Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

Este sistema modelo bioquimicamente definido de grandes vesículas Ella imita a membrana mitocondrial externa para observar a função das proteínas BCL dois in vitro. Primeiro, combine os lipídios e crie um filme lipídico em um frasco selado. Em seguida, prepare uma solução fresca de LUV e solubilize o filme lipídico.

Em seguida, extruda-se a solução lipídica e purificam-se as grandes ELVs por filtração em gel. O passo final consiste em analisar as LUVs quanto ao aumento da fluorescência induzido por detergente. Em última instância, o sistema modelo de LUVs é empregado para avaliar a função e regulação de proteínas permeáveis à membrana, como as proteínas BCL2 recombinantes.

Essa abordagem que utiliza vesículas grandes tem várias vantagens em comparação com sistemas existentes, como as mitocôndrias. As vesículas são geradas com lipídios purificados na ausência de proteínas. Elas são definidas bioquimicamente tanto na composição quanto no tamanho.

Isso permite interpretações claras dos resultados, já que as únicas proteínas em sua investigação são aquelas que você adiciona. Este método pode fornecer insights mecanicistas sobre a capacidade da família BCL dois de regular a integridade da membrana mitocondrial externa. Também pode ser aplicado a outros sistemas que investigam remodelamento de membrana e atividade permeabilizante.

Isso incluiria maquinaria dinâmica mitocondrial ou toxinas formadoras de bactérias. Trabalhe em uma capela com iluminação mínima. Enxágue uma seringa de vidro do tipo Hamilton Gast com clorofórmio.

Em seguida, em um vial de vidro GL de 1,5 mililitro, combine os quatro miligramas de lipídios solubilizados em clorofórmio. Em seguida, para remover o clorofórmio, aplique um fluxo suave de um gás inerte, como nitrogênio ou argônio. Após duas a três horas, verifique a presença de uma película lipídica seca no fundo e nas paredes do vial no tampão LUV.

Prepare soluções de 500 microlitros do corante policatiônico e do quenchador iônico CAS vortex. As soluções a serem misturadas. Em seguida, combine as soluções de A NTS e DPX vortex por um minuto e sonique em banho de água ultrassônico para garantir que as soluções estejam completamente solubilizadas e homogêneas.

Agora, adicione a solução A-N-T-S-D-P-X ao filme lipídico e feche o frasco com filme parafilm. Sonique o filme lipídico por cinco minutos. A solução ficará opaca após a sonicação. Certifique-se de que a solução esteja completamente solubilizada, pois agregados lipídicos pequenos afetarão negativamente as etapas subsequentes. Além disso, verifique o fundo e as laterais do frasco para garantir que não haja filme lipídico remanescente.

Monte o extrusor de acordo com as orientações do fabricante, utilizando tampão LUV para umedecer os suportes do filtro e a membrana de policarbonato, apertando o invólucro do equipamento de modo a evitar perda de volume durante a extrusão, mas sem apertar em excesso. Para romper a membrana, teste o extrusor com tampão LUV para garantir que não haja vazamentos ou problemas. Agora, preencha a seringa da direita com a solução lipídica e realize 31 extrusões para que as vesículas grandes de ELLA atravessem a membrana pelo menos uma vez e sejam coletadas na seringa da esquerda. Nas primeiras extrusões, pode ser necessária um pouco mais de pressão, caso a solução atravesse repentinamente e rapidamente a membrana.

Verifique a membrana quanto a ruptura e substitua, se necessário. Adicione à coluna em um único passo. Evite perturbar a interface das esferas.

Deixe o tampão passar pela coluna. Quando o fluxo parar, tampe a coluna e encha cuidadosamente com tampão LUV, certificando-se de não perturbar as esferas. Em seguida, remova a tampa e colete seis frações de um mililitro.

Os AUVs normalmente eluem nas frações três e quatro e podem ser identificados por uma aparência turva para reciclar a lavagem da coluna e armazenar a quatro graus Celsius. Os UUVs na fração da coluna são detectados por um aumento na fluorescência devido à presença de chaps. Lembre-se de usar placas de 96 poços opacas pretas para todos os estudos com LUVs.

Pipete 100 microlitros de tampão LUV ou LUV mais 0,5% CHAPS em seis poços. Em cada poço, adicione cinco microlitros da fração apropriada e misture para a sinergia biotecnológica H1. Abra o software Gen5 2.0, com comprimento de onda de excitação de 355 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 520 nanômetros.

Ganhe tensão na posição óptica 125 no topo e leia a altura em 5,5 milímetros. Agora leia a placa a 37 graus Celsius e identifique as frações contendo LUV. Retire as frações de LUV purificadas.

Esses ensaios são projetados para medir a capacidade das proteínas BCL dois de induzir diretamente a permeação de LUV e também para a regulação da atividade de permeação. Combine os componentes do ensaio na ordem de adição. Detalhes sobre as titulações das proteínas BS e bid estão disponíveis no manuscrito acompanhante.

Incube as reações a 37 graus Celsius pelos pontos temporais do ensaio. Insira a placa no leitor de microplacas, que irá agitar a placa e medir a fluorescência conforme mostrado anteriormente. Este experimento utiliza vesículas ativadas por detergente OG para gerar um controle positivo de permeação de LUV.

É importante destacar que concentrações de OG abaixo de 0,025% não afetam diretamente a permeação de LUV aqui. Um tratamento com 0,5% de CHAPS também é utilizado para determinar a quantidade máxima de fluorescência de LUV por ensaio. Um ponto inicial necessário para o estudo da permeação de LUV com proteínas da família BCL-2 é estabelecer as concentrações de Bax e Bid para promover a liberação ideal.

Essas curvas de titulação de backs e bid mostram a liberação de fundo mínima e a sinergia ideal. Alternativamente, a permeação de LUV pode ser medida cineticamente. Essas leituras foram realizadas a cada dois minutos durante 30 minutos, com dois segundos de agitação suave da placa antes de cada leitura.

Este experimento determina a influência de uma proteína antiapoptótica na permeação de LUV dependente de Bax e Bid aqui. A BCL-XL inibe a atividade de Bax e Bid de maneira dependente da dose. Em um ensaio de repressão D, o efeito inibitório pode ser revertido pela adição subsequente de proteínas apenas BH3.

Por exemplo, a puma beta liga-se à BCL xl, permitindo assim que as proteínas Bax e Bid atuem de forma sinérgica e promovam a permeabilização. Os grandes vesículos ELLA. Uma vez dominada esta técnica para gerar grandes vesículos unilamelares, permite a análise eficiente e rápida de proteínas da família BCL-2, peptídeos e moléculas pequenas em um ambiente bioquimicamente definido, semelhante à membrana mitocondrial externa. Importante, este ensaio permite a análise rápida de centenas de condições, utilizando tanto pontos finais quanto parâmetros cinéticos.

Não se esqueça de que ambas as proteínas UUVs e BCL são altamente suscetíveis a artefatos induzidos por detergentes. Use equipamentos limpos, livres de detergentes, para garantir resultados reprodutíveis.