High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

O objetivo geral do experimento a seguir é usar Eliza sequencial de alto rendimento para analisar com eficiência um grande número de novos biomarcadores que foram descobertos pela proteômica. Isso é conseguido primeiro adicionando amostras a uma placa de origem, que é usada para criar diluição para cada biomarcador e armazenar o plasma recuperado entre os testes. Em seguida, os de Eliza são executados para cada proteína, a fim de determinar suas concentrações em amostras de pacientes.

Em última análise, a elevação dos níveis proteicos desses biomarcadores no início das manifestações clínicas da doença aguda do enxerto contra o hospedeiro pode ser avaliada. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que os analisadores sequenciais podem analisar várias proteínas novas que nem sempre estão disponíveis com plataformas de multiplexação. As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de doença aguda do enxerto contra o hospedeiro.

Como os biomarcadores validados por meio desse método estão sendo investigados para atendimento clínico. Embora este método possa fornecer informações sobre complicações no transplante de células-tronco poéticas pós-traumáticas. Também pode ser aplicado à descoberta e validação de biomarcadores para outras doenças, como transplante de pulmão, complicações, câncer de pulmão ou potencialmente qualquer doença para a qual um exame de sangue diagnóstico seja útil.

A demonstração visual deste método é crítica, pois é importante que as várias etapas sejam feitas de forma consistente para garantir a reprodutibilidade e a baixa variabilidade do lote No dia anterior ao experimento, gire as amostras de alíquota de plasma pensado por 10 minutos a 15.300 RCF e quatro graus Celsius para separar os coágulos na parte inferior e os lipídios na parte superior do plasma. Em seguida, coloque 150 microlitros de plasma não diluído de cada amostra em uma placa inferior em V de 96 poços por pipetagem manual de acordo com mapas predefinidos. Embrulhe a placa em Paraform e coloque-a em uma câmara humana a quatro graus Celsius por até 72 horas.

Em seguida, após reconstituir e diluir o receptor alfa de IL dois e o fator de crescimento humano, ou anticorpos de captura de HGF de acordo com as especificações do fabricante, coloque alíquotas de 50 microlitros de cada anticorpo em cada poço das respectivas placas de meio poço de 96 poços de alta ligação. Em seguida, sele essas placas com um selador de placas e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius. Agora dilua o reg três alfa com o tampão de revestimento do fabricante de acordo com o protocolo do fabricante e coloque 25 microlitros da solução em cada poço de uma placa máxima de 3 84 poços.

Em seguida, armazene esta placa selada a quatro graus Celsius também no primeiro dia do experimento. Comece lavando a placa de teste alfa do receptor de IL dois e bloqueando-a com blotto em TBS. Depois de reconstituir o padrão, configure uma curva padrão de oito pontos de acordo com o protocolo do fabricante.

Próxima placa, 50 microlitros de plasma não diluído e 50 microlitros de cada padrão em duplicata da placa de origem para a placa de teste ELIZA. Em seguida, incube a placa selada à temperatura ambiente em um rotador de placas ajustado para 300 RPM. Após duas horas, recupere o plasma da placa de teste alfa ELIZA de dois receptores de IL e coloque-o de volta na placa de fonte de plasma não diluído.

Em seguida, depois de concluir o EIA de acordo com o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço usando um leitor de placas ajustado para 450 a 570 nanômetros para os três ricos alfa Eliza primeiro transfira 10 microlitros de plasma não diluído para uma placa de fonte inferior de visualização separada e, em seguida, adicione 90 microlitros do tampão de diluição fornecido pelo fabricante a cada poço para criar uma placa de fonte de diluição de um a 10. Depois de completar o Reg three alpha Eliza, de acordo com o protocolo do fabricante, adicione a solução de parada à placa de 384 poços e leia a densidade óptica de cada poço usando um leitor de placas ajustado para 450 a 620 nanômetros. Depois de reconstituir e diluir o elefante e tn FFR, um anticorpos de captura de acordo com as especificações do fabricante, codifique cada poço das respectivas placas de meio poço de 96 poços de alta ligação com 50 microlitros dos anticorpos de captura.

Em seguida, incube as placas de teste seladas durante a noite à temperatura ambiente para a placa de elefante e a quatro graus Celsius para a placa TN FFR um. Depois de completar o IL, dois receptores alfa Eliza transferem 60 microlitros de plasma não diluído para uma nova placa de origem. Em seguida, a 60 microlitros de 1% BSA em PBS para cada poço para fazer uma placa de fonte de plasma diluído de um a dois.

Em seguida, lave e bloqueie a placa de teste HGF com BLOTTO em TBS e, em seguida, configure a diluição da curva padrão de oito pontos. Após lavagem da placa, seguindo a placa de passo de bloqueio de 50 microlitros, duplicar alíquotas de um a dois plasmas diluídos e de cada padrão na placa de teste EISA. Em seguida, incube a placa selada durante a noite à temperatura ambiente em um rotador de placas ajustado a 300 RPM.

Na manhã seguinte, recupere o plasma diluído de um a dois da placa de teste HGF Eliza e coloque-o de volta na placa de fonte de plasma diluído de um a dois. Após completar o EIA, de acordo com o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço usando um leitor de placas ajustado para 450 a 570 nanômetros no segundo dia do experimento. Primeiro transfira 10 microlitros de plasma não diluído para uma nova placa de origem e, em seguida, 190 microlitros de 1% BSA em PBS para fazer 200 microlitros de um a 20 plasma diluído.

Então, depois de completar o elefante, Eliza, de acordo com o protocolo do fabricante, leu a densidade óptica usando um leitor de placas ajustado para 450 a 570 nanômetros. Para o TN FFR, Eliza primeiro adiciona 25 microlitros de 1% BSA e PBS à placa de origem de um a 20, resultando em 125 microlitros de um a 25 plasma diluído por poço. Em seguida, depois de completar o TN FFR um EIA de acordo com o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço usando um leitor de placas ajustado para 450 a 570 nanômetros para a primeira transferência ILHEIA, 60 microlitros de um a dois plasmas diluídos para uma nova placa de origem e, em seguida, adicione 180 microlitros de IL oito diluente a cada poço para fazer uma placa de fonte de plasma diluído de um a seis.

Em seguida, depois de concluir o ILH Eliza de acordo com o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço usando um leitor de placas ajustado para 450 a 570 nanômetros. Finalmente, uma vez que todos os Eliza tenham sido concluídos, substitua o plasma falante não utilizado no pensamento Eloqua e congele para uso futuro. Neste gráfico, as densidades ópticas para a curva padrão de sete placas ELIZA diferentes medindo as concentrações de três alfa correspondentes aos 1084 pacientes testados para o relatório inicial de biomarcador de enxerto gastrointestinal versus doença do hospedeiro são mostradas densidades ópticas consistentes entre as placas garantem medições consistentes de concentração de proteína entre os experimentos.

As concentrações das proteínas nas amostras de plasma foram calculadas comparando as densidades ópticas da amostra com as densidades ópticas da curva padrão. Uma plataforma de manuseio roboticamente limpa pode ser usada para aumentar ainda mais a reprodutibilidade e, ao mesmo tempo, diminuir o volume de plasma usado pela execução de placas de poço Eliza e Creative Form. Ao planejar este procedimento, é importante executar EISs que é plasma não diluído primeiro para que possa ser recuperado e usado em experimentos posteriores após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da proteômica explorarem biomarcadores candidatos em qualquer doença de interesse por meio do uso universal de Eliza s. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como validar vários biomarcadores usando E sequencial enquanto usa pequenos volumes de plasma e minimiza os ciclos livres.