Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

O objetivo do procedimento a seguir é demonstrar como sustentar os lisossomos de dois tipos de amostras, embriões de camundongos e células-tronco diferenciadas com corante rastreador de lio, para detectar padrões de morte celular. Para preparar amostras de embriões, os embriões são primeiro isolados cirurgicamente e colocados em um prato para preparar células diferenciadas. As células-tronco embrionárias são usadas para criar corpos embrionários.

Esses corpos embrionários são cultivados em suspensão e depois cultivados como uma monocamada em uma lâmina de câmara. Todos os embriões vendem monocamada podem ser incubados em vermelho ot tracker e depois são enxaguados e amostras fixas podem então ser fotografadas para examinar e quantificar os resultados de coloração obtidos que mostram Liso Tracker. A coloração é um procedimento simples que pode ser usado para testar a morte celular programada em embriões e células cultivadas.

A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a análise de túneis, é que, como o corante rastreador OT é uma molécula pequena, o tecido espesso pode ser analisado de forma rápida e fácil. Embora esse método possa fornecer informações sobre os padrões de morte celular programada em embriões de camundongos e culturas diferenciadas, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos, como embriões de galinha e células-tronco adultas diferenciadas. Emparelhe camundongos fêmeas jovens com um macho e, nas manhãs seguintes, verifique se há um tampão vaginal, o que indica que o acasalamento ocorreu.

O meio-dia do dia em que o tampão vaginal aparece é efetivamente de 0,5 dias. Pós-cotus no dia embrionário de interesse, eutanasiar a fêmea de acordo com os protocolos aprovados e remover o útero para uma placa de Petri de 10 centímetros com BSS de Hank e enxaguar qualquer sangue. Separe os embriões e remova-os do útero.

Remova as membranas embrionárias extras e faça pelo menos um enxágue com BSS de Hank para remover tecidos estranhos e sangue. Mantenha os embriões dissecados no gelo durante a limpeza. Os outros.

Prepare cinco mililitros de solução de coloração de embriões Liso tracker. Este é um volume suficiente para uma ou duas coleções de embriões. Misture delicadamente a solução para dispersar o corante, uniformemente e, em seguida, transfira os embriões para a solução e incube-os a 37 graus Celsius por 45 minutos.

Após a incubação, enxágue suavemente os embriões no BSS de Hank quatro vezes por cinco minutos a cada lavagem. É importante fazer os enxágues suavemente para não danificar o tecido. Remova o líquido, prestando atenção aos poucos onde estão os delicados embriões, e sempre deixe uma porção do líquido cobrindo-os.

Em seguida, fixe os embriões em 4% de formaldeído durante a noite no dia seguinte. Enxágue os embriões uma vez no BSS de Hank por 10 minutos para remover o fixador. Agora desidrate os tecidos através de uma série de metanol para eliminar a coloração de fundo.

Esta etapa melhora a relação sinal-ruído durante a geração de imagens antes do armazenamento. Se necessário, colete uma amostra de tecido de cada embrião para análise genética. Posteriormente, reidratar a amostra de tecido antes da genotipagem.

Separe os embriões em tubos individuais com rótulos que correspondam à amostra de tecido. Agora é possível armazenar os embriões isolados indefinidamente em metanol de menos 20 graus Celsius. Protegido da luz.

Comece preparando corpos embrionários por meio do método de gota suspensa. Com densidade inicial de 500 células por gota de 20 microlitros após três dias, transferir os corpos embrionários para culturas em suspensão em placas de Petri não aderentes de 10 centímetros. Cultive-os por cinco dias, mudando a mídia a cada dois dias após cinco dias.

Transfira os corpos embrionários para lâminas gelatinizadas de oito câmaras, colocando um ou dois corpos embrionários em cada câmara. Cultive os corpos embrionários por mais 10 dias. Trocando o meio a cada dois dias após 10 dias, aspire suavemente o meio existente e adicione 300 microlitros de solução de coloração de células rastreadoras Lyo a cada câmara.

Tenha o cuidado de pipetar manualmente o meio, colocando a ponta da pipeta no canto da câmara. Dessa forma, você não removerá acidentalmente o, ainda prendendo todos os corpos da superfície do vidro. Ao adicionar novamente o meio, coloque a ponta da pipeta no canto da câmara e adicione o meio de volta muito lentamente.

Incube as câmaras a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, enxágue-os duas vezes com DPBS por cinco minutos por enxágue. Agora fixe as células em 4% de paraldeído por 15 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, remova o fixador com DPBS em dois enxágues de cinco minutos. Para montar os embriões, coloque-os em uma lâmina de vidro de depressão profunda ou em um pequeno escudo infectador de placa de Petri. Prepare as amostras de células para microscopia aspirando o DPBS.

Remova a câmara da lâmina e deixe-a secar ao ar por cerca de cinco minutos. Cubra com papel alumínio para proteger o fluro. Em seguida, adicione um meio de montagem aquoso, como escudo vetorial com dappy e coloque uma lamínula por cima.

Agora o slide foi montado e está pronto para a imagem. Visualize as amostras com um microscópio de dissecação ou composto equipado com uma haste, domine ou filtro vermelho do Texas. A coloração é normalmente bastante brilhante, portanto, exposições longas geralmente não são necessárias no modo manual.

Tire fotos digitais de todas as amostras sob as mesmas condições de exposição. Para quantificar as imagens, abra-as no Adobe Photoshop ou em um programa de imagem semelhante. Para determinar a quantidade de coloração do rastreador lio, selecione o canal vermelho.

Observe a contagem de pixels para toda a imagem, conforme revelado pela função de histograma. Próximo limite, a imagem de modo que a coloração vermelha agora seja representada por pixels brancos. Isso converte a imagem em preto e branco.

Escolha um nível de limite e use esse nível para todas as imagens do conjunto. Selecione os pixels brancos usando a ferramenta de intervalo de cores e use a função histograma para obter a contagem total de pixels brancos. Use o canal azul para contar o número de núcleos no campo.

Pode ser útil manter um registro da contagem anotando a imagem, registrar os valores e usá-los para calcular o nível médio de coloração por célula. Repita essa análise com a mesma configuração de limite para todas as imagens restantes. Para amostrar, o rastreador foi usado para corar embriões mutantes de ouriço sônico.

Uma vez que ly O tracker é uma molécula pequena e altamente difusível, áreas profundas dentro do meen de um embrião inteiro, como corado em 10,5 dias após a morte celular programada ou PCG, foi muito aumentado em embriões mutantes nulos de ouriço sônico, particularmente no membro e também nas regiões. Os botões dos membros foram visualizados em montagens de orifícios com maior ampliação para avaliar o padrão geral. As porções dissecadas também foram seccionadas com um microtom vibratório.

A ponta da seta aponta para o aumento da coloração na ponta distal nula do ouriço sônico em seções obtidas com uma coloração de túnel de criostato foi usada em conjunto com o OT Tracker nessas fatias, embora não haja uma correlação estrita de um para um entre o rastreador de lyo e a coloração do túnel, as regiões gerais de PCD se sobrepõem consideravelmente sob maior ampliação. É possível observar a punção que corou positivo com o ensaio do túnel, mas não a punção da matriz otra que corou apenas com a matriz de lyra e a punção que tem coloração sobreposta. Após 10 dias de cultura do corpo embrionário, as células se diferenciaram em uma variedade de tipos de células, incluindo neurônios, células musculares e cardiomiócitos.

Na cultura normal de células ES diferenciadas, existem algumas células que sofreram PCD, conforme detectado com o rastreador de lyo e ensaios de túnel. Em seguida, as células foram tratadas com peróxido de hidrogênio para induzir a morte celular por estresse oxidativo. Uma dose baixa de peróxido de hidrogênio aumentou tanto o rastreador de lioterapia quanto a coloração do túnel em comparação com nenhum tratamento.

Semelhante aos resultados no embrião, ambas as colorações marcaram células comuns e únicas. Uma alta dose de peróxido de hidrogênio resultou no encolhimento celular e na positividade mais difundida do rastreador de OT e do túnel. Para comparação, a fome de soro foi usada para induzir a autofagia após uma hora de inanição de soro.

A coloração do rastreador OT aumentou. No entanto, a positividade do túnel permaneceu em níveis normais. Assim, embora o reer seja fácil e útil, é importante acompanhar com ensaios adicionais para determinar se a coloração representa apoptose ou autofagia após a quantificação das amostras.

Usando o método simples do Photoshop demonstrado anteriormente, os resultados confirmaram que o aumento das concentrações de peróxido de hidrogênio resultou em um nível mais alto de coloração do rastreador de lys Uma vez dominado, este procedimento de coloração pode ser feito em menos de duas horas se for realizado corretamente Seguindo este procedimento. Outros métodos como NX em cinco ou lc três imunocoloração podem ser realizados para confirmar o tipo de morte celular. Não se esqueça que atualmente o verde Trecker só funciona em células vivas, então o vermelho Reca é sua melhor opção para amostras que requerem fixação.