Name: Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 43 s
Description: Aprenda a avaliar funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais tubulares proximais usando vetores adenovirais para superexpressão de isozimas da Proteína Kinase C.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Translational Research Institute financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Centro Nacional de Pesquisa de Recursos concessão UL1 RR029884 financiou parcialmente Núcleo de Citometria de Fluxo no UAMS. Agradecemos ao Dr. Peipei Ping (Universidade da Califórnia em Los Angeles; Los Angeles, CA) para a prestação de uma alíquota de adenovírus carregando cDNA que codifica o negativo dominante (inativo) mutante da PKC-ε e Allen Dr. Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar uma fracção de vector adenoviral que codifica o mutante constitutivamente activo da PKC-ε. Agradecemos também os drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) para a prestação de codificação de cDNA constitutivamente ativos PKC ε.

<ol><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li>
<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells%3A+improvements+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li>
<li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits%3A+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li>
<li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C%2C+Ras+plays+multiple+roles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li>
<li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B5+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li>
<li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+ERK1%2F2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li>
<li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li>
<li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-%CE%B1+and+ERK1%2F2+mediate+mitochondrial+dysfunction%2C+decreases+in+active+Na%2B+transport%2C+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li>
<li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-%281%2C2-dichlorovinyl%29-L-cysteine+injury+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li>
<li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+a+functional+p21WAF1%2FCIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li>
<li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis%3A+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A abordagem aqui apresentada permite a super-expressão de isoenzimas individuais de PKC na cultura primária de células tubulares proximais renais. Há vários pontos fortes da presente abordagem: 1. Ela permite a investigação de mecanismos de regulação de uma população homogénea de células (células tubulares proximais renais) que são o alvo primário para vários insultos (isquemia, hipóxia, estresse oxidativo), drogas e nephrotoxicants dentro do rim. 2. Funções mitocondriais, neste modelo in vitro de RPTC cultivad...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Câmara de fluxo laminar </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml e 15 ml moinho de tecidos Dounce </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 e 235 mícrons malha de nylon </td><td> Peças pequenas </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml tubo de centrífuga estéril </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml microtubo </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 milímetros placas de cultura estéreis </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Centrífuga Jouan </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotores: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Centrífuga de micro-ajustável </td><td> SIGMA </td><td> Modelo 1-15 </td></tr><tr><td> Monitor de Oxigênio Biológica </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI modelo 5300A </td></tr><tr><td> Único sistema de câmara de oxigênio Micro </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sonda de oxigênio </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Circulando Bath </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl e kit de membrana padrão </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Agitador magnético </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Gravador de mesa </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> De 48 poços e as placas de 96 poços transparentes </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> R Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Orbital MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorbância fluorescência / / luminescência leitor) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Jaqueta de água EUA Autoflow automática incubadora de CO 2 </td><td> NuAire </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> Cultura de poliestireno de 12x75 mm para tubos de ensaio de citometria de fluxo </td><td> Fisher Marca </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Objetiva de imersão de água 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Mesilato deferoxamina </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Colagenase tipo I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetracloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Vermelho </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> A bioluminescência ATP Ensaio Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Anexina V - solução FITC </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Citómetro </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais proteína kinase c superexpressão isozimas

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

A proteína quinase C de família (PKC) de isoenzimas está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Nossos dados recentes demonstram que PKC regula a função mitocondrial e energético celular. Numerosos relatos demonstraram que a activação de PKC-a e PKC-ε melhora a função mitocondrial do coração isquémica e medeia cardioprotecção. Em contraste, nós demonstramos que a PKC-α e PKC-ε estão envolvidos na nephrotoxicant induzida disfunção mitocondrial e morte celular em células de rim. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo in vitro de células renais mantendo ativa as funções mitocondriais em que isozimas PKC poderia ser seletivamente ativadas ou inibidas para determinar seu papel na regulação da fosforilação oxidativa e sobrevivência celular. As culturas primárias de células tubulares proximais renais (RPTC) foram cultivadas em condições melhoradas, resultando em respiração mitocondrial e atividade de mitoenzimas mitocondrial semelhantes aos descritos no RPTC in vivo. Porque as técnicas de transfecção tradicionais (Lipofectamine, electroporação) são ineficientes em culturas primárias e têm efeitos adversos sobre a função mitocondrial, PKC-ε cDNAs mutantes foram entregues a RPTC através vectores adenovirais. Esta abordagem resulta em transfecção de mais de 90% RPTC culta. Aqui, apresentamos métodos para avaliar o papel da PKC-ε em: 1. regulação da morfologia mitocondrial e funções associadas com a síntese de ATP, e 2. sobrevivência de RPTC em cultura primária. PKC-ε é ativado pela superexpressão da constitutivamente ativa PKC-ε mutante. PKC-ε é inibida por superexpressam o mutante inactivo do ε-PKC. A função mitocondrial é avaliada examinando-se a respiração, a integridade da cadeia respiratória, as actividades dos complexos respiratórios e F 0 F 1-ATPase, a taxa de produção de ATP, e teor de ATP. A respiração é umssessed em digitonina-permeabilizadas RPTC como o estado 3 (respiração máxima na presença de substratos em excesso e ADP) e respiração desacoplados. Integridade da cadeia respiratória é avaliada por medição das actividades de todos os quatro complexos da cadeia respiratória nas mitocôndrias isoladas. Capacidade de fosforilação oxidativa é avaliada através da medição do potencial de membrana mitocondrial, a taxa de produção de ATP, e a actividade de F 0 F 1-ATPase. Estado de energia RPTC é avaliada através da determinação do teor de ATP intracelular. Morfologia mitocondrial em células vivas é visualizada utilizando MitoTracker Red 580, um corante fluorescente que se acumula especificamente nas mitocondrias, e monocamadas vivas são examinados sob um microscópio fluorescente. Viabilidade RPTC é avaliada através de anexina V / coloração com iodeto de propídio seguido por citometria de fluxo para determinar a apoptose e oncose. Estes métodos permitem uma activação selectiva / inibição do indivíduo isozimas PKCpara avaliar o seu papel em funções celulares de uma variedade de condições fisiológicas e patológicas que podem ser reproduzidas em in vitro.

A Figura 1 mostra que a entrega adenoviral de cDNA que codifica os constitutivamente activas (caPKC-ε) e inactivos (dnPKC-ε ε) mutantes de-PKC resulta em níveis significativamente aumentados de proteínas ε-PKC em RPTC e na mitocôndria. As células infectadas com o vector de transporte cDNA caPKC ε-superexpresso a forma (activo) fosforilada da PKC-ε enquanto que as células infectadas com o cDNA que codifica sobreexpressa dnPKC-ε ε-PKC que era inactiva (não fosforilado) (Figura 1). A prese...

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

A família de isozimas da proteína quinase C (PKC) está envolvida em inúmeros processos fisiológicos e patológicos. Nossos dados recentes demonstram que a PKC ...

Este experimento utiliza a modulação seletiva da proteína quinase C ISO xms para determinar suas funções mitocondriais e celulares em células tubulares proximais renais sob diversas condições fisiológicas e patológicas. Primeiro, isole as células tubulares proximais renais primárias do córtex renal ou RPCs que possuem metabolismo oxidativo. Assemelhando-se ao dos túbulos renais proximais.Infecte in vivo os RPCs com vetores adenovirais que expressam formas ativas e inativas da proteína quinase C. Em seguida, analise as diferentes funções mitocondriais e a viabilidade celular para determinar o efeito da enzima sobre a capacidade mitocondrial de sintetizar ATP e prevenir a morte celular. Realize também análise por imunoblot de proteína quinase C épsilon fosforilada em lisados celulares coletados conjuntamente.Os resultados mostram que a ativação da proteína quinase épsilon regula negativamente a capacidade mitocondrial de gerar ATP, diminui os níveis celulares de ATP e a viabilidade das células tubulares proximais renais. A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como linhagens celulares, é que culturas primárias de células tubulares proximais renais mantêm

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Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a avaliação do funcionamento mitocondrial das células endoteliais vasculares cerebrais (CVE) usando um ensaio de fluxo extracelular. As células CVE são plaqueadas em uma placa de cultura de células de fluxo extracelular. Os sensores de fluxo extracelular são hidratados antes do carregamento e calibração no bioanalisador. A placa contendo células é então carregada para análise.

Avaliação da função mitocondrial em células endoteliais vasculares cerebrais

A comparação do potencial da membrana mitocondrial entre as amostras produz informações valiosas sobre o status celular. São descritas etapas detalhadas para isolar mitocôndrias e avaliar a resposta a inibidores e desacopladores usando fluorescência. O método e a utilidade deste protocolo são ilustrados pelo uso de uma cultura de células e modelo animal de estresse celular.

Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Aqui, descrevemos como estudar a localização mitocondrial de uma quinase (ciclo celular) e como determinar sua localização submitocondrial, bem como potenciais substratos/alvos mitocondriais. A expressão forçada de proteínas nas mitocôndrias fornece uma ferramenta útil para estudar as consequências funcionais da localização mitocondrial de uma proteína de interesse.

Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1

mitocôndrias de células endoteliais são fundamentais para manter a integridade do cérebro-barreira sangue. Nós introduzimos um protocolo para medir a função bioenergética em células endoteliais vasculares cerebrais.

Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

Compreender a influência dos pesticidas organocloritos ambientais (OCPs) na função mitocondrial nos hepatócitos é importante na exploração do mecanismo de OCPs causando distúrbios metabólicos. Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática.

Protocolo Experimental para Detecção de Função Mitocondrial em Hepatócitos Expostos a Pesticidas Organoclorine

Este protocolo fornece uma abordagem econômica para isolar e caracterizar pilhas do rato primária renal tubular que podem posteriormente ser sub cultivadas para avaliar funções biológicas renal ex vivo, incluindo bioenergética mitocondrial.

Isolamento, caracterização e alto Throughput análise de fluxo extracelular de Mouse primária Renal Tubular as células epiteliais

Este método explora a contribuição do poro de transição de permeabilidade mitocondrial para o vazamento de prótons de baixa condução para determinar o limiar de tensão para abertura de poros em camundongos neonatais frágeis da síndrome X com aumento do teor de coenzyme mitocondrial de cardiomiocrata Q em comparação com o controle do tipo selvagem.

Avaliação da Probabilidade Aberta do Poro de Transição de Permeabilidade Mitocondrial na Configuração do Coenzyme Q Excesso

Esta técnica descreve um fluxo de trabalho eficaz para visualizar e medir quantitativamente o potencial de membrana mitocondrial e os níveis de superóxido dentro de células HeLa usando imagens ao vivo baseadas em fluorescência.

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Aqui, descrevemos um protocolo in vitro para modelar danos por hipóxia/reoxigenação nas células epiteliais tubulares proximais, altamente metabólicas. Este modelo foi projetado para induzir danos induzidos por estresse metabólico, que podem ser medidos pela expressão de marcadores de dano dos túbulos proximais e avaliação da função respiratória mitocondrial.

Modelagem de Hipóxia/Lesão por Reoxigenação em Células Epiteliais Tubulares Proximais

Este artigo descreve o uso de microscopia confocal e ImageJ para avaliar a dinâmica de fissão/fusão mitocondrial via fluorescência de fotocomutação Dendra2.

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Aprenda a avaliar funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais tubulares proximais usando vetores adenovirais para superexpressão de isozimas da Proteína Kinase C.

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