Name: Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprenda a criar vesículas unilamelares grandes para estudar interações de proteínas BCL-2 em membranas mitocondriais. Este método bioquímico permite analisar permeabilização e regulação da apoptose in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Laboratório Chipuk pelo companheirismo e apoio. Além disso, gostaríamos de expressar nossa gratidão a Tomomi Kuwana e Donald Newmeyer pelo desenvolvimento da base experimental para este trabalho. Este trabalho foi financiado por: NIH CA157740 (para J.E.C.) e um projeto-piloto da NIH P20AA017067 (para J.E.C.). Este trabalho também foi parcialmente apoiado por uma Bolsa de Pesquisa 5-FY11-74 da Fundação March of Dimes (para J.E.C.).

1. Combine lipídios e crie um filme lipídico
<ol>
	<li>Trabalhando em uma capela com iluminação mínima, lipídios solubilizados em clorofórmio são combinados em um frasco âmbar de vidro de 1,5 ml utilizando uma seringa de vidro estanque ao gás Hamilton previamente lavada com clorofórmio. Essa combinação produzirá aproximadamente 4 mg de lipídio (Figura 1A).
	<ul>
		<li>Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl</li>
		<li>Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl</li>
		<li>Fosfatidiletanolamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl</li>
		<li>Fosfatidilinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl</li>
		<li>Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Para remover o clorofórmio, aplique um fluxo suave de um gás inerte (por exemplo, nitrogênio ou argônio) no frasco. Um filme lipídico se tornará visível no fundo e nas laterais do frasco quando estiver seco, o que normalmente leva de 2 a 3 horas (Figura 1A).</li>
</ol>
2. Preparar Solução de Lipossomos
<ol>
	<li>Em tubos microcentrífugos de 1,7 ml, prepare 500 μl de ANTS 12,5 mM no tampão LUV (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl2 ) e 500 μl de DPX 45 mM no tampão LUV (Figura 1B).</li>
	<li>Misture as soluções de ANTS e DPX, vortexie por 1 minuto e sonique por 1 minuto à temperatura ambiente. A sonicação é realizada em um banho de ultrassom aquoso (por exemplo, Branson 3510MTH, sem ajuste, apenas ligado). Isso garante que as soluções estejam completamente solubilizadas e homogêneas.</li>
	<li>Adicione a solução de ANTS/DPX ao filme lipídico e feche o frasco com parafilm (Figura 1B).</li>
	<li>Sonique o filme lipídico no banho aquoso descrito acima por 5 minutos. A solução apresentará aparência leitosa após a sonicação. Certifique-se de que o filme lipídico esteja completamente solubilizado, pois agregados lipídicos pequenos afetarão negativamente as etapas subsequentes. Além disso, verifique as laterais e a base do frasco para garantir que não reste filme lipídico (Figura 1B).</li>
</ol>
3. Extrusão e Purificação de Lipossomos
<ol>
	<li>Monte o extrusor de acordo com as orientações do fabricante, utilizando o tampão LUV para umedecer os suportes do filtro e a membrana de policarbonato. Aperte o invólucro do equipamento para que não haja perda de volume durante a extrusão, mas sem exagerar a ponto de romper a membrana. Também é recomendável testar o extrusor com o tampão LUV para garantir que não haja vazamentos ou problemas.</li>
	<li>Inicie com a solução lipídica na seringa da direita e realize a extrusão da solução lipídica 31 vezes; ao final, as LUVs estarão na seringa da esquerda. Isso garante que todos os lipídios tenham atravessado a membrana pelo menos uma vez. Nas primeiras passagens, pode ser necessário um pouco mais de pressão para atravessar a membrana. Se a solução passar subitamente pela membrana com rapidez, verifique se houve ruptura e substitua a membrana, se necessário (Figura 1C).</li>
	<li>Monte uma coluna de Sepharose S-500 de fluxo por gravidade com volume de 10 ml (1,0 cm x 20 cm, volume de 10 ml de perlas). Lave com 3 volumes da coluna de tampão LUV, deixe o fluxo parar e tampe a coluna. Como este passo leva algum tempo, é preferível iniciar a lavagem enquanto os lipídios estão sendo secos. Mantenha a coluna tampada até o momento de utilizá-la.</li>
	<li>Adicione as LUVs extrudidas à coluna em um único passo, evitando perturbar a interface das perlas. Deixe o tampão escoar completamente da coluna, até que o fluxo pare, e então feche com um tampão. Encha cuidadosamente a coluna com tampão LUV. Novamente, tenha cuidado ao adicionar o tampão para não perturbar as perlas (Figura 1C).</li>
	<li>Remova o tampão e colete 6 frações de 1 ml cada. As LUVs normalmente eluem nas frações 3 e 4, sendo identificáveis por uma aparência turva. Após a coleta das frações, lave a coluna com 5 volumes de água e 2 volumes de etanol a 20%. Armazene a coluna a 4 °C (Figura 1C).</li>
	<li>Armazene as frações a 4 °C, protegidas da luz, até o momento dos testes.</li>
</ol>
4. Testar as Frações da Coluna
<ol>
	<li>As frações da coluna são agora testadas quanto à fluorescência, comparando o tampão LUV com o tampão LUV suplementado com 0,5% de CHAPS. As frações que apresentam aumento na fluorescência devido à presença de CHAPS contêm LUVs. Pipete 100 μl de tampão LUV ou tampão LUV + 0,5% CHAPS em seis poços cada e adicione 5 μl da fração apropriada, misturando bem. Utilize placas de 96 poços opacas, pretas e não tratadas para todos os estudos com LUVs (Figura 1D).</li>
	<li>Leia a placa a 37 °C com os seguintes parâmetros: comprimento de onda de excitação: 355 nm; comprimento de onda de emissão: 520 nm; ganho (voltagem): 125; posição da óptica: superior; altura de leitura: 5,5 mm. Esta configuração é para o BioTek H1 Synergy utilizando o software Gen 5 2.0 (Figura 1D).</li>
	<li>As frações 3 e 4 geralmente mostram um aumento de 5 a 10 vezes na fluorescência. Após a análise, combine as frações contendo LUVs e armazene a 4 °C no escuro; aproximadamente 2 ml de lipídio a ~ 2 mM serão purificados (Figura 1D).</li>
</ol>
5. Estudos da Família BCL-2 Utilizando LUVs
<ol>
	<li>Proteínas BCL-2 são testadas quanto à sua capacidade de induzir diretamente a permeabilização de LUVs e quanto à regulação da atividade de permeabilização. Os ensaios com LUVs são normalmente realizados em volumes de 100 μl, a 37 °C, e podem ser analisados em um único ponto temporal após 30 - 60 min (Figuras 2A-C, 3A-B), ou por meio de estudos cinéticos a cada 1 - 2 min durante até 1 h (Figura 2D). Um exemplo de delineamento de ensaio descrevendo componentes, concentrações estoque/finais e ordem de adição é fornecido (Tabela 1). Também é recomendável que o leitor de microplacas agite suavemente a placa antes de cada leitura. Os primeiros minutos frequentemente apresentam leituras esparsas (provavelmente devido a mudanças de temperatura, mistura, etc.), portanto geralmente consideramos os pontos de dados após 2 - 3 leituras em um estudo cinético. Também não é incomum obter barras de erro grandes para algumas das condições, devido à variabilidade entre lotes de LUVs e à eficiência das interações proteicas em concentrações limítrofes de ativação ou inibição.</li>
	<li>Estoques de proteínas da família BCL-2 devem ser diluídos no tampão de LUVs em uma concentração 100x, e titulações necessárias de BAX, BID e todas as demais proteínas devem ser realizadas para determinar as menores concentrações necessárias para detectar permeabilização mínima de LUVs dependente de BAX na ausência de BID, e sinergia significativa entre BAX e BID. Além disso, todas as demais proteínas requerem titulações para reduzir o desperdício proteico e minimizar as concentrações de adições proteicas subsequentes.</li>
</ol>
6. Resultados Representativos
Há inúmeras opções para observar e examinar a regulação dependente da família BCL-2 na permeabilização de LUVs. Para gerar um controle positivo de permeabilização de LUV, utilizamos BAX ativado por detergente12. O detergente, n-octil-β-D-glucosídeo (OG), induz artificialmente a ativação do BAX (para 100 μl de BAX-OG a 2,3 μM: 5 μg de BAX + 0,7% de OG no tampão de LUV, incubar por 60 min a 4 °C, alíquotar e armazenar a -80 °C); portanto, o BAX-OG (10 - 100 nM) pode ser usado como um controle positivo confiável. Vale ressaltar que concentrações de OG abaixo de 0,025% não afetam diretamente a permeabilização de LUV. Um tratamento com CHAPS a 0,5% é utilizado para determinar a quantidade máxima de fluorescência de LUV por ensaio, e esse valor define a marca de 100%. Todos os tratamentos devem ser montados em triplicata. Um exemplo de montagem de ensaio controle com LUV é mostrado na Tabela 1, e os dados correspondentes são apresentados na Figura 2A.
Um ponto inicial necessário para estudar a permeabilização de LUV com proteínas da família BCL-2 é estabelecer as concentrações de BAX e BID que promovem liberação ideal. Como diferentes preparações individuais de proteínas apresentarão atividades de permeabilização de fundo distintas, é aconselhável realizar uma titulação antes de montar análises mais sofisticadas. BAX (50 - 200 nM) e BID (0 - 10 nM) devem ser titulados para obter liberação de fundo mínima e sinergia ideal, conforme mostrado nas Figuras 2B-C, respectivamente. Diversas formas da proteína BID podem ser adquiridas da R&amp;D Systems; alternativamente, o peptídeo do domínio BH3 de BID está disponível na Anaspec. Não existe forma comercial de BAX apropriada para ensaios com LUV, portanto ela deve ser expressa e purificada utilizando métodos publicados3,13.
Uma vez estabelecidas as concentrações de BAX e BID e sua sinergia, um ensaio comum é determinar a influência de proteínas antiapoptóticas na permeabilização de LUVs dependente de BAX e BID. BCL-xL é um membro antiapoptótico da família BCL-2 disponível comercialmente que, de maneira dose-dependente, inibe a atividade de BAX e BID, geralmente na faixa de excesso molar de 5 a 10 vezes em relação a BAX ou BID (Figura 3A). Esse efeito inibitório pode ser revertido pela adição subsequente de proteínas somente do domínio BH3 (excesso molar de 2 a 5 vezes em relação a BCL-xL) ou peptídeos do domínio BH3 (excesso molar de 5 a 10 vezes em relação a BCL-xL), que se ligam a BCL-xL, permitindo assim que BAX e BID atuem de forma sinérgica e permeabilizem os LUVs (Figura 3B). Na Figura 3B, mostramos o efeito da proteína humana recombinante completa PUMAβ, sendo que o peptídeo do domínio BH3 de PUMA é funcionalmente semelhante (dados não mostrados)8. Esse experimento é comumente denominado 'ensaio de desrepressão', pois a proteína PUMA alivia o efeito inibitório de BCL-xL sobre BAX e BID. Idealmente, a adição da proteína/peptídeo somente do domínio BH3 que promove a desrepressão deve ter efeitos mínimos sobre a ativação de BAX14.
<img alt="Diagrama do processo de síntese e purificação de lipídios; etapas detalhadas de cromatografia e análise de frações." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. (A) Lipídios solubilizados em clorofórmio são combinados, secos para formar um filme lipídico e tampados. (B) Soluções de ANTS e DPX são preparadas, misturadas e sonicadas para garantir solubilização e homogeneização completas. A solução é adicionada ao filme lipídico, o frasco é selado com parafilm e sonicado por 5 min em banho-maria. A solução agora apresentará aparência leitosa. (C) A solução lipídica sonicada é carregada no miniextrusor, processada 31 vezes e adicionada a uma coluna preparada de Sepharose S-500 para purificação subsequente. (D) As frações obtidas após cromatografia de exclusão por tamanho são analisadas comparando-se as unidades fluorescentes relativas (UFR) no tampão LUV e no tampão LUV + 0,5% CHAPS. A leitura em "tampão LUV" indica fluorescência de fundo com LUVs intactas; a condição "tampão LUV + 0,5% CHAPS" mostrará aumento de fluorescência induzido pela lise, indicativo de LUVs. As frações 3 e 4 geralmente contêm as LUVs e são combinadas após análise. As frações 5 e 6 contêm ANTS não incorporado (ou seja, não dentro das LUVs após extrusão), que apresentam alta fluorescência independente do CHAPS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4291/4291fig1large.jpg" target="_blank"> Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior</a>.
<img alt="Gráficos de barras de permeabilização de LUV mostrando os efeitos da titulação de BAX e BID; gráfico da intensidade de fluorescência ao longo do tempo." fo:content-width="5.45in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Experimentos de controle da família BCL-2 e titulações de BAX/BID utilizando LUVs. (A) Experimentos de controle. LUVs foram tratados apenas com tampão de LUV, 0,025% de octilglicosídeo "OG", 50 nM de BAX ou 50 nM de OG-BAX. As LUVs foram incubadas por 60 min a 37 °C. A permeabilização (%) é determinada subtraindo-se a fluorescência do tratamento com tampão de todas as amostras; a permeabilização de 100% é determinada por uma amostra solubilizada com CHAPS 0,5%; divide-se os valores experimentais pelo valor do CHAPS para obter a permeabilização percentual de LUV. OG-BAX é o BAX ativado por detergente, que serve como controle positivo confiável para permeabilização de LUV. (B) Determinação da concentração ótima de BAX. LUVs foram tratadas com concentrações crescentes de BAX (50 - 200 nM) na presença de 10 nM de C8-BID "BID" ou apenas tampão. (C) Determinação da concentração ótima de BID. LUVs foram tratadas com concentrações crescentes de BID (0 - 10 nM) na presença de 100 nM de BAX. (D) Um exemplo de conjunto de dados cinéticos de permeabilização de LUV. LUVs foram tratadas com BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Leituras foram realizadas a cada dois minutos durante 30 min, com agitação suave da placa por dois segundos antes de cada leitura. As três primeiras leituras (0, 2 e 4 min) não estão incluídas no gráfico. As unidades relativas mínima e máxima de fluorescência (RFU) foram determinadas conforme descrito na seção 4.3. As barras de erro nas Figuras 2A-C representam o desvio padrão de dados triplicados. Os dados na 2D representam um ensaio em duplicata.
<img alt="Gráficos de barras de permeabilização de LUVs; influência de BID/BAX/BCL-xL e PUMA; análise experimental." fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4291/4291fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Exemplos de interações comuns entre membros da família BCL-2 investigadas utilizando LUVs. (A) A permeabilização de LUVs mediada por BAX e BID é inibida por BCL-xL. LUVs foram incubadas com 100 nM de BAX, 10 nM de BID e concentrações crescentes de BCL-xL (0 – 500 nM). A incubação das LUVs ocorreu por 60 min a 37 °C. (B) PUMA desreprime BCL-xL para promover a função de BAX e BID. LUVs foram incubadas com combinações de 100 nM de BAX, 10 nM de BID, 500 nM de BCL-xL e PUMA (0 – 2,5 μM) por 60 min a 37 °C. PUMA foi usado na concentração de 2,5 μM com BAX isoladamente. As barras de erro representam o desvio padrão de dados triplicados.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ordem de adição:</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CONDIÇÕES</td>
			<td>LUV 
			Tampão</td>
			<td>OG 
			(0,7%)</td>
			<td>BAX 
			(2,3 μM)</td>
			<td>OG-BAX 
			(2,3 μM)</td>
			<td>CHAPS 
			(10%)</td>
			<td>LUVs 
			(2 mM)</td>
			<td>TOTAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tampão</td>
			<td>95 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG (0,015%)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAX (50 nM)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td>-</td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OG-BAX (50 nM)</td>
			<td>92,83 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>2,17 μl</td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS (0,5%)</td>
			<td>90 μl</td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>5 μl</td>
			<td>5 μl</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Um exemplo de ensaio controle para determinar o efeito do OG-BAX na permeabilização de LUV.

<ol><li>Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BCL-2+family+reunion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The BCL-2 family reunion.</a> Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+ten+minutes+to+dead%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: ten minutes to dead.</a> Cell. 121, 671-674 (2005).</li>
<li>Gavathiotis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAX+activation+is+initiated+at+a+novel+interaction+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAX activation is initiated at a novel interaction site.</a> Nature. 455, 1076-1081 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+trigger+apoptosis%2C+Bak+exposes+its+BH3+domain+and+homodimerizes+via+BH3%3Agroove+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions.</a> Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).</li>
<li>Dewson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bak+activation+for+apoptosis+involves+oligomerization+of+dimers+via+their+alpha6+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices.</a> Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).</li>
<li>Gavathiotis, E., Reyna, D. E., Davis, M. L., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-triggered+structural+reorganization+drives+the+activation+of+proapoptotic+BAX%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3-triggered structural reorganization drives the activation of proapoptotic BAX.</a> Mol. Cell. 40, 481-492 (2010).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+of+BH3-only+proteins+differentially+regulate+Bax-mediated+mitochondrial+membrane+permeabilization+both+directly+and+indirectly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly.</a> Mol. Cell. 17, 525-535 (2005).</li>
<li>Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+apoptosis+induction+by+inhibition+of+the+anti-apoptotic+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of apoptosis induction by inhibition of the anti-apoptotic BCL-2 proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20327-20332 (2008).</li>
<li>Letai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+BH3+domains+either+sensitize+or+activate+mitochondrial+apoptosis%2C+serving+as+prototype+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 2, 183-192 (2002).</li>
<li>Kuwana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lipids+cooperate+to+form+supramolecular+openings+in+the+outer+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane.</a> Cell. 111, 331-342 (2002).</li>
<li>Lovell, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+by+tBid+initiates+an+ordered+series+of+events+culminating+in+membrane+permeabilization+by+Bax%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax.</a> Cell. 135, 1074-1084 (2008).</li>
<li>Hsu, Y. T., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonionic+detergents+induce+dimerization+among+members+of+the+Bcl-2+family%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family.</a> J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Bax%3A+coregulation+of+dimer+formation+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization.</a> Cell. 103, 645-654 (2000).</li>
<li>Du, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3+domains+other+than+Bim+and+Bid+can+directly+activate+Bax%2FBak%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak.</a> J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

O método descrito para gerar LUVs permite uma forma rápida e eficiente de testar a função de várias proteínas da família BCL-2, peptídeos e reagentes relacionados em um ambiente de membrana definido bioquimicamente, semelhante à MMO. Se forem utilizados valores finais para determinar a permeabilização de LUVs, várias placas podem ser montadas para analisar centenas de condições em um único dia. Observamos que os reagentes limitantes nestes ensaios costumam ser a qualidade e a quantidade das proteínas recombinantes; porta...

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph&amp;#8211;thanolamine &quot;PE&quot;</td><td>Avanti</td><td>850725C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidilcolina (Ovo, Galinha) &quot;PC&quot;</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidilinositol (Fígado, Bovino) &quot;PI&quot;</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-Fosfatidilserina (Cérebro, Suíno) &quot;PS&quot;</td><td>Avanti</td><td>8400320</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipina (Coração, Bovino - Sal de Sódio) &quot;CL&quot;</td><td>Avanti</td><td>840012C</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto mini-extrusor</td><td>Avanti</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PC 0,2 mM</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Placa Costar preta de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td></td></tr><tr><td>BID clivada por caspase-8 humana</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>882-B8-050</td><td></td></tr><tr><td>BCL-xL humano (sem o extremo C)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>894-BX-050</td><td></td></tr><tr><td>Peptídeos dos domínios BH3 de BID/PUMA</td><td>Anaspec</td><td>61711/62404</td><td></td></tr><tr><td>Leitor microplaquetas multifuncional Synergy H1</td><td>BioTek</td><td>None</td><td></td></tr></tbody></table>

examinando bcl-2 função família com grandes vesículas unilamelares

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

A família BCL-2 (linfoma de células B CLL/linfoma) é composta por aproximadamente vinte proteínas que colaboram para manter a sobrevivência celular ou iniciar a apoptose1. Após estresse celular (por exemplo, dano ao DNA), os efetores pró-apoptóticos da família BCL-2, BAK (mortal antagonista de BCL-2 1) e/ou BAX (proteína associada a BCL-2 X), são ativados e comprometem a integridade da membrana mitocondrial externa (MME), por meio do processo denominado permeabilização da membrana mitocondrial externa (MME)1. Após a ocorrência da MME, proteínas pró-apoptóticas (por exemplo, citocromo c) ganham acesso ao citoplasma, promovem a ativação de caspases e a apoptose ocorre rapidamente2.
Para que BAK/BAX induzam a MOMP, eles requerem interações transitórias com membros de um outro subconjunto pró-apoptótico da família BCL-2, as proteínas somente do domínio de homologia BCL-2 (BH3), como BID (agonista do domínio interativo BH3)3-6. As proteínas da família BCL-2 antiapoptóticas (por exemplo, gene relacionado à BCL-2, isoforma longa, BCL-xL; leucemia de células mieloides 1, MCL-1) regulam a sobrevivência celular controlando rigorosamente as interações entre BAK/BAX e as proteínas somente BH3 capazes de induzir diretamente a ativação de BAK/BAX7,8. Além disso, a disponibilidade das proteínas BCL-2 antiapoptóticas também é determinada pelas proteínas sensibilizadoras/desrepressoras somente BH3, como BAD (antagonista da morte celular BCL-2) ou PUMA (modulador da apoptose regulado por p53), que se ligam e inibem membros antiapoptóticos7,9. Como a maior parte do repertório de BCL-2 antiapoptótica está localizado na MMO, a decisão celular entre manter a sobrevivência ou induzir a MOMP é determinada por múltiplas interações da família BCL-2 nesta membrana.
 Vesículas unilamelares grandes (VULCs) são um modelo bioquímico para explorar as relações entre as interações da família BCL-2 e a permeabilização da membrana10. As LUVs são compostas por lipídios definidos que são montados em proporções identificadas em estudos de composição lipídica a partir de mitocôndrias de Xenopus extraídas com solvente (46,5% fosfatidilcolina, 28,5% fosfatidiletanolamina, 9% fosfatidilinositol, 9% fosfatidilserina e 7% cardiolipina)10. Este é um sistema modelo conveniente para explorar diretamente a função da família BCL-2, pois os componentes proteicos e lipídicos são completamente definidos e passíveis de manipulação, o que nem sempre ocorre com mitocôndrias primárias. Embora a cardiolipina normalmente não esteja presente em concentrações tão elevadas em toda a membrana mitocondrial externa (OMM), este modelo imita fielmente a OMM para promover a função da família BCL-2. Além disso, uma modificação mais recente do protocolo descrito permite análises cinéticas de interações proteicas e medidas em tempo real da permeabilização da membrana, baseadas em LUVs contendo um corante policatiônico (ANTS: 8-aminonaftaleno-1,3,6-trissulfônico) e um quenchador catiônico (DPX: p-xileno-bis-piridínio brometo)11À medida que as LUVs se tornam permeáveis, ANTS e DPX difundem-se separadamente, e um aumento na fluorescência é detectado. Aqui, são descritas combinações comumente utilizadas de proteínas recombinantes da família BCL-2 e controles empregando LUVs contendo ANTS/DPX.

Vesículas unilamelares grandes (LUVs) bioquimicamente definidas são um sistema modelo conveniente para analisar as interações da família BCL-2, com implicações diretas na melhor compreensão da via mitocondrial da apoptose. Apresenta-se um método para produção de LUVs, juntamente com combinações padrão de proteínas da família BCL-2 e controles para examinar a permeabilização de LUVs.

Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

A família BCL-2 (CLL/Linfoma de células B) é composta por aproximadamente vinte proteínas que colaboram para manter a sobrevivência celular ou iniciar...

Este sistema modelo bioquimicamente definido de grandes vesículas Ella imita a membrana mitocondrial externa para observar a função das proteínas BCL dois in vitro. Primeiro, combine os lipídios e crie um filme lipídico em um frasco selado. Em seguida, prepare uma solução fresca de LUV e solubilize o filme lipídico.Em seguida, extruda-se a solução lipídica e purificam-se as grandes ELVs por filtração em gel. O passo final consiste em analisar as LUVs quanto ao aumento da fluorescência induzido por detergente. Em última instância, o sistema modelo de LUVs é empregado para avaliar a função e regulação de proteínas permeáveis à membrana, como as proteínas BCL2 recombinantes.Essa abordagem que utiliza vesículas grandes tem várias vantagens em comparação com sistemas existentes, como as mitocôndrias. As vesículas são geradas com lipídios purificados na ausência de proteínas. Elas são definidas bioquimicamente tanto na composição quanto no tamanho.Isso permite interpretações claras dos resultados, já que as únicas proteínas em sua investigação são aquelas que você adiciona. Este método pode fornecer insights mecanicistas sobre a capacidade da família BCL dois de regular a integridade da membrana mitocondrial externa. Também pode ser aplicado a outros sistemas que investigam remodelamento de membrana e atividade permeabilizante.Isso incluiria maquinaria dinâmica mitocondrial ou toxinas formadoras de bactérias. Trabalhe em uma capela com iluminação mínima. Enxágue uma seringa de vidro do tipo Hamilton Gast com clorofórmio.Em seguida, em um vial de vidro GL de 1,5 mililitro, combine os quatro miligramas de lipídios solubilizados em clorofórmio. Em seguida, para remover o clorofórmio, aplique um fluxo suave de um gás inerte, como nitrogênio ou argônio. Após duas a três horas, verifique a presença de uma película lipídica seca no fundo e nas paredes do vial no tampão LUV.Prepare soluções de 500 microlitros do corante policatiônico e do quenchador iônico CAS vortex. As soluções a serem misturadas. Em seguida, combine as soluções de A NTS e DPX vortex por um minuto e sonique em banho de água ultrassônico para garantir que as soluções estejam completamente solubilizadas e homogêneas.Agora, adicione a solução A-N-T-S-D-P-X ao filme lipídico e feche o frasco com filme parafilm. Sonique o filme lipídico por cinco minutos. A solução ficará opaca após a sonicação. Certifique-se de que a solução esteja completamente solubilizada, pois agregados lipídicos pequenos afetarão negativamente as etapas subsequentes. Além disso, verifique o fundo e as laterais do frasco para garantir que não haja filme lipídico remanescente.Monte o extrusor de acordo com as orientações do fabricante, utilizando tampão LUV para umedecer os suportes do filtro e a membrana de policarbonato, apertando o invólucro do equipamento de modo a evitar perda de volume durante a extrusão, mas sem apertar em excesso. Para romper a membrana, teste o extrusor com tampão LUV para garantir que não haja vazamentos ou problemas. Agora, preencha a seringa da direita com a solução lipídica e realize 31 extrusões para que as vesículas grandes de ELLA atravessem a membrana pelo menos uma vez e sejam coletadas na seringa da esquerda. Nas primeiras extrusões, pode ser necessária um pouco mais de pressão, caso a solução atravesse repentinamente e rapidamente a membrana.Verifique a membrana quanto a ruptura e substitua, se necessário. Adicione à coluna em um único passo. Evite perturbar a interface das esferas.Deixe o tampão passar pela coluna. Quando o fluxo parar, tampe a coluna e encha cuidadosamente com tampão LUV, certificando-se de não perturbar as esferas. Em seguida, remova a tampa e colete seis frações de um mililitro.Os AUVs normalmente eluem nas frações três e quatro e podem ser identificados por uma aparência turva para reciclar a lavagem da coluna e armazenar a quatro graus Celsius. Os UUVs na fração da coluna são detectados por um aumento na fluorescência devido à presença de chaps. Lembre-se de usar placas de 96 poços opacas pretas para todos os estudos com LUVs.Pipete 100 microlitros de tampão LUV ou LUV mais 0,5% CHAPS em seis poços. Em cada poço, adicione cinco microlitros da fração apropriada e misture para a sinergia biotecnológica H1. Abra o software Gen5 2.0, com comprimento de onda de excitação de 355 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 520 nanômetros.Ganhe tensão na posição óptica 125 no topo e leia a altura em 5,5 milímetros. Agora leia a placa a 37 graus Celsius e identifique as frações contendo LUV. Retire as frações de LUV purificadas.Esses ensaios são projetados para medir a capacidade das proteínas BCL dois de induzir diretamente a permeação de LUV e também para a regulação da atividade de permeação. Combine os componentes do ensaio na ordem de adição. Detalhes sobre as titulações das proteínas BS e bid estão disponíveis no manuscrito acompanhante.Incube as reações a 37 graus Celsius pelos pontos temporais do ensaio. Insira a placa no leitor de microplacas, que irá agitar a placa e medir a fluorescência conforme mostrado anteriormente. Este experimento utiliza vesículas ativadas por detergente OG para gerar um controle positivo de permeação de LUV.É importante destacar que concentrações de OG abaixo de 0,025% não afetam diretamente a permeação de LUV aqui. Um tratamento com 0,5% de CHAPS também é utilizado para determinar a quantidade máxima de fluorescência de LUV por ensaio. Um ponto inicial necessário para o estudo da permeação de LUV com proteínas da família BCL-2 é estabelecer as concentrações de Bax e Bid para promover a liberação ideal.Essas curvas de titulação de backs e bid mostram a liberação de fundo mínima e a sinergia ideal. Alternativamente, a permeação de LUV pode ser medida cineticamente. Essas leituras foram realizadas a cada dois minutos durante 30 minutos, com dois segundos de agitação suave da placa antes de cada leitura.Este experimento determina a influência de uma proteína antiapoptótica na permeação de LUV dependente de Bax e Bid aqui. A BCL-XL inibe a atividade de Bax e Bid de maneira dependente da dose. Em um ensaio de repressão D, o efeito inibitório pode ser revertido pela adição subsequente de proteínas apenas BH3.Por exemplo, a puma beta liga-se à BCL xl, permitindo assim que as proteínas Bax e Bid atuem de forma sinérgica e promovam a permeabilização. Os grandes vesículos ELLA. Uma vez dominada esta técnica para gerar grandes vesículos unilamelares, permite a análise eficiente e rápida de proteínas da família BCL-2, peptídeos e moléculas pequenas em um ambiente bioquimicamente definido, semelhante à membrana mitocondrial externa. Importante, este ensaio permite a análise rápida de centenas de condições, utilizando tanto pontos finais quanto parâmetros cinéticos.Não se esqueça de que ambas as proteínas UUVs e BCL são altamente suscetíveis a artefatos induzidos por detergentes. Use equipamentos limpos, livres de detergentes, para garantir resultados reprodutíveis.

examining-bcl-2-family-function-with-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Para testar a interação de uma proteína com o seu alvo de lipídios foi utilizado MACS e anexina V conjugada esferas magnéticas e vesículas de lipídios sintetizados a partir de lipídios alvo e fosfatidilserina anexina V vinculativo. Proteínas vinculado à lipídica alvo são co-purificados e analisados ​​após eluição dos grânulos.

Cromatografia de afinidade lipídica mediada por vesículas com separação de células Magnetic Ativado (LIMACS): um novo método para analisar proteínas lipídios Interação

Aqui, apresentamos uma bicamada lipídica suportada no contexto de uma plataforma microfluídica para estudar as interações proteína-fosfoinositide usando um método livre de rótulas baseado na modulação do pH.

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Muitas proteínas na célula sentem e induzem a curvatura da membrana. Nós descrevemos um método para puxar a membrana nanotubos de vesículas lipídicas para estudar a interação de proteínas ou qualquer molécula de curvatura-ativo com membranas curvo em vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

Com suporte sólido, isento de proteína, dobro fosfolipídeo BICAMADA membranas (DLBM) podem ser transformadas em redes de nanotubo de lipídios complexos e dinâmicos e podem servir como modelos 2D de baixo para cima do retículo endoplasmático.

Formação espontânea e rearranjo das redes de nanotubo lipídica Artificial como um modelo de baixo para cima para o retículo endoplasmático

O objetivo do protocolo é medir de forma confiável as propriedades mecânicas da membrana de vesículas gigantes por aspiração micropipette.

Obtenção de vesículas híbridas unilamellares gigantes por eletroformação e medição de suas propriedades mecânicas pela aspiração micropipette

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Este artigo apresenta um método para a preparação de vesículas unilamelares gigantes compostas (cGUVs) com uma estrutura vesícula em vesícula, com condutividade elétrica personalizada nas regiões interna, anular e externa. A eletroformação sintetiza GUVs simples, que são transformados em estomatócios e cGUVs por meio de choque osmótico, fornecendo um modelo valioso para estudar a biofísica de células nucleadas.

Síntese de Vesículas Unilamelares Gigantes Compostas: Um Modelo Biomimético de Células Nucleadas

O advento dos sistemas MEG tamanho para crianças abre novas e importantes oportunidades para estudar o desenvolvimento do cérebro. O novo sistema, juntamente com um protocolo que alinha os requisitos experimental com as capacidades das crianças, pode ser usado para estudar processos cognitivos e de linguagem em crianças saudáveis, com idades entre acordado 05:57.

Medição da função cerebral Neuromagnetic Em pré-escolares Com Personalizado MEG Sized

Aprenda a criar vesículas unilamelares grandes para estudar interações de proteínas BCL-2 em membranas mitocondriais. Este método bioquímico permite analisar permeabilização e regulação da apoptose in vitro.

Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

Explorar mais vídeos