Name: Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Aprenda a rastrear circuitos neurais sinapticamente conectados no sistema nervoso central usando vírus trans-sináptico e receptor TVA. Este método de alta vazão permite analisar microcircuitos neuronais com eficiência superior à eletrofisiologia tradicional.

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Nós gostaríamos de agradecer Sean Whelan para assistência com resgate variantes VSV recombinantes, e Didem Goz e Ryan Chrenek para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por HHMI (CLC), e # NS068012-01 (KTB).

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O uso de vírus para estudar circuitos neurais são um método de rendimento relativamente elevado de análise de neurónios ligados. No entanto, tanto a geração de viriões de VSV e RABV não é trivial. Embora o protocolo descrito acima, para resgatar o vírus a partir de ADNc é fornecido, é ainda um evento de baixa probabilidade. Os níveis de cada um dos N, P, e L plasmídeos necessitam de ser ajustado com precisão, e muitas tentativas e replica precisa de ser feito para assegurar resgate viral. A formação da partícula incorpo...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Cultura de Tecidos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Células de rim de hamster bebê (BSRT7)</td><td>disponível mediante solicitação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vaccínia (vTF7-3)</td><td>disponível mediante solicitação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmídeos pN, pP, pl</td><td>disponível mediante solicitação</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>células HEK 293T</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura tratado para TC de 60 mm</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Frasco de Cultura Celular com Pescoço Inclinado Retangular e Tampa Ventilada</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Meio: DMEM (Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco)</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7,4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>SFB: Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Transfecção Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Seringa: seringa Luer-Lock de 5 ml</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de seringa</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI: PEI linear de alta potência</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Centrifugação Viral&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema de Filtragem a Vácuo com Tubo Corning de 150 ml, 0,45 &amp;mu;m Poros</td><td>Corning</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ultracentrífuga Thinwall, Ultra-Claro, 38,5 ml, 25 x 89 mm</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga SW28</td><td>Beckman-Coulter</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Injeção em Camundongo&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Micropipetas capilares</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>Estereotaxia</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump injector</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>Microcontrolador de quatro canais</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB Motor de Bancada com Controle Digital C.EMX-1, 115 Volts</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 Peça de mão, Troca Rápida</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>Broca de passo, 0,5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>Micr&amp;#8211;suporte para eletrodo</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 ml</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>agulha de injeção 30 gauge</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Pomada Oftálmica Protetora</td><td>Doutores Foster e Smith</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Iodo</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Instrumentos cirúrgicos e de dissecação&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Padrão</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Manga de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Pontos</td><td>Robbins Instruments</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Dissecção e coloração com anticorpos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina Tamponada com Fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Soro de jumento</td><td>Jackson Imunoresearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Anticorpos&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-frango de jumento Dylight 488</td><td>Jackson Imunoresearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647</td><td>Jackson Imunoresearch</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;forte&gt;Montagem do tecido&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de vidro 22 x 22, espessura 0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>Rogers Corp</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte incolor para unhas</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesvanecimento Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_conteúdo&quot;&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

rastreamento de viral geneticamente definido neural dos circuitos

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Os métodos clássicos para o estudo de circuitos neuronais são o rendimento relativamente baixo. Vírus da pseudo-raiva transsináptica, particularmente o (PRV) e do vírus da raiva (RABV), e, mais recentemente, o vírus da estomatite vesicular (VSV), para o estudo de circuitos, está a tornar-se cada vez mais popular. Estes métodos maior rendimento use vírus que transmitem entre os neurônios em qualquer direção do anterógrada ou retrógrada. Recentemente, um RABV modificados para monossináptico rastreio retrógrado foi desenvolvido. (Figura 1A). Neste método, o gene da glicoproteína (G) é eliminado a partir do genoma viral, e reabastecido apenas em neurónios-alvo. Especificidade infecção é conseguida por substituição de um G quimérica, composta pelo domínio extracelular do ASLV-A glicoproteína e o domínio citoplasmático da RABV-G (A RG /), para o normal RABV-G 1. Este G quimérico especificamente infecta as células que expressam o receptor TVA 1. O gene que codifica a TVA pode sido delivered por vários métodos 2-8. Seguindo RABV-G infecção de um neurónio TVA-expressar, o RABV pode transmitir a outros neurónios ligados sinapticamente em sentido retrógrado, por natureza, do seu próprio G, que foi co-fornecido com o receptor TVA. Esta técnica rotula um número relativamente grande de entradas (5-10%) 2 para um tipo de célula definidos, proporcionando uma amostra de todas as entradas para um tipo definido de arranque da célula. Recentemente modifiquei esta técnica de usar VSV como traçador transsináptica 9. VSV tem várias vantagens, incluindo a rapidez da expressão do gene. Aqui nós detalhes de um sistema viral novo rastreamento usando VSV útil para sondar microcircuitos com maior resolução. Embora as estratégias originais publicados por Wickersham et al. 4 e Beier et al. 9 rotulagem autorização de neurónios que qualquer projecto para inicialmente infectadas TVA-expressando células, aqui VSV foi concebido para transmitir apenas a TVAs células que expressam A-(Figura 1B). O vírus é primeiro pseudotipado com RABV-G para permitir a infecção de neurónios jusante da TVA-expressam os neurónios. Depois de infectar esta primeira população de células, o vírus libertado só pode infectar células que expressam TVA. Porque a propagação viral transsináptica está limitada a células que expressam TVA, presença ou ausência de ligação a partir de tipos de células definidas pode ser explorada com alta resolução. Um diagrama de fluxo experimental destas experiências é mostrado na Figura 2. Aqui nós mostramos um circuito modelo, o da direção-seletividade na retina do rato. Examinamos a conectividade das células amácrinas starburst (SACs) para as células ganglionares da retina (CGR).

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

Os métodos clássicos para o estudo de circuitos neuronais possuem, em geral, baixa produtividade. Vírus transsinápticos, particularmente o vírus da pseudoraiva (PRV) e o vírus da raiva...

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver uma nova técnica para analisar a microcircuitaria do sistema nervoso central. Isso é alcançado primeiramente definindo uma população de neurônios para infecção mediante a expressão do receptor TVA. Como segundo passo, o vírus trans-sináptico é injetado no SNC, o que infecta os neurônios primários de escolha.Em seguida, o vírus se espalhará apenas trans-sinapticamente para os neurônios conectados que expressam o receptor TVA. Para examinar se esses neurônios estão conectados, obtêm-se resultados que demonstram que esta técnica pode ser utilizada para analisar a microcircuitaria com base na validação da marcação de microcircuitos conhecidos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como eletrofisiologia e microscopia, é que ela constitui um método de alto rendimento para análise da circuitaria neuronal.Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao ler o primeiro estudo sobre o rastreamento viral restrito mono sinapticamente por Wickersham e colegas. Achamos que os vírus poderiam ser ainda mais modificados para estudar neurônios conectados de maneiras inovadoras. Consulte o protocolo escrito para obter detalhes sobre a recuperação do VSV a partir do CD NA usando o sistema VACCINIA T seven para gerar células para repicagem.Primeiro, aspirar o meio de quatro placas de 10 centímetros com 80% de confluência de células TV800 semeadas no dia anterior e substituir por cinco mililitros de DMEM não suplementado. Transfectar cada placa com cinco microgramas do plasmídeo que codifica a glicoproteína de escolha, conforme procedimentos padrão. Após cerca de seis horas da transfeção, substituir o meio por DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e incubarem as placas durante a noite em um incubador de cultura de tecidos ajustado a 34 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, para permitir a expressão da glicoproteína e sua acumulação na superfície celular.Após a incubação, aspire o meio e substitua por cinco mililitros de DMEM acrescido de 10% de FBS, em seguida infecte cada placa com VSV contendo a glicoproteína quimérica MA rabies G com uma multiplicidade de infecção de 0,01 a 0,1 e incube a 34 graus Celsius durante a noite. Vinte e quatro horas depois, verifique os níveis de infecção de cada placa por microscopia de fluorescência. Se mais de 50% das células estiverem infectadas, colete o meio.Substitua por cinco mililitros de meio fresco e, em seguida, congele o meio coletado a menos 80 graus Celsius. Repita o procedimento de coleta 24 horas depois, durante três dias, totalizando quatro dias de coleta. Congele cada alíquota do meio coletado após a última alíquota ter congelado completamente a menos 80 graus Celsius, embora todas as alíquotas do meio coletado estejam a 37 graus Celsius neste momento; deve haver 80 mililitros de meio coletado, passando o meio coletado por filtros de 0,45 mícron em gelo.Em seguida, alíquota 36 mililitros do vírus em um tubo de centrífuga Beckman e concentre o sobrenatante por ultracentrifugação a 80.000 ×g durante 90 minutos a quatro graus Celsius. Certifique-se de que o rotor esteja adequadamente balanceado após a centrifugação, descarte em um recipiente contendo 10% de hipoclorito e use um aspirador para remover o líquido da parede do tubo. Em seguida, agite os tubos contendo o vírus a 120 rpm por uma hora a quatro graus Celsius e reconstitua o pellet viral no menor volume possível, que geralmente é de cerca de 30 microlitros.Uma vez que o vírus é ressuspenso, realize a titulação do vírus infectando uma placa de 24 poços de células 293T com uma série de diluições dez vezes menores, de um para um milhão, e determine a titulação cerca de dois dias após a infecção. De acordo com procedimentos padrão, células infectadas por vírus podem ser detectadas por fluorescência. É importante utilizar a linhagem celular correta para esses experimentos.O objetivo é que o receptor TVA seja expresso nos tipos celulares nos quais se deseja realizar o mapeamento. Isso pode ser alcançado pela expressão do receptor TVA por meios virais ou por meio de um alelo transgênico. Este experimento utiliza camundongos triplo transgênicos com seis a dez semanas de idade.Camundongos que expressam um alelo condicional TVA serão cruzados com camundongos que expressam um alelo chat, Cree. Em seguida, esses camundongos foram cruzados com uma linhagem que expressa um alelo fluorescente TD tomate. O camundongo transgênico final expressa TVA e um alelo condicional TD tomate em todas as células que expressam Cree, incluindo as células estrela ômicron de interesse.E essa expressão pode ser visualizada usando microscopia de fluorescência. Verifique as coordenadas estereotáxicas para a região de interesse em um atlas do cérebro de camundongo e prepare o aparelho estereotáxico ligando o controlador do microinjetor e posicionando o êmbolo e o suporte do eletrodo. Em seguida, preencha a agulha com óleo mineral para fornecer uma interface com o vírus e coloque a agulha sobre o êmbolo, garantindo que não haja bolhas de ar na agulha.Retire o vírus e coloque-o no gelo. Configure o microinjetor para aspirar e mova o tubo do vírus sob a capilaridade no microinjetor. Abaixe a ponta da capilaridade até o vírus e aspire a quantidade necessária de vírus para o experimento.Após a administração de uma dose pré-operatória de buprenorfina, o animal é adequadamente anestesiado de acordo com as diretrizes institucionais. Realize uma compressão no dedo do pé e certifique-se de que a resposta reflexa esteja ausente. Antes de iniciar o procedimento.Coloque o camundongo anestesiado sobre uma placa aquecida posicionada em um suporte móvel para ajustar a posição do animal. Aplique pomada oftálmica para prevenir a dessecação da córnea enquanto o animal estiver anestesiado. Em seguida, posicione o camundongo no aparelho estereotáxico inserindo suavemente as barras auriculares no canal auditivo.Certifique-se de que a cabeça esteja paralela à base do estereotáxico e não se mova lateralmente. Em seguida, ajuste a barra de mordida para ajudar a estabilizar a cabeça. Remova o pêlo na área da incisão.Em seguida, lave esta área três vezes com etanol, seguido por três lavagens com iodo. Após fazer uma incisão sagital na pele com uma tesoura para expor o crânio, afaste a pele com ganchos cirúrgicos caseiros. Em seguida, aspire a micropicada com bgma e use os controles para mover o microinjetor até as coordenadas do núcleo geniculado lateral.Uma vez localizado o NGL, faça um pequeno furo no crânio sobre o local da injeção. Posicione a capilaridade sobre o furo e abaixe-a lentamente até uma posição logo dorsal à superfície do cérebro. Esta é a posição zero da coordenada dorsal-ventral.O capilar deve ser suficientemente afiado para perfurar a dura-máter do camundongo. Abaixe-o lentamente até uma profundidade de 2,75 milímetros e injete a quantidade necessária de vírus a uma velocidade de cerca de 100 litros por minuto. Deixe a agulha permanecer no cérebro por cerca de sete minutos para permitir a difusão do vírus a partir do local de injeção e impedir que o vírus suba pela agulha.Retire lentamente ao longo de um período de dois minutos, levante a agulha do local da injeção e para fora do cérebro. Finalmente, feche cirurgicamente o local da cirurgia e monitore os animais até que se recuperem da anestesia. Administre buprenorfina a cada 12 horas durante dois dias.De modo geral, a disseminação transsináptica do VSV pode ser observada cerca de 24 horas após a injeção. No entanto, períodos de espera mais longos resultarão em maior disseminação. Após a eutanásia do camundongo por inalação de dióxido de carbono, dissecar o olho em formaldeído a 4% e incubá-lo por uma hora, garantindo que o olho permaneça submerso.Em seguida, transfira o olho para uma placa de Petri contendo PBS. Utilize uma pin&ccedil;a n&uacute;mero 55 para remover rapidamente a c&oacute;rnea e soltar e dissecar a retina dos demais tecidos. A an&aacute;lise de prepara&ccedil;&atilde;o em montagem inteira.Corte a retina em uma lâmina de vidro para que fique plana. Coloque espaçadores de silicone ao redor das bordas da lâmina de vidro, cubra com meio de montagem dourado prolongado e, em seguida, aplique uma lamínula de vidro de espessura zero para análise das secções da retina. Coloque a retina em sacarose a 30% em PBS até que a retina afunde.Em seguida, coloque a retina em uma mistura contendo uma proporção um para um de OCT e solução de sacarose a 30% durante três horas. Por fim, congele rapidamente a retina e armazene a menos 80 graus Celsius até o momento de cortar. Esta imagem mostra um experimento de curso temporal demonstrando a infectividade de células TVA 800 e células 2 9 3 T pelo vsv A barra invertida rg.Os painéis superiores mostram células TVA 800 em seis horas, um dia e dois dias após a infecção. Os painéis inferiores mostram células 2 9 3 T nos mesmos pontos temporais. O vírus se espalha entre células que expressam TVA em questão de horas, enquanto a disseminação nas células 2 9 3 T, que não expressam o receptor TVA, embora ocorra, acontece muito mais lentamente.A barra de escala representa 100 mícrons. Esta imagem mostra uma infecção representativa de células ganglionares da retina de camundongos que não expressam TVA. Os animais foram injetados no corpo geniculado lateral com o vírus vsv A barra oblíqua RG.Simulado com R-A-B-V-G e o tecido foi coletado dois dias após a injeção. Aqui é observada uma infecção esparsa, com as células ganglionares da retina indicadas pela seta amarela. Esta imagem mostra uma infecção mais densa.Isso pode ser alcançado com um TI mais alto do vírus e uma injeção de boa qualidade, como visto aqui. Diferentes tipos de células ganglionares da retina podem ser identificados com base na morfologia, incluindo células ganglionares de arborização pequena, células ganglionares melanopsinas do tipo um, células ganglionares seletivas à direção ou DS GCs e DS GCs on-off. Aqui, a barra de escala representa 50 mícrons, conforme visto nas imagens a seguir de um camundongo que expressa TVA.A transmissão de VSVA para RG de GCs DS liga-desliga para os ômics Starburst segue o padrão esperado. Os GCs DS liga-desliga indicados com ponteiro branco, com preenchimento verde, transmitem o vírus para múltiplos ômics Starburst indicados pelo ponteiro amarelo. Como visto aqui, todas as células verdes que não são GCs DS possuem marcação dupla com o repórter Cree, indicando que são ômics Starburst que expressam TVA.Os GCs DS indicados por cabe&ccedil;as de seta brancas com preenchimento verde e os &ocirc;micos em forma de estrela indicados por cabe&ccedil;as de seta amarelas estratificam as camadas apropriadas da camada plexiforme interna da retina ou IPL, as c&eacute;lulas &agrave;s quais o v&iacute;rus se transmite incluem tanto on quanto off. &Ocirc;mico em forma de estrela. Os n&uacute;meros nesta figura indicam as camadas da IPL. Uma vez dominado, todo o experimento pode ser realizado em um ou dois dias, se for realizado corretamente.A velocidade do VSV é uma de suas principais vantagens após este procedimento. Outros métodos, como o canal vermelho e o mapeamento de circuitos baseado em opsinas, podem ser realizados para validar o rastreamento da circuitaria viral e para analisar as propriedades dessas conexões sinápticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da maioria das etapas diferentes envolvidas no rastreamento de circuitos virais, desde o cultivo do vírus até a injeção in vivo e a análise de neurônios marcados com fluorescência.

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Nós fornecemos um guia prático para entregar...

Revelando Topografia Circuito Neural em Multi-Color

O rastreamento transsináptico tornou-se uma ferramenta poderosa para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos por meio de circuitos multi-sinápticos. Aqui apresentamos um protocolo que explora o vírus da pseudo-raiva transsináptica para identificar e localizar um circuito cerebral funcional, seguido por técnicas clássicas de rastreamento de trato para validar conexões específicas no circuito entre grupos de neurônios identificados.

Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling

Capitalizando uma estratégia genética binária, fornecemos um protocolo detalhado para rastreamento de circuitos neurais em camundongos que expressam traçadores transsinápticos complementares após a recombinação mediada por Cre. Como a produção de traçadores específicos da célula é codificada geneticamente, nossa abordagem experimental é adequada para estudar a formação e maturação de circuitos neurais durante o desenvolvimento do cérebro embrionário murino em uma única resolução celular.

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Aqui descrevemos um procedimento baseado no uso de partículas lentivirais para a modificação genética de longo prazo de células-tronco neurais e/ou suas células ependimárias adjacentes no nicho neurogênico ventricular-subventricular adulto que permite a análise separada de efeitos celulares autônomos e não autônomos, dependentes de nicho em células-tronco neurais.

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Este protocolo descreve reconstruções em larga escala de populações neuronais selectivos, marcados após a infecção retrógrada com um vírus da raiva modificado expressando marcadores fluorescentes, e análises independentes cluster, imparcial que permitem a caracterização abrangente de métricas morfológicas entre subclasses neuronais distintas.

Reconstruções em larga escala e, Clustering imparcial independente baseado no morfológicas Métricas para classificar Neurônios no seletivos Populações

Com base na engenharia lentivirais in vitro de precursores neuronais, seu cotransplante em cérebros de tipo selvagem e avaliação morfométrica pareada de derivados de "teste" e "controle", este método permite a modelagem precisa do controle genético in vivo de neokortikalny morfologia do neurônio de forma simples e acessível.

Transplante intraventricular de precursores neuronais projetados para estudos de Neuroarquitetura in vivo

Este protocolo tem como objetivo gerar interneurônios diretamente reprogramados in vivo, usando um sistema viral baseado em AAV no cérebro e um repórter GFP orientado por synapsin FLEX, que permite a identificação celular e análise mais aprofundada in vivo.

In vivo reprogramação direta de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais

O protocolo atual demonstra um método simples para traçar projeções de glutamato da área tegmental ventral (VTA) para o hipocampo. A fotostimulação dos neurônios de glutamato VTA foi combinada com a gravação de CA1 para demonstrar como terminais de glutamato VTA modulam a taxa de disparo piramipário putativo ca1 in vivo.

Rastreamento Anatômico e Funcional In Vivo dos Terminais de Glutamato da Área Tegmental Ventral no Hipocampo

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda a rastrear circuitos neurais sinapticamente conectados no sistema nervoso central usando vírus trans-sináptico e receptor TVA. Este método de alta vazão permite analisar microcircuitos neuronais com eficiência superior à eletrofisiologia tradicional.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

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