><li> O ELISA de IL-8 é completado por protocolo do fabricante (com volumes ajustados para metade poços) e a densidade óptica de cada poço vai ser lido utilizando um leitor de placas definido para 450-570 nm, e os dados guardados e analisados. </li></ol> Uma vez que todos os testes ELISA foram concluídas, sem usod estoque plasma será substituído nas alíquotas descongelados e congelado para utilização futura.

<ol><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li>
<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).</li>
<li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li>
<li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li>
<li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li>
<li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li>
<li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li>
<li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li>
<li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines%3A+the+sequential+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li>
<li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> O método ELISA sequencial aqui apresentada permite a medição de várias proteínas do plasma em pequenos volumes de plasma que podem ser difíceis de obter e / ou insubstituível tais como amostras de indivíduos humanos com doenças raras ou de amostras de plasma obtidas a partir de ratinhos 9,10. Os ELISAs sequenciais são tipicamente realizadas na ordem do factor de diluição de plasma crescente, com testes ELISA requerem plasma diluído ≥ 1:10, normalmente, não necessitam de ser recuperado, embora isso possa ser feito se desejado. A capacidade de realizar ELISA sequencial é limitada por kits ELISA / protocolos em que o plasma é misturada com os restantes reagentes, ou para os quais tampões de diluição diferentes são requeridas para o plasma, o que se opõe à ablility de reutilizar uma amostra devido a preocupações de que um incompatíveis tampão / reagente irá interferir com o desempenho de um teste particular. Com um planeamento cuidado, de 10 ou mais ELISAs pode ser efectuado com a mesma amostra de plasma. ent &quot;&gt; Laboratórios individuais podem precisar de ajustar diluições de plasma, a fim de obter resultados interpretáveis ​​baseadas em concentrações plasmáticas esperados da proteína de interesse em amostras dos sujeitos de teste. Diferenças no equipamento de laboratório pode resultar na necessidade de optimizar a incubação e desenvolvimento colorimétrico vezes, o número de lavagens e / ou lavar tempos de imersão, de modo a optimizar qualquer dado ELISA. Para aumentar a taxa de transferência de alta capacidade e precisão e para realizar análises de forma rentável, a utilização de uma plataforma de manuseamento robotizado líquido capaz de análise em 384 placas de poços e um lavador de placas automático com a unidade de empilhamento são recomendados. Este equipamento pode aumentar a precisão e precisão das análises realizadas por vários usuários, e ajudar a fornecer consistência de análise para reduzir variação inter e intra-ensaio. Usamos ELISA sequencial em plataformas multiplex disponíveis por dois motivos: 1) A maior parte dapares de anticorpos para novas proteínas não podem ser facilmente conjugados com pérolas ou outro material, bem como demorada e cara, 2) ensaios de ELISA individuais são mais precisos do que microarray multiplex ou grânulos, secundária a uma ausência de reactividade cruzada 11. Se um método de confiança é estabelecida para executar multiplexados, grânulo com base em microarrays, pode ser capaz de substituir o processo de ELISA sequencial, mas pode ser limitada pela capacidade para conjugar os anticorpos de grânulos e / ou pelo número de proteínas desejadas de ser analisados.

Doença do enxerto-versus-hospedeiro aguda (GVHD), uma das principais causas de mortalidade não-recaída (NRM) após alogénico transplante de células hematopoiéticas (HSCT), mede-se por uma disfunção em três sistemas de órgãos: a pele, fígado e gastrointestinal (GI) trato 4. GVHD aguda geralmente ocorre entre duas e oito semanas após o transplante, mas podem ocorrer mais tarde, e muitas vezes é clinicamente indistinguível da de outros pós-TCTH complicações, tais como a toxicidade regime de condicionamento, infecção ou efeitos colaterais. Através da utilização de estratégias de proteômica e de alto rendimento de validação usando ELISA sequencial, foram identificados seis proteínas cujas concentrações são elevadas no início das manifestações clínicas da DECH. IL-2Ra, TNFR1, HGF e IL-8, quando combinados em um painel 4 biomarcador pode diagnosticar-GVHD no início dos sintomas clínicos e pode prever a sobrevivência pós-transplante, independentemente da gravidade da GVHD 1. Elafin, um biomarcador para GVHD do skem, pode discriminar entre erupção GVHD e erupção de outras causas, como erupções de drogas e pode prever a sobrevida do transplante 2. Nós recentemente identificado REG3α como um biomarcador de DECH do trato gastrointestinal, o órgão alvo mais associado com NRM. A concentração plasmática de REG3α pode identificar com segurança DECH como a causa para o pós-TCTH diarréia e correlacionar com a gravidade histológica da DECH em diagnóstico biópsias intestinais. As concentrações no GI REG3α início GVHD também pode prever a capacidade de resposta a terapia com GVHD e NRM 3. A incorporação desses biomarcadores validados GVHD em atendimento clínico está sendo investigado em ensaios clínicos. Estas experiências foram realizadas em pequenas alíquotas de plasma colhidas a partir de pacientes que receberam transplante entre 2000 e 2010 no momento do início GVHD que são insubstituíveis e de quantidade limitada. Devido à natureza precioso destas amostras, temos desenvolvido um metgico da medição das concentrações de proteína de plasma em múltiplos de forma eficiente e reprodutível para eliminar o excesso de ciclos de congelamento e descongelamento, o tempo de descongelamento e utilização de plasma. Esta técnica pode ser aplicada para realizar os testes ELISA para múltiplas proteínas / citocinas de interesse na mesma amostra (s) desde que as amostras não necessitam de ser misturadas com outros reagentes. Se kits ELISA não vêm com pré-revestidas, as placas de 96 cavidades de meia assim chapas ou placas de 384 poços pode ser usado para reduzir ainda mais o uso de amostras / reagentes. Este manuscrito incide sobre os aspectos tecnológicos da medição biomarcadores GVHD.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Human IL-2 R alfa DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> HGF humano DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> IL-8 humana OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match ASSEMBLEIA Humanos PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Humana sTNFRI/TNFRSF1A DuoSet </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Humana Trappin-2/Elafin DuoSet </td><td> R &amp; D Syderiva </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 cavidades de polistireno de fundo cónico placas </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Usado para placas de fonte de plasma </td></tr><tr><td> Costar meio bem alta de ligação de 96 poços </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Para a IL-2Ra, HGF, TNFR1 e ELISAs elafin </td></tr><tr><td> Nunc 384 poços Maxisorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Para REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Tampão fosfato salino, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino, Fracção V, choque térmico Tratada </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Bloqueador de BLOTTO em TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Agente de bloqueio de IL-2Ra e HGF ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> DulbeccoSalina tamponada com fosfato </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> O tampão de lavagem para a IL-2Ra, HGF, Elafin e ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> Susbtrate Peróxido de TMB </td><td> Kirkegaard and Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> O tampão de lavagem para a IL-2Ra, HGF, Elafin e ELISAs TNFR1 </td></tr><tr><td> Ácido sulfúrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Diluída a 2N) para solução de parada </td></tr></tbody></table>

high throughput elisa sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Proteômica estratégias de descoberta imparciais têm o potencial para identificar um grande número de novos biomarcadores que podem melhorar os testes de diagnóstico e prognóstico em um ambiente clínico e pode ajudar a guiar intervenções terapêuticas. Quando um grande número de proteínas candidatas são identificadas, pode ser difícil validar biomarcadores candidatos em tempo hábil e eficiente a partir de amostras de plasma de pacientes que são orientados a eventos, de volume finito e insubstituível, como no início da aguda do enxerto-versus- doença do hospedeiro (GVHD), uma complicação potencialmente fatal de alogênico de células tronco hematopoiéticas (TCTH). Aqui descrevemos o processo de execução de testes ELISA comercialmente disponíveis para seis proteínas validados GVHD: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, e REG3α 3 (também conhecido como PAP1) de uma forma sequencial para minimizar ciclos de congelamento e descongelamento, Tempo de plasma descongelado e uso de plasma. Para esse procedimento foi realizar os testes ELISA em ordem sequencial, conforme determinado pelo fator de diluição da amostra, conforme estabelecido em nosso laboratório utilizando kits ELISA fabricante e protocolos com pequenos ajustes para facilitar ótimo desempenho ELISA sequencial. As concentrações plasmáticas de biomarcadores resultantes podem então ser compilados e analisados ​​para resultados significativos dentro de um grupo de pacientes. Embora esses biomarcadores são atualmente apenas para pesquisa, sua incorporação cuidados clínicos está sendo investigado em ensaios clínicos. Esta técnica pode ser aplicada para realizar os testes ELISA para múltiplas proteínas / citocinas de interesse na mesma amostra (s) desde que as amostras não necessitam de ser misturadas com outros reagentes. Se kits ELISA não vêm com pré-revestidas, as placas de 96 cavidades de meia assim chapas ou placas de 384 poços pode ser usado para reduzir ainda mais o uso de amostras / reagentes.

<html> O fluxo de trabalho de biomarcadores e cronograma estão detalhados na Tabela 1 e Tabela 2, respectivamente. Depois de concluído, as concentrações de 6 proteínas diferentes foram agora quantificada na mesma amostra de plasma usando um total de 150 uL de plasma. Plaqueamento das amostras em duplicado por teste permite a garantia de qualidade interna, com CV% de menos de 10 sendo ótima. Se realizar o teste ELISA sequencial em placas múltiplas, consistentes densidades ópticas do padrão elevado são preferidos e permitir a fiabilidade inter-chapa melhorada das medições; curva padrão ODs podem ser comparados entre as placas de olhar para avaliar o desempenho inconsistência em ELISA (Figura 2). Os tempos de desenvolvimento, utilizando o substrato tetrametilbenzidina colorimétrica e alta concentração de ODs observada para cada biomarcador no nosso laboratório estão listados na Tabela 3. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Fluxo de trabalho para a IL-2Ra, e ELISAs REG3α HGF. Após as amostras de plasma foram semeadas em placas de IL-2Ra placas de ensaio de ELISA que é recuperada para fazer placas de diluição de fonte para os testes ELISA outros. Para o ELISA de HGF, o plasma é recuperado para preparar a placa de diluição de 1:6 de IL-8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Densidades Ópticas para a curva padrão de 7 placas de ELISA que medem diferentes concentrações REG3α correspondentes aos 1.084 pacientes testados para o GI REG3α relatório inicial biomarcador GVHD 3. ODs consistente entre as placas garantir as proteínas consistentes de concentração entre as placas. As concentrações de proteínasem amostras de plasma são calculadas comparando as densidades ópticas de amostras para as densidades ópticas da curva padrão. <table border="1"><tbody><tr><td> Dia experiência 0 </td><td> 1. Preparar amostras </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Ra, HGF e REG3α captura Ab </td></tr><tr><td> Dia experimento 1 </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (por exemplo revestimento) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin e TNFR captura Ab </td></tr><tr><td> Dia experimento 2 </td><td> 1. HGF conclusão ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Recongelar não utilizadoplasma </td></tr></tbody></table> Tabela 1. GVHD Visão geral de fluxo de trabalho Biomarker <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Dia 0 </td><td colspan="3"> A preparação da amostra e a incubação durante a noite o corpo de captura </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Ra </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Tempo (h) </td><td> 0,0 </td><td> Bloqueio </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Amostras banhados </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Recuperar as amostras de plasma; Detecção Ab </td><td> Amostras de bloqueio; preparar (diluição 1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Amostras banhados (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> Estreptavidina-HRP </td><td> Detecção de Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Estreptavidina-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> Leitura placa </td><td> TMB </td><td> Bloqueadores; amostras preparar (diluição 1:2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Leitura placa </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td> Amostras banhados (1:2) </td><td> Capturar Ab (incubação durante a noite) </td><td> Capturar Ab (incubação durante a noite) </td><td></td></tr><tr><td> Dia 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tempo (h) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim plasma, Detecção de Ab </td><td> Bloqueio; amostras de preparar (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Chapeamento amostra (1:2) </td><td> Bloqueio; nova diluição de 1:20 para a diluição de amostras 01:25 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Chapeamento amostra (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Leitura placa </td><td> Detecção de Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Preparar as amostras (1:6 diluição) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Detecção de Ab </td><td> Chapeamento de amostra (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td> Leitura placa </td&gt; <td> HRP </td><td> Detecção de Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Leitura placa </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Leitura da placa </td></tr><tr><td colspan="2"> Após a conclusão </td><td colspan="6"> Substituir fonte de plasma em alíquotas e congelar para uso posterior </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Cronograma para a realização de testes ELISA. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Factor de diluição do plasma </td><td> Concentração Alto Padrão </td><td> Tempo substrato Desenvolvimento (min) </td><td> Alta OD </td><td> Curva </td></tr><tr><td> IL-2Ra </td><td> 01:01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Linear </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01:20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4 parâmetros </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Linear </td></tr></tbody></table> Detalhes Tabela 3. ELISA para 6 Biomarkers GVHD.

Validação com rendimento elevado de candidatos a biomarcadores múltiplos pode ser realizada por meio de ELISA sequencial de modo a minimizar de congelamento / descongelamento e utilização de amostras de plasma preciosos. Aqui, nós demonstrar como executar sequencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores de plasma validados<sup&gt; 1-3</sup&gt; De enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Na amostra de plasma mesmo.

High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

Estratégias de proteômica de descoberta imparcial têm o potencial de identificar um grande número de novos biomarcadores que podem melhorar o diagnóstico e o prognóstico...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar o Eliza sequencial de alto rendimento para analisar de forma eficiente um grande número de novos biomarcadores descobertos por proteômica. Isso é alcançado primeiramente adicionando amostras a uma placa de origem, que é usada para criar diluições de cada biomarcador e armazenar o plasma recuperado entre os testes. Em seguida, são realizados ensaios Eliza para cada proteína a fim de determinar suas concentrações nas amostras dos pacientes.Por fim, pode-se avaliar o aumento dos níveis protéicos desses biomarcadores no início das manifestações clínicas da doença do enxerto contra o hospedeiro aguda. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que analisadores sequenciais podem analisar múltiplas proteínas novas que nem sempre estão disponíveis em plataformas de multiplexação elevada. As implicações desta técnica estendem-se para o diagnóstico da doença do enxerto contra o hospedeiro aguda.Como biomarcadores validados por meio deste método estão atualmente sendo investigados para cuidados clínicos. Embora este método possa fornecer informações sobre complicações no transplante de células-tronco pós-traumático, ele também pode ser aplicado à descoberta e validação de biomarcadores para outras doenças, como transplante de pulmão, complicações, câncer de pulmão ou potencialmente qualquer doença para a qual um teste sanguíneo diagnóstico seja útil.A demonstração visual deste método é essencial, pois é importante que as múltiplas etapas sejam realizadas de forma consistente para garantir a reprodutibilidade e baixa variabilidade entre lotes. No dia anterior ao experimento, centrifugue alíquotas de plasma por 10 minutos a 15.300 RCF e quatro graus Celsius para separar os coágulos na parte inferior e os lipídios na parte superior do plasma. Em seguida, plaque 150 microlitros de plasma não diluído de cada amostra em uma placa de fundo V de 96 poços, utilizando pipetagem manual de acordo com mapas predefinidos. Envolva a placa em Parafilm e coloque-a em uma câmara umedecida a quatro graus Celsius por até 72 horas.Em seguida, após a reconstituição e diluição do receptor alfa de IL-2 e do fator de crescimento hepatocito (ou HGF) de acordo com as especificações do fabricante, distribua alíquotas de 50 microlitros de cada anticorpo em cada poço de placas de 96 poços com metade do volume e alta ligação. Em seguida, feche essas placas com um selante para placas e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius. Agora, dilua o reg-3α com o tampão de revestimento do fabricante de acordo com o protocolo fornecido e distribua 25 microlitros da solução em cada poço de uma placa de 384 poços sem revestimento máximo.Em seguida, armazene esta placa selada a quatro graus Celsius também no primeiro dia do experimento. Comece lavando a placa de teste do receptor alfa da IL-2 e bloqueando-a com blotto em TBS. Após a reconstituição do padrão, prepare uma curva padrão de oito pontos conforme o protocolo do fabricante.Em seguida, transfira 50 microlitros de plasma não diluído e 50 microlitros de cada padrão em duplicata da placa de origem para a placa de teste ELIZA. Incube então a placa vedada à temperatura ambiente em um agitador rotativo ajustado a 300 RPM. Após duas horas, recupere o plasma da placa de teste ELIZA do receptor IL-2 alfa e devolva-o à placa de origem de plasma não diluído.Em seguida, após concluir o EIA conforme o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado em 450 a 570 nanômetros para o Eliza rich three alpha. Primeiro, transfira 10 microlitros de plasma não diluído para uma placa matriz com fundo transparente separada e, em seguida, adicione 90 microlitros do tampão de diluição fornecido pelo fabricante a cada poço para criar uma placa matriz com diluição de 1 para 10. Após concluir o Eliza Reg three alpha, conforme o protocolo do fabricante, adicione a solução de parada à placa de 384 poços e leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado em 450 a 620 nanômetros. Após a reconstituição e diluição dos anticorpos de captura elephant e tn FFR um conforme as especificações do fabricante, codifique cada poço das respectivas placas de 96 poços com meia parede de alta ligação com 50 microlitros dos anticorpos de captura.Em seguida, incubar as placas de teste seladas durante a noite à temperatura ambiente para a placa de elefante e a quatro graus Celsius para a placa TN FFR. Após a conclusão da transferência do receptor alfa IL dois Eliza, transferir 60 microlitros de plasma não diluído para uma nova placa de origem. Em seguida, adicionar 60 microlitros de BSA 1% em PBS a cada poço para obter uma placa de origem de plasma diluída na proporção de um para dois.Em seguida, lave e bloquee a placa de teste de HGF com BLOTTO em TBS e prepare a curva padrão de oito pontos por diluição. Após lavar a placa, após a etapa de bloqueio, adicione alíquotas duplicadas de 50 microlitros de plasma diluído um a dois e de cada padrão na placa de teste EISA. Incube então a placa selada durante a noite à temperatura ambiente em um rotador de placas ajustado a 300 RPM.Na manhã seguinte, recupere o plasma diluído na proporção de um para dois da placa do teste Eliza de HGF e coloque-o novamente na placa de origem do plasma diluído na proporção de um para dois. Após a conclusão do EIA, de acordo com o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado entre 450 e 570 nanômetros no segundo dia do experimento. Primeiro, transfira 10 microlitros de plasma não diluído para uma nova placa de origem e, em seguida, adicione 190 microlitros de BSA 1% em PBS para obter 200 microlitros de plasma diluído na proporção de um para 20.Em seguida, após a conclusão do ensaio para elefante, Eliza leu a densidade óptica utilizando um leitor de placas ajustado a 450 a 570 nanômetros, de acordo com o protocolo do fabricante. Para o TN FFR um, Eliza adicionou inicialmente 25 microlitros de BSA 1% em PBS à placa matriz um para 20, resultando em 125 microlitros de plasma diluído um para 25 por poço. Então, após completar o ensaio TN FFR um EIA conforme o protocolo do fabricante, leu-se a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado a 450 a 570 nanômetros; para o I-L-H-E-I-A, transferiu-se inicialmente 60 microlitros de plasma diluído um para dois para uma nova placa matriz e, em seguida, adicionaram-se 180 microlitros de diluente de IL oito a cada poço, obtendo-se uma placa matriz de plasma diluído um para seis.Em seguida, após concluir o ELISA ILH conforme o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado entre 450 e 570 nanômetros. Por fim, após a conclusão de todos os ELISAs, devolva o plasma sobressalente não utilizado ao tubo Eloqua e congele para uso futuro. Neste gráfico, as densidades ópticas da curva padrão de sete placas diferentes de ELISA, que medem as concentrações de reg três alfa correspondentes aos 1084 pacientes testados no relatório inicial do biomarcador de doença do enxerto contra o hospedeiro gastrointestinal reg três alfa, demonstram densidades ópticas consistentes entre as placas, o que garante medidas consistentes de concentração proteica entre experimentos.As concentrações das proteínas nas amostras de plasma foram calculadas comparando as densidades ópticas das amostras com as densidades ópticas da curva padrão. Uma plataforma robótica de manipulação limpa pode ser utilizada para aumentar ainda mais a reprodutibilidade, além de reduzir o volume de plasma utilizado ao realizar ELISA em placas de poços de formato criativo. Ao planejar este procedimento, é importante realizar EIS com plasma não diluído primeiro, para que possa ser recuperado e usado em experimentos posteriores após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de proteômica explorarem biomarcadores candidatos em qualquer doença de interesse por meio do uso universal de Eliza sequenciais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como validar múltiplos biomarcadores utilizando E sequencial, empregando pequenos volumes de plasma e minimizando ciclos livres.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O transplante de medula óssea murina é uma técnica amplamente utilizada para estudar os mecanismos imunológicos que regem enxerto-versus-hospedeiro da doença em seres humanos. A capacidade de monitorar padrões de tráfico de células...

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Este vídeo demonstra um ensaio para detectar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos. Uma matriz de peptídeos é sintetizada para representar epítopos potenciais para rejeição de órgãos mediada por anticorpos. A matriz é incubada com o soro do receptor, contendo aloanticorpos que se ligam aos epítopos alvo. A ligação de anticorpos é detectada usando quimioluminescência para identificar epítopos HLA específicos do doador que incitam a reatividade de aloanticorpos.

Uma detecção baseada em matriz de peptídeos de aloanticorpos HLA anti-doadores em receptores de órgãos

Este vídeo demonstra um protocolo de imunoensaio de eletroforese capilar para detectar um biomarcador proteico associado à esclerose lateral amiotrófica (ELA) de plaquetas sanguíneas humanas. A confirmação da presença da proteína biomarcadora ALS é obtida por meio da separação baseada no tamanho das proteínas plaquetárias, seguida pela detecção quimioluminescente.

Um imunoensaio de eletroforese capilar para detecção de biomarcadores de proteínas

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

Aqui, nós apresentamos um protocolo para induzir e marcar a doença em um modelo xenogénica da doença do transplantar-contra-anfitrião (xenogvhd). o xenoGVHD fornece um modelo in vivo para estudar a imunossupressão de células T humanas. Adicionalmente, nós descrevemos como detectar pilhas de T humanas nos tecidos com PCR digital como uma ferramenta para quantificar o immunosuppression.

Indução e pontuação da doença do enxerto versus hospedeiro em modelo murino Xenogeneico e quantificação de células T humanas em tecidos de camundongo utilizando PCR digital

Modelamos um ensaio de ECL multiplexado simples que combina 7 ensaios de autoanticorpos juntos. O ensaio é capaz de rastrear DM1 e várias outras doenças autoimunes, simultaneamente, incluindo doença celíaca, doença tireoidiana autoimune e síndrome poliglandular autoimune 1.

Um ensaio de eletroquimioluminescência de alto rendimento 7-plex rastreando simultaneamente diabetes tipo 1 e múltiplas doenças autoimunes

Em linha com a necessidade urgente de triagem para diabetes tipo 1, doença celíaca e doença por coronavírus 2019, desenvolvemos um ensaio de eletroquimioluminescência 6-Plex de alto rendimento para detectar simultaneamente todos os quatro autoanticorpos de ilhotas, autoanticorpos de transglutaminase tecidual e anticorpos para o domínio de ligação ao receptor do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave.

Uma triagem multiplexada de alto rendimento para diabetes tipo 1, doenças celíacas e COVID-19

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Aprenda a validar múltiplos biomarcadores plasmáticos para doença enxerto-versus-hospedeiro aguda usando ELISA sequencial de alta vazão. Este método minimiza ciclos de congelamento e preserva amostras preciosas.

High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

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