Name: Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a engenharia de tecidos intestinais em modelo murino usando unidades de organoides em scaffold. Este método demonstra isolamento, digestão e implante para regeneração de tecido intestinal funcional.

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Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel, e Frédéric G. Sala são suportados pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM), números de subsídios RN2-00946-1 (TCG) e TG2-01168 (ERB, FGS). Allison L. Speer é uma Sociedade de Cirurgiões Universidade Ethicon estudioso. Yashuhiro Torashima é financiado pelo Los Angeles de Crianças Hospital Saban Research Institute Fellowship Desenvolvimento de Carreira.

1. Preparação Unidades organóides <ol><li> Instrumentos adequados para dissecção mouse (tesouras e pinças) devem ser esterilizados por autoclave. </li><li> Humanamente eutanásia do camundongo doador de acordo com os protocolos locais IACUC. Certifique-se que o animal está morto antes de prosseguir. </li><li> Fazer uma incisão na linha média para obter acesso ao interior da cavidade peritoneal. Retalhos de pele pode ser refletido como necessário para melhorar a exposição. </li><li> Estripar o intestino delgado e dividi-lo apenas distal do ligamento de Treitz. Separe o intestino delgado de seu mesentério usando afiada e dissecção romba suave. Identificar a junção ileocecal e dividir o intestino delgado 5 mm proximal ao presente. </li><li> Com uma tesoura, abrir o intestino longitudinalmente ao longo da borda antimesentérica num prato de Petri com 10 ml de 4 ° C, a solução salina tamponada estéril de Hanks (HBSS, Invitrogen, Carlsbad CA) / 1X antibiótico-antifúngico (Anti-Anti, Invitrogen) de solução. Limpar a matéria fecal no intestino aberto comagitação suave, em seguida, transferir intestino aberto para um tubo de centrífuga de 15 ml com 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril / 1X anti-anti. </li><li> Lavar o intestino aberto três vezes em 10 ml de 4 ° C, HBSS estéril 1X / anti-anti num tubo de ensaio. Cada lavagem pode ser realizada com agitação suave do tubo de 15 mL durante 30 seg. Após agitação, o tecido intestinal afunda para o fundo do tubo. Descartar o material flutuante, a qual é detritos mesenquimal. Remover a solução de lavagem cuidadosamente com uma pipeta. </li><li> Picar o intestino lavado numa placa de Petri com 10 mL de 4 ° C, HBSS estéril 1X / anti-anti-para menos do que 1 milímetro pedaços quadrados usando uma tesoura. Reúna o material picada com uma pipeta automática e colocá-lo em um tubo de ensaio. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 500 rpm durante 8 minutos. Rejeitar o sobrenadante, que contém a gordura e mesênquima. </li><li> Digerir o material, picada lavada com 10 ml de HBSS estéril 1X / anti-anti mais 0,125 mg / ml de dispase (Invitrogen) e 800 unidades / ml colagenase tipo 1 (Worthington, Lakewood NJ). Para preparar 40 ml da solução de digestão, pesam-se 5 mg de dispase, 142 mg de colagenase, e adicione HBSS estéril até um volume de 40 ml. Preparar esta solução recentemente cada unidade de tempo organóides são preparados, e manter a 4 ° C até estar pronto para usar. Adicionar a solução de digestão directamente para a pellet a partir do passo 1.8. </li><li> Incubar o tubo do teste contendo o material, picada lavado com a solução de digestão a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Recuperar o tubo de ensaio e perturbar ainda mais o tecido digerido através de trituração com uma pipeta de 10 ml. Repita entre 20 a 50 vezes, até que uma aparência uniforme é obtido. </li><li> Centrifuga-se o tubo de ensaio durante 5 minutos a 800 rpm. Rejeitar o sobrenadante, que contém uma única célula. </li><li> Parar a reacção de digestão com 10 ml de 4 ° C, Modificado de Dulbecco estéril Eagle Médium (DMEM, Invitrogen) mais 10% v / v inactivado pelo calor de soro fetal bovino (HI-FBS, Invitrogen). Ressuspender o pellet e agitar o tubo. </li><li> Centrifuga-se o tubo de ensaio durante 5 minutos a 800 rpm. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta automática, até as últimas gotas. Usar uma pipeta de plástico descartável para as últimas gotas, para evitar de ressuspender o pellet. </li></ol> 2. Carregamento de ácido poliglicólico Andaime <ol><li> Forma de 2 mm de comprimento, 5 mm de diâmetro exterior andaimes cilíndricos de ácido poliglicólico não tecido (2 mm de espessura da folha, a densidade de 60 mg cm-3; porosidade%&gt; 95, Fibras Concordia, RI Coventry), como descrito na ref. 4. </li><li> Aparar a 2 mm distal de uma pipeta de microlitro descartável 1000 ponta com uma tesoura preparadas com 70% de etanol em água destilada. </li><li> Coloque o andaime em uma placa de cultura de quatro poços. Carregar as unidades organóides sobre o andaime com a pipeta de microlitro 1000, em primeiro lugar para dentro do lúmen e, em seguida, sobre a superfície exterior. Use uma pinça para assegurar o revestimento do lúmen. Não perturbem ou romper a forma cilíndrica do polímero. </li&gt; </ol> 3. Implantação em Rato Anfitrião <ol><li> Utilizar um rato hospedeiro singeneico no fundo mesmo que o doador se disponível. Caso contrário, empregam um diabético não obesos imunocomprometidos / grave imunodeficiência combinada ou NOD / SCID animal (Jackson Laboratories, Sacramento CA). </li><li> Induzir a anestesia geral com isoflurano. Barbear, preparação e armar o abdômen do rato. </li><li> Fazer uma incisão na linha média 5 milímetros para ganhar entrada para a cavidade peritoneal. Identificar e cuidadosamente estripar o omento maior. Coloque o polímero carregado no omento e envolvê-la com o tecido. Não rasgue o omento. </li><li> Fixar o polímero para o omento, com uma sutura monocryl 5-0. Suavemente o omento com o polímero enrolado na sua posição anatómica. </li><li> Feche a incisão abdominal em camadas usando suturas vicryl 4-0. Executar o fechamento muscular e tomar cuidado para não ferir as vísceras abdominais abaixo da incisão. Use suturas interrompidas para a pele. </li><li> Administrar analgesia pós-operatória, com 2 mg / kg de cetoprofeno (Ketofen, Fort Dodge Animal Health) em água estéril como uma pápula subcutânea adjacente à incisão. Os animais devem ser avaliados diariamente e se o animal está a demonstrar sinais de dor ou desconforto, uma dose adicional de cetoprofeno pode ser administrada no dia 2 pós-operatórios. No terceiro dia pós-operatório, o animal deve ser totalmente recuperado, sem evidência de dor ou sofrimento. Se a dor ou sofrimento continua no dia pós-operatório 3, este é considerado anormal e deve ser tratado de acordo com os protocolos de instalação IACUC e animal de cuidados. </li><li> Permitir o mouse para recuperar e no intestino o tecido de crescer por quatro semanas. Dar ao animal o acesso ad libitum a roedores (Lab Diet 5001, PMI Nutrition, St. Louis MO) e água com Septra mg a 200 mg / 5 ml 40 (Hi-Tech Pharmacal, Amityville NY) a uma diluição de 1:100. </li></ol> 4. Colheita <ol><li> Humanely eutanásia do animal hospedeiro quatro semanas após a implantação. </li><li> Reabrir a incisão inicial e reflectem a pele cefálica para facilitar o acesso à cavidade peritoneal. </li><li> Abrir a camada muscular e identificar a construção de tecido de engenharia como um globo de tecido. </li><li> Tome a aderência à construção a partir de vísceras intra-abdominal utilizando dissecção aguda. </li><li> Fixar o construto em formalina para posterior montagem de parafina, ou usar o tecido fresco para os ensaios bioquímicos, tais como PCR em tempo real ou de isolamento de proteínas. </li></ol>

<ol><li>Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+small+intestine+improves+recovery+after+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection.</a> Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).</li>
<li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).</li>
<li>Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+method+for+the+preparation+of+rat+intestinal+epithelial+cell+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures.</a> J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).</li>
<li>Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicellular+approach+forms+a+significant+amount+of+tissue-engineered+small+intestine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Tiss.+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse.</a> Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).</li>
<li>Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+tissue-engineered+stomach+demonstrates+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation.</a> J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).</li>
<li>Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cell+proliferation+is+dependent+on+the+site+of+massive+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection.</a> Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).</li>
<li>Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+corrective+pullthrough+surgery+in+a+mouse+model+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease.</a> J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).</li>
<li>Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+regarding+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Surg.+Int%22%5BJournal%5D)">Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).</li>
<li>Shew, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+concerns+in+malrotation+and+midgut+volvulus%5BTitle%5D)+AND+%22Ped.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus.</a> Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).</li>
<li>Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+long-term+results+and+prognostic+factors+after+conservative+surgery+for+small+bowel+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).</li>
<li>Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+results+after+surgery+for+acute+mesenteric+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia.</a> Surgery. , 121-239 (1997).</li>
<li>Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+biopsy-proven+parenteral+nutrition-associated+liver+fibrosis+and+biochemical+cholestasis+in+children+with+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome.</a> J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).</li>
<li>Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+short+bowel+syndrome%3A+the+cost+of+comprehensive+care%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care.</a> Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).</li>
<li>Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+and+multivisceral+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Intestinal and multivisceral transplantation in children.</a> Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).</li>
<li>Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+intestinal+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ped.+Surg%22%5BJournal%5D)">Current status of intestinal transplantation in children.</a> J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um protocolo para a produção de tecidos de engenharia intestino no rato usando um organóides abordagem unidades-em-andaime. Os passos mais críticos são os da preparação de unidades organóide. Cuidados devem ser tomados para limpar adequadamente e mecanicamente processar o tecido, mas o mesmo cuidado deve ser tomado para não overdigest ou overtriturate as unidades organóides após a digestão é realizada (passo 1.11). Se isto é feito, as unidades organóides pode ser reduzida a uma única célula, que pode se...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 114170-112 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico 100X </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Gibco </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> A colagenase de tipo 1 </td><td> Worthington </td><td> LS004194 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM alta glicose 1X </td><td> Gibco </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> FBS inactivado pelo calor </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td></td></tr><tr><td> Biofelt PGA 100% </td><td> Médico Concordia </td><td> FELT01-1005 </td><td> Para a preparação de polímeros como na Ref.4 </td></tr><tr><td> Poli-L-láctico </td><td> Durect </td><td> B6002-1 </td><td> Para a preparação de polímeros como na Ref. 4 </td></tr><tr><td> Colágeno tipo I cauda de rato, </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3867-1VL </td><td> Para a preparação de polímeros como na Ref. 4 </td></tr><tr><td> Cetoprofeno 100 mg / ml </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> 71-ceto-100-50 </td><td></td></tr><tr><td> LabDiet 5001 roedores </td><td> LabDiet </td><td> 5001 </td><td></td></tr><tr><td> Septra 200 mg / 40 mg por 5 ml, USP </td><td> Oi-Tech Pharmacal </td><td> 50383-824-16 </td><td></td></tr><tr><td> USP, isoflurano </td><td> Phoenix Pharmaceuticals </td><td> 57319-507-06 </td><td></td></tr></tbody></table>

engenharia de tecidos do intestino num modelo murino

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

O tecido de intestino delgado (TESI) tem sido usados ​​com sucesso para resgatar ratos Lewis após a ressecção intestinal maciça pequeno, resultando em retorno aos pesos pré-operatórios dentro de 40 dias. 1 em humanos, a ressecção intestinal maciça pequeno pode resultar em síndrome do intestino curto, uma má absorção funcional Estado que confere significativa morbidade, mortalidade e custos de saúde, incluindo a dependência da nutrição parenteral, insuficiência hepática e cirrose, e da necessidade de transplante de órgãos multivisceral. 2 Neste trabalho, descrever e documentar o nosso protocolo para criar o tecido de intestino em um modelo de camundongo com um multicelular organóides abordagem unidades-em-andaime. Unidades organóides são agregados multicelulares derivadas do intestino que contêm elementos e mucosas mesenquimal, 3 a relação entre o que preserva o nicho de células-tronco intestinal. 4 Na investigação em curso e futuras, a transição da nossa técnica para orato irá permitir uma investigação dos processos envolvidos na formação TESI utilizando as ferramentas transgénicas disponíveis nesta espécie. 5 A disponibilidade de estirpes de ratos imunodeficientes também nos permite aplicar a técnica de tecido intestinal humano e optimizar a formação de TESI humano como um xenoenxerto mouse antes de sua transição para os seres humanos. Nosso método emprega boas práticas de fabricação (BPF) reagentes e materiais que já foram aprovadas para o uso em pacientes humanos, e, portanto, oferece uma vantagem significativa sobre as abordagens que dependem de tecidos animais descelularizados. O objetivo final deste método é a sua tradução para os seres humanos como uma estratégia de medicina regenerativa terapêutica para a síndrome do intestino curto.

A Figura 1 mostra um esquema geral para o protocolo aqui documentado. O resultado final deste protocolo é uma estrutura globo esférico ou de intestino de engenharia de tecidos de murino com um lúmen, mucosa, submucosa, e rodeando 2A. Muscularis Figura mostra um globo típica em comparação com o polímero de partida de um andaime. Figura 2B mostra a mesma construção acentuadamente bivalvadas para revelar seu lúmen. Figura 3 demonstra um he...

Este artigo eo vídeo que acompanha apresentar o nosso protocolo para gerar o tecido de intestino no mouse, utilizando uma abordagem de unidades-em-andaime organóide.

Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

O intestino delgado engenheirado (TESI) tem sido utilizado com sucesso para resgatar ratos Lewis após ressecção massiva do intestino delgado, resultando no retorno ao...

Este vídeo demonstrará nossa técnica para gerar intestino delgado bioengenharizado em camundongo, utilizando uma abordagem de unidades de organoides em suporte. Neste experimento, os animais foram tratados de acordo com as diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais e da Instalação de Cuidados com Animais do Instituto de Pesquisa Savon do Hospital Infantil de Los Angeles. O primeiro passo é a obtenção de intestino completo de camundongo.O camundongo eutanasiado de forma humanitária e os instrumentos são preparados com etanol a 70% em água, e uma incisão mediana é feita para acessar a cavidade peritoneal. O intestino delgado é eviscerado e dividido logo distal ao ligamento de Treitz. Em seguida, é dissecado cuidadosamente, com técnica afiada e romba, do mesentério e de seus vasos.Finalmente, o íleo foi seccionado cinco milímetros proximalmente à válvula íleo-cecal. O intestino delgado coletado é mostrado em escala. Aqui, procedemos a abrir o intestino no sentido longitudinal ao longo da borda antimesentérica em solução salina tamponada com Hank contendo antibiótico e antifúngico na concentração 1X.O intestino é então limpo de matéria fecal na placa, seguido por t

tissue-engineering-of-the-intestine-in-a-murine-model

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve o protocolo detalhado para ressecção intestinal em um modelo murino. Essa técnica fornece informações sobre a má absorção, o acúmulo excessivo e a toxicidade da bile induzida por ileectomia no intestino de camundongos.

Modelo de Ressecção Ileal Murina: Estudando o Metabolismo da Bílis Induzido por Ileectomia em Modelo Murino

Este vídeo demonstra a geração de um modelo de alça ileal para estudar a permeabilidade intestinal em um modelo de camundongo. Este método fornece um modelo vivo para entender a função da barreira epitelial e a consequente resposta imune.

Modelo de alça ileal de camundongo: um modelo cirúrgico para estudar a permeabilidade intestinal no camundongo

O artigo descreve um método para a produção de uma matriz acelular a partir de intestino de rato. A derivação de andaimes intestinal é importante para futuras aplicações em engenharia de tecidos, biologia das células estaminais e testes de drogas.

A Metodologia Decelularização para a produção de um Intestinal Matrix Natural Acellular

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

Pequenas técnicas de imagem animais permitem exames de diagnóstico de série e intervenções terapêuticas in vivo. Recentemente, o leque de aplicações tem aumentado significativamente e atualmente inclui avaliação do desenvolvimento de tumor do cólon, cicatrização de feridas e monitoramento da inflamação. Este protocolo ilustra essas aplicações potenciais diferentes de endoscopia murino.

Murino Endoscopia para In Vivo Cura Multimodal imagem de Carcinogênese e Avaliação de Intestinal ferida e inflamação

Células-tronco do epitélio intestinal (ISC) são misturados com células de Paneth. Estas células são diferenciadas progênie do ISC, que suportam o ISC e fornecer proteção antibacteriana. Aqui demonstramos como nós usamos modelos de ratos transgénicos condicionais para estabelecer que as células de Paneth desempenham um papel crucial na manutenção dos epitélio intestinal.

Protocolos para analisar o papel das células Paneth em Regenerar o Intestino Murino utilizando Condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Models

Aqui nós descrevemos o procedimento detalhado de isquemia e reperfusão em ratos que resulta em lesão reprodutível sem mortalidade para incentivar a padronização da técnica em todo o campo. Este modelo de lesão por isquemia-reperfusão intestinal pode ser utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares da lesão e da regeneração.

Modelo murino de isquemia-reperfusão

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Este protocolo oferece instruções detalhadas para estabelecer organoides do intestino delgado murine, isolar células linfoides tipo 1 da lamina propria do intestino delgado murina e estabelecer coculturas tridimensionais (3D) entre ambos os tipos de células para estudar interações bidirecionais entre células epiteliais intestinais e células linfoides inatas tipo 1.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Descrevemos um protocolo detalhando o isolamento de criptas colônicas murinas para o desenvolvimento de colonóides tridimensionais. Os colonóides estabelecidos podem então ser terminalmente diferenciados para refletir a composição celular do epitélio do hospedeiro antes de receber um desafio inflamatório ou serem direcionados para estabelecer uma monocamada epitelial.

Estudando os Efeitos Epiteliais da Inflamação Intestinal In Vitro em Colonóides Murinos Estabelecidos

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

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Engenharia de Tecidos do Intestino num modelo murino

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