Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em C. elegans Embriões

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica in vivo para obter imagens da dinâmica subcelular em embriões de elegância marinha expostos à anóxia usando um fluxo de gás através da configuração em um microscópio de alta potência. Isso é feito preparando primeiro uma amostra de animais transgênicos adultos jovens para gerar uma população adequada de embriões jovens para imagem. Em seguida, prepare lâminas finas de almofada agros para uso na câmara de microincubação.

Em seguida, a elegância do mar é devidamente anestesiada e coberta com óleo de carbono halo para evitar a dessecação quando exposta ao fluxo de gás. Finalmente, a lamínula redonda com os animais anestesiados é colocada na câmara de microincubação. A câmara é então colocada na platina do microscópio e preenchida com gás nitrogênio para produzir um ambiente anóxico enquanto a imagem é o uso de um fluxo de gás através da câmara de microincubação.

Em conjunto com a microscopia de fluorescência in vivo, permite vídeos e imagens detalhados de alta resolução da parada do ciclo celular em resposta à anóxia. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a imunofluorescência indireta, é que as alterações subcelulares podem ser documentadas in vivo enquanto os animais são expostos a condições específicas. Embora este método possa fornecer informações sobre a animação suspensa induzida por anóxia em embriões elegans.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como leveduras, cultura de células ou outros pequenos embriões de invertebrados ou vertebrados. Condições adicionais, como temperatura de hiperóxia, estresse ou tratamento com pequenas moléculas, também podem ser aplicadas. Demonstrando este procedimento estão Anastacia Garcia e Mary Latt, duas alunas de pós-graduação do meu laboratório: Comece com uma cepa transgênica C Elgan apropriada de interesse neste estudo, a cepa transgênica TH 32 será usada para visualizar cromossomos e centrossomas como marcadores de divisão celular.

Gere uma população sincronizada desintegrando adultos de gravidade em solução de hipoclorito e use os embriões restantes colhendo adultos de gravidade em uma placa semeada e ovo, colocando uma a duas horas ou colhendo L quatro larvas de uma população mista em uma nova placa semeada. Cultive nematóides a 20 graus Celsius até a idade adulta jovem, o que levará aproximadamente 96 horas desde a eclosão, 72 horas até a larva de L ou 24 horas após a muda de L four. Esta metodologia fornece um meio de gerar uma população de adultos jovens que contém um número abundante de embriões jovens, que contêm grandes blasfemadores e núcleos que são ideais para imagens de alterações subcelulares e subnúcleos.

Para configurar uma câmara úmida para conter lâminas preparadas, coloque uma toalha de papel úmida dentro de uma grande placa de Petri ou caixa coberta com uma tampa de tamanho suficiente. Prepare 2%aros fundidos em água deionizada aquecendo a mistura em vidraria por meio de micro-ondas ou banho-maria. Em seguida, coloque uma a três gotas de aros quente em um microscópio de vidro limpo Coloque imediatamente uma segunda lâmina invertida perpendicularmente em cima das gotas de aros e pressione levemente para que a almofada resultante fique fina e livre de bolhas de ar.

Depois que o aros esfriar lentamente, desmonte as duas lâminas do microscópio, deixando a almofada do aros intacta em uma das lâminas. É importante garantir que a almofada aros seja fina o suficiente para não interferir na capacidade de focar o microscópio. Posterior. Use uma lâmina de barbear limpa para moldar a almofada Aros em uma pequena loja quadrada.

Desliza na câmara úmida preparada até a hora de usar. Usando a mesma lâmina de barbear limpa, pegue cuidadosamente a borda da almofada aros e transfira-a da corrediça para uma micro lamínula redonda de 25 milímetros. Evitando o acúmulo de bolhas de ar sob a tampa redonda, o vidro deve caber adequadamente na micro incubadora.

Adicione uma gota de anestésico na almofada aros. Escolha de cinco a 10 vermes e coloque-os na gota de anestésico. Aguarde de um a três minutos para que os vermes parem de se mover.

Usando uma ponta de pipeta, adicione uma gota de óleo de carbono sagrado em cima dos vermes para evitar que os vermes desidratem à medida que o gás flui pela câmara. Em seguida, conecte uma extremidade do tubo de plástico flexível à câmara. Separe as duas metades da microincubadora de perfusão fechada e coloque cuidadosamente a lamínula na vertical no anel inferior.

Feche bem os dois lados da câmara. Em seguida, conecte a câmara através do tubo de plástico flexível ao tanque de gás nitrogênio e coloque-a no microscópio stage. Verifique se há vazamentos, garantindo a fixação segura do tubo e dos plugues da porta ao longo da lateral da câmara para obter imagens de embriões.

Primeiro, localize os animais em menor ampliação. Em seguida, vá para a ampliação mais alta apropriada. Para obter imagens de blasfemadores embrionários em adultos, use o laser de 488 nanômetros para localizar a proteína de fusão GFP nas células de interesse.

Para visualizar um estágio específico da parada do ciclo celular, por exemplo, prófase tardia, identifique um blasfemador em um estágio anterior da divisão celular, como interfase tardia ou prófase precoce. Perfundir a câmara com gás nitrogênio e continuar a monitorar os blasfemadores à medida que o nitrogênio enche a câmara, ajustando o plano focal conforme necessário. Realize imagens de lapso de tempo para capturar o fenômeno desejado de interesse neste caso.

Parada da prófase e acoplamento dos cromossomos à membrana nuclear interna. Tire fotos uma vez a cada 10 segundos por até 30 minutos. Normalmente, a parada da prófase induzida por anóxia ocorre dentro de 20 a 30 minutos após o início do fluxo de gás nitrogênio.

Para documentar a recuperação do estado de parada induzido por anóxia, desligue o gás e permita que a câmara retorne à normóxia enquanto registra uma série de lapso de tempo. A retomada do ciclo celular e o desfazer dos cromossomos geralmente ocorrem dentro de cinco a 20 minutos. Use erris image J ou Photoshop para processar imagens e vídeos e importá-los para o QuickTime para exibição.

Dentro do embrião exposto à anóxia, os cromossomos da prófase. Os blasfemadores se condensarão e se alinharão com a periferia nuclear interna. Um fenômeno conhecido como acoplamento cromossômico após a reoxigenação, a progressão do ciclo celular será retomada e os cromossomos da prófase.

A blasfêmia se moverá da periferia nuclear para a placa equatorial, indicando progressão para a metáfase. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em três a quatro horas usando animais adequadamente encenados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar apenas animais adultos jovens saudáveis para reservar tempo suficiente para concluir o experimento e ser paciente ao aprender a escolher blasfemadores adequadamente encenados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como capturar eventos subcelulares induzidos por anóxia in vivo usando embriões de GaN e um fluxo de gás através da câmara em microscópio de alta potência.