Ceratite herpética recorrente Estroma em camundongos, um modelo para estudar HSK Humanos

O objetivo geral deste procedimento é estudar a infecção recorrente pelo vírus da herpes simples ou HSV. Isso é realizado primeiramente infectando camundongos de forma que fiquem latente infectados, sem danos corneanos. Após o estabelecimento completo da latência, o próximo passo é reativar o vírus pela exposição à luz UVB; na etapa final, o filme lacrimal é coletado para a detecção da liberação viral e o camundongo é então observado por pelo menos cinco semanas para monitorar a doença.

Por fim, o grau da doença que ocorre nos camundongos pode ser avaliado por meio da pontuação da ceratite estromal herpética. Esta é uma doença que afeta muitas pessoas no mundo inteiro. Essa doença em particular é uma das principais causas de cegueira infecciosa.

Temos um modelo que utilizamos em camundongos para simular esta doença específica. Existem outros modelos que realmente podem imitar esta doença, mas consideramos que este é a melhor representação dessa doença em particular. Gostaria de dedicar alguns minutos hoje para apresentar as pessoas que você verá neste vídeo.

Esta é Chloe, que vem trabalhando comigo nos últimos meses. Este é Nippo, um aluno de verão que está trabalhando no laboratório. Inicie o experimento cultivando o HSV tipo 1 em células Vero por três a quatro dias até atingir 80% de confluência em um frasco T150.

As células já estarão arredondadas nesse momento e serão facilmente destacadas ao bater no frasco. Transfira a suspensão celular para tubos cónicos estéreis de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue as células por 15 minutos. Adicione 1.510 × g a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada.

Em seguida, transfira o sobrenadante para tubos estéreis Oak Ridge de 50 mililitros e, então, distribua cinco mililitros do meio, no total, entre cada um dos tubos cónicos para ressuspenção. Suspenda os grandes pellets e, em seguida, sonique os pellets ressuspendidos por um minuto em dois pulsos de 32ª. Após centrifugar o sobrenadante em uma centrífuga de alta velocidade de piso, obtém-se um pequeno pellet viral.

Após descartar o sobrenatante, combine os sobrenadantes com os pequenos pellets virais e sonique novamente por 45 segundos. Em seguida, centrifugue novamente a solução celular e viral sonicada em centrífuga de bancada por cinco minutos a 280 ×g e 4 °C, e então alíquotas do sobrenatante para armazenamento como estoque viral a −70 °C para plaqueamento de titulação.

Diluições de dez vezes do vírus a partir do sobrenadante do estoque viral, de 10 elevado a zero até 10 elevado a menos oito, duas vezes a partir de dois conjuntos separados de diluições, em células Vero em placas estéreis de 12 poços, iniciam o procedimento de infecção anestesiando o camundongo. O camundongo deve permanecer completamente anestesiado por 20 a 30 minutos para permitir a absorção do vírus antes de acordar.

Em seguida, sob um microscópio estereoscópico, use uma agulha de calibre 30 para arranhar a córnea do olho direito. Agora, identifique o animal por meio de furos na orelha. Em seguida, injete o camundongo com um mililitro de soro humano em pool para proteger as córneas de danos durante a infecção primária.

Em seguida, utilize uma pipeta de 20 microlitros para infectar o olho arranhado com 10 à sexta unidade formadora de placas e coloque cinco microlitros de HBSS no outro olho para mantê-lo úmido enquanto o animal estiver anestesiado, a fim de confirmar a infecção. Hidrate um aplicador de algodão estéril com um mililitro de meio Vero. Três dias após a infecção, esfregue o olho infectado com o aplicador e, em seguida, transfira 100 microlitros do meio coletado para células Vero cultivadas em placas de 48 poços, pelo menos cinco semanas após a infecção primária.

Swab o olho infectado de um camundongo anestesiado conforme acabou de ser demonstrado. Marque o swab como dia zero na tampa da placa de 48 poços para controlar piscadelas espontâneas. Em seguida, coloque o camundongo em um transiluminador que possa emitir UVB com comprimento de onda máximo de 302 nanômetros, de modo que apenas um único olho seja exposto à luz UVB, e exponha o camundongo a 250 milijoules de luz UVB por centímetro quadrado.

Em seguida, realize a coleta por swab do olho diariamente do primeiro ao sétimo dia. Após a irradiação com UVB, para os swabs que contiverem vírus infeccioso, determine a quantidade de vírus por meio de um ensaio padrão de placas utilizando placas de 12 poços para avaliar os camundongos quanto à doença ocular clínica. Posicione o camundongo sob um microscópio estereoscópico binocular.

A opacidade da córnea é classificada em uma escala de zero a quatro, onde zero indica estroma claro, um indica opacificação estromal leve, dois indica opacidade moderada com íris discernível, três indica opacidade densa com perda dos detalhes definidos da íris, exceto pelas margens da pupila, e quatro indica opacidade total sem visão da estrutura posterior.

A neovascularização é avaliada em uma escala de um a oito dividindo-se a córnea em quatro quadrantes iguais e determinando-se a extensão da vascularização em cada um desses quadrantes. Nesta primeira figura, camundongos com infecção latente foram induzidos a reativar com irradiação UVB e, em seguida, os animais foram monitorados quanto à opacidade corneana durante 35 dias. Esses dados demonstram que camundongos machos C 57 black six apresentam significativamente menos opacidade corneana do que camundongos fêmeas C 57 black six, pois houve doença induzida pelo vírus significativamente maior nos camundongos fêmeas C 57 black six entre os dias 14 e 35.

Da mesma forma, quando a neovascularização da córnea foi avaliada sob as mesmas condições experimentais, camundongos machos demonstraram significativamente menos crescimento de novos vasos na córnea do que camundongos fêmeas, e, mais uma vez, há uma doença induzida pelo vírus significativamente maior nos camundongos C 57 black six fêmeas nos dias 14 a 28. Ao realizar este procedimento, lembre-se de anestesiar completamente os camundongos para que permaneçam adormecidos por entre 20 e 30 minutos. Após assistir a este vídeo, espero que você tenha compreendido como utilizar o modelo murino de ceratite estromal recorrente para estudar esta doença humana.