Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Este experimento utiliza a modulação seletiva da proteína quinase C ISO xms para determinar suas funções mitocondriais e celulares em células tubulares proximais renais sob diversas condições fisiológicas e patológicas. Primeiro, isole as células tubulares proximais renais primárias do córtex renal ou RPCs que possuem metabolismo oxidativo. Assemelhando-se ao dos túbulos renais proximais.

Infecte in vivo os RPCs com vetores adenovirais que expressam formas ativas e inativas da proteína quinase C. Em seguida, analise as diferentes funções mitocondriais e a viabilidade celular para determinar o efeito da enzima sobre a capacidade mitocondrial de sintetizar ATP e prevenir a morte celular. Realize também análise por imunoblot de proteína quinase C épsilon fosforilada em lisados celulares coletados conjuntamente.

Os resultados mostram que a ativação da proteína quinase épsilon regula negativamente a capacidade mitocondrial de gerar ATP, diminui os níveis celulares de ATP e a viabilidade das células tubulares proximais renais. A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como linhagens celulares, é que culturas primárias de células tubulares proximais renais mantêm as funções diferenciadas e o metabolismo oxidativo dos túbulos renais proximais. Como as proteínas quinases podem ser utilizadas como alvos e agentes terapêuticos potenciais, as implicações desta técnica estendem-se à terapia, prevenindo lesões renais ou acelerando a recuperação renal após lesão.

Este método pode elucidar o mecanismo de lesão e recuperação. Também pode ser aplicado, por exemplo, ao rim de coelho recém-isolado, lavando sequencialmente com 50 mililitros de meio D-M-E-M-F 12 estéril, solução salina tamponada com fosfato estéril, pH 7,4, e solução de PBS com óxido de ferro, para colher o córtex de cada rim.

Primeiramente, homogeneíze o tecido utilizando um homogeneizador de 15 mililitros. Em seguida, passe o homogenato por duas peneiras de malha estéreis em um béquer estéril de um litro. Lave as células remanescentes nas peneiras com tampão contendo deferoxamina.

Transfira qualquer tecido remanescente no fundo. Peneira de 85 micrômetros para 40 mililitros de tampão contendo deferoxamina colocado em um tubo cônico de centrífuga. Misture suavemente a suspensão celular com o ímã forte.

Capture os glomérulos contendo ferro e aspire o ferro aderido ao ímã. Ajuste o volume da suspensão celular para 40 mililitros e adicione um mililitro de meio de digestão contendo colagenase. Incube à temperatura ambiente por 17 minutos.

Agitar suavemente a suspensão. Coletar as células por centrifugação a 50 vezes G durante dois minutos a quatro graus Celsius após várias lavagens. Ressuspenda o pellet celular em 46 mililitros de meio contendo nenhuma semente de glicose.

Cultive os RPCs primários a uma densidade de um miligrama de proteína por cultura em placa em dois mililitros de meio D-M-E-M-F 12 sem glicose em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após repor o meio, prossiga com a infecção das células TPR confluentes com adenovírus carregando CD NA para a proteína quinase C épsilon constitutivamente ativa ou para a proteína quinase C épsilon dominante negativa, incube por 24 horas, reponha o meio e cultive os RPCs transfectados por mais 24 horas. Para visualizar a morfologia mitocondrial da monocamada de células primárias, reponha o meio, adicione o marcador mitocondrial vermelho 5 80 e retorne as placas ao incubador por 30 minutos.

Em seguida, examine as monocamadas vivas em um microscópio fluorescente utilizando imersão em água. Objetivo dois. Para avaliar a função mitocondrial, analise a respiração no estado três da suspensão de CTPR em uma câmara de consumo de oxigênio equipada com um eletrodo do tipo Clark.

Primeiro, meça a respiração no estado dois na ausência de um DP. Em seguida, adicione um DP até uma concentração final de 0,4 milimolar. Para iniciar a respiração no estado três ou no estado quatro, adicione oligomicina até uma concentração final de 0,5 microgramas por mililitro.

Inclua também uma medição da respiração desacoplada adicionando 0,5 micromolar de FCCP a células respirando no estado três. Adicione lentamente 20 microlitros de solução de JC um 0,5 milimolar a cada placa de cultura de RPTC e agite suavemente para misturar completamente o corante. Retorne as placas ao incubador por 30 minutos.

Em seguida, coloque os cultivos em gelo e realize duas lavagens com PBS gelado. Então, recolha as células. Transfira as células de TPR para um tubo eppendorf e dissocie os monocamadas em suspensão de células individuais por pipetagem.

Analise a fluorescência por citometria de fluxo utilizando excitação por um laser de íon argônio de 488 nanômetros. Em seguida, calcule o potencial da membrana mitocondrial de mitocôndrias isoladas. Facilite a avaliação da integridade da cadeia respiratória.

Após duas lavagens das monocamadas de RPTC com tampão PBS frio a 4 °C, colete as células e faça a centrifugação para obtenção do pellet. Lave o pellet uma vez em um mililitro do tampão A, em seguida homogeneíze as células em um homogeneizador Dounce até que a maioria das células no homogenato esteja rompida, conforme verificado ao microscópio. Em seguida, remova os detritos celulares por centrifugação de baixa velocidade.

Pelote as mitocôndrias brutas do sobrenadante a 15.000 vezes G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e realize três lavagens das mitocôndrias pelotizadas no tampão C. Re-suspenda o pellet mitocondrial em 50 a 100 microlitros do tampão de ensaio e congele em nitrogênio líquido para avaliar a atividade da NADH ubiquinona oxidoredutase. Adicione 500 microlitros do tampão de ensaio com os componentes adicionais e mitocôndrias; inclua também uma amostra em branco contendo todas as adições, exceto as mitocôndrias. Equilibre a placa a 30 graus Celsius com agitação durante cinco minutos.

Em seguida, coloque a placa no espectrofotômetro e adicione 10 microlitros de ubiquinona 3,25 milimolar para iniciar a reação em cada poço. Registre a absorbância a 340 nanômetros durante três minutos em intervalos de 22 segundos. Em um ensaio semelhante, meça a atividade da citocromo C oxidase utilizando citocromo C reduzido como substrato para a reação da ATP sintase.

Prepare as misturas para ensaiar a atividade total de APAs e a atividade de APAs insensível à oligomicina de cada grupo de tratamento. Incube as amostras na mistura de reação a 31 graus Celsius por 10 minutos. Inicie a reação adicionando um substrato de TP e incube a 31 graus Celsius por cinco minutos.

Transfira 200 microlitros da mistura de incubação para um tubo contendo 50 microlitros de TCA 3 molar, precipite as proteínas em gelo durante 10 minutos. Em seguida, pelotize por centrifugação. Depois, carregue uma placa de 96 poços com 50 microlitros de cada padrão de fosfato e 50 microlitros de cada sobrenadante de amostra em duplicata.

Em seguida, adicione 250 microlitros do reagente de Sumner a cada poço e incube a 30 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, registre a absorbância a 595 nanômetros. Lave as monocamadas de RPTC duas vezes com tampão PBS gelado.

Colete as células em um mililitro de PBS e transfira a suspensão celular para um tubo einor. Peline as amostras de RPTC por centrifugação e determine um teor de TP utilizando o método de luciferase de um kit de ensaio bioluminescente de ATP. Para análise da viabilidade celular em placas de 35 milímetros, utilize cinco monocamadas de RPTC para três grupos de tratamento controle: células positivas para onose, células positivas para apoptose e um controle sem coloração, distribuídas em duas placas.

Adicione dois microlitros de cisplatina 50 milimolar ao segundo conjunto. Adicione dois microlitros de hidroperóxido de t-butila 500 milimolar. Após corar as células usando iodeto de propídio conforme detalhado no texto acompanhante, lave as monocamadas com o tampão de ligação.

Em seguida, corar as células utilizando ANEXINA V conjugada com ZI conforme detalhado no protocolo textual. Então, coletar suavemente as células e suspender em 500 microlitros de tampão de ligação. Utilizando uma espátula de borracha.

Utilize uma pipeta para dispersar as células em uma suspensão unicelular e transfira a suspensão celular para tubos de citometria de fluxo. Disperse as células em uma suspensão unicelular. Prossiga imediatamente para quantificar a fluorescência de PI e FE por citometria de fluxo. A entrega adenoviral de CD NA revestindo as formas constitutivamente ativa e inativa dos mutantes da proteína quinase C épsilon resulta em níveis proteicos significativamente aumentados da proteína quinase C épsilon em CTPR e nas mitocôndrias.

Conforme esperado, a forma constitutivamente ativa da enzima é fosforilada nas CTPR e a enzima dominante negativa não é fosforilada. A presença da proteína quinase C épsilon ativa diminui a respiração mitocondrial nas CTPR, independentemente do substrato utilizado para energizar as mitocôndrias. Porém, a proteína quinase C épsilon inativa não tem efeito sobre a respiração mitocondrial.

Curiosamente, a ativação da proteína quinase C épsilon em TCS de RP reduz a atividade dos complexos um e quatro. Essa diminuição na respiração de TCS de RP está associada a aumentos no potencial da membrana mitocondrial. O mutante dominante negativo não apresenta tal efeito.

Essas alterações são também acompanhadas por diminuições na atividade de uma sintase de TP em mitocôndrias isoladas de CTPR superexpressando a proteína quinase C épsilon ativa. Como resultado, o conteúdo de ATP em CTPR superexpressando a proteína quinase C épsilon ativa é reduzido; a ativação sustentada da proteína quinase C épsilon tem efeitos profundos na morfologia mitocondrial, evidenciada pela fragmentação mitocondrial.

A ativação, mas não a inibição, da proteína quinase C também resulta em alterações na morfologia das CTPR, causando encolhimento celular e alongamento das células sobreviventes. Esses efeitos mitocondriais da superexpressão da proteína quinase C épsilon ativa em CTPRs também se correlacionaram com a morte celular por necrose e apoptose.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como superexpressar proteínas em culturas primárias utilizando a técnica adenoviral e como avaliar a capacidade mitocondrial para a síntese de TP. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas, se executada corretamente. E, evidentemente, não se esqueça de que o trabalho com adenovírus exige acesso a esses agentes, portanto tome precauções apropriadas.