Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em
3 de dezembro de 2012
Descrito aqui é um In vivo A técnica de sub-imagem estruturas celulares em animais expostos a anoxia usando um fluxo de gás através da câmara microincubation em conjunto com um microscópio confocal de disco giratório. Este método é simples e suficientemente flexível para satisfazer uma variedade de parâmetros experimentais e sistemas modelo.
O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica in vivo para imagens de dinâmicas subcelulares em embriões de C. elegans expostos à anóxia, utilizando um sistema de fluxo de gás em um microscópio de alta potência. Isso é realizado primeiramente preparando uma amostra de animais transgênicos jovens adultos para gerar uma população adequada de embriões jovens para aquisição de imagens. Em seguida, preparam-se lâminas com tampão de agarose fina para uso na câmara de microincubação.
Em seguida, os exemplares de sea elegance são adequadamente anestesiados e cobertos com óleo de halo carbono para evitar dessecação quando expostos ao fluxo de gás. Por fim, a lamínula redonda com os animais anestesiados é colocada na câmara de microincubação. A câmara é então posicionada sobre a platina do microscópio e preenchida com gás nitrogênio para criar um ambiente anóxico durante a aquisição de imagens, utilizando-se, em última instância, um fluxo de gás através da câmara de microincubação.
Em conjunto com a microscopia de fluorescência in vivo, permite vídeos e imagens detalhadas de alta resolução da parada do ciclo celular em resposta à anoxia. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a imunofluorescência indireta, é que alterações subcelulares podem ser documentadas in vivo enquanto os animais são expostos a condições específicas. Embora este método possa fornecer informações sobre a animação suspensa induzida por anoxia em embriões de elegans.
Também pode ser aplicado a outros sistemas, como levedura, cultura celular ou embriões de outros pequenos invertebrados ou vertebrados. Condições adicionais, como hiperoxia, temperatura, estresse ou tratamento com moléculas pequenas, também podem ser aplicadas. Demonstrando este procedimento estão Anastacia Garcia e Mary Latt, duas alunas de pós-graduação do meu laboratório. Inicie com uma linhagem transgênica apropriada de C. elegans de interesse; neste estudo, a linhagem transgênica TH32 será utilizada para visualizar cromossomos e centríolos como marcadores da divisão celular.
Gere uma população sincronizada desintegrando adultos em solução de hipoclorito e utilize os embriões remanescentes, transferindo adultos por gravidade para uma placa semeada e coletando ovos após um a duas horas de postura, ou selecione larvas L4 de uma população mista e transfira-as para uma nova placa semeada. Cultive os nematoides a 20 graus Celsius até atingirem a fase jovem de adulto, o que levará aproximadamente 96 horas a partir da eclosão, 72 horas a partir das larvas L1 ou 24 horas após a muda de L4. Esta metodologia fornece um meio para gerar uma população de adultos jovens que contenham um grande número de embriões jovens, os quais possuem grandes blastômeros e núcleos ideais para o imageamento de alterações subcelulares e subnucleares.
Para montar uma câmara úmida para manter as lâminas preparadas, coloque um papel-toalha úmido dentro de uma grande placa de Petri ou recipiente com tampa de tamanho adequado. Prepare 2% de aros fundido em água desionizada aquecendo a mistura em vidraria por meio de forno de micro-ondas ou banho-maria. Em seguida, coloque de uma a três gotas de aros morno sobre uma lâmina de microscópio de vidro limpa; imediatamente coloque uma segunda lâmina invertida perpendicularmente sobre as gotas de aros e pressione levemente para que o tampão resultante fique fino e livre de bolhas de ar.
Após o aros ter esfriado lentamente, separe as duas lâminas de microscópio, deixando o tampão de aros intacto em uma das lâminas. É importante garantir que o tampão de aros seja suficientemente fino para não interferir na capacidade de focar o microscópio. Posteriormente, use uma lâmina de barbear limpa para moldar o tampão de aros em um pequeno quadrado.
Lâminas na câmara úmida preparada até o momento de uso. Usando a mesma lâmina de barbear limpa, retire cuidadosamente a borda do disco de aros e transfira-a da lâmina para um cubre-objeto micro redondo de 25 milímetros. Evitando o acúmulo de bolhas de ar sob o cubre-objeto redondo, o vidro deve se ajustar adequadamente no micro incubador.
Adicione uma gota de anestésico sobre o suporte de aros. Escolha cinco a 10 vermes e coloque-os na gota de anestésico. Aguarde um a três minutos para que os vermes deixem de se mover.
Usando a ponta de uma pipeta, adicione uma gota de óleo de carbono oco sobre os vermes para evitar a desidratação dos mesmos enquanto o gás passa pela câmara. Em seguida, conecte uma extremidade do tubo plástico flexível à câmara. Separe as duas metades do microincubadora de perfusão fechada e coloque cuidadosamente a lamínula na posição vertical sobre o anel inferior.
Feche firmemente os dois lados da câmara. Em seguida, conecte a câmara, por meio do tubo plástico flexível, ao cilindro de gás nitrogênio e coloque-a sobre a platina do microscópio. Verifique a presença de vazamentos garantindo a fixação segura do tubo e das tampas dos conectores ao longo da lateral da câmara para imagens de embriões.
Primeiro, localize os animais em menor aumento. Em seguida, aumente para o aumento mais alto apropriado. Para imaginar blasfemos embrionários em adultos, use o laser de 488 nanômetros para localizar a proteína de fusão GFP nas células de interesse.
Para visualizar um estágio específico da parada do ciclo celular, por exemplo, prófase tardia, identifique um blasfêmero em um estágio anterior da divisão celular, como interfase tardia ou prófase inicial. Passe gás nitrogênio pela câmara e continue monitorando os blasfêmeros à medida que o nitrogênio preenche a câmara, ajustando o plano focal conforme necessário. Realize imagens com lapso de tempo para capturar o fenômeno de interesse desejado neste caso.
Parada na prófase e ancoramento dos cromossomos à membrana nuclear interna. Adquira imagens a cada 10 segundos durante até 30 minutos. Normalmente, a parada na prófase induzida por anoxia ocorre entre 20 e 30 minutos após o início do fluxo de gás nitrogênio.
Para documentar a recuperação do estado de arresto induzido pela anóxia, desligue o gás e permita que a câmara retorne à normóxia enquanto grava uma série de imagens com lapso de tempo. A retomada do ciclo celular e a descondensação dos cromossomos ocorrem tipicamente entre cinco e 20 minutos. Use o ImageJ ou o Photoshop para processar imagens e vídeos e importe-os para o QuickTime para exibição.
Dentro do embrião exposto à anóxia, os cromossomos da prófase condensar-se-ão e se alinharão com a periferia interna do núcleo. Um fenômeno denominado ancoragem cromossômica; após a reoxigenação, a progressão do ciclo celular será retomada e os cromossomos da prófase se separarão.
A blasfêmia se moverá da periferia nuclear para a placa equatorial, indicando a progressão para a metáfase. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas utilizando animais adequadamente estagiados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar apenas animais adultos jovens saudáveis, reservar tempo suficiente para completar o experimento e ser paciente ao aprender a selecionar blasfêmicos adequadamente estagiados.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como capturar eventos subcelulares induzidos por anóxia in vivo utilizando embriões de GaN e uma câmara com fluxo de gás acoplada a um microscópio de alta potência.
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Visão Geral
Este artigo descreve uma técnica in vivo para imagens de dinâmicas subcelulares em embriões de sea elegans expostos à anóxia. O método utiliza um fluxo de gás através de uma câmara de microincubação em conjunto com um microscópio confocal de disco giratório de alta potência.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- A imagem subcelular é fundamental para compreender as respostas celulares ao estresse ambiental.
- A anóxia pode afetar significativamente a dinâmica e a viabilidade celulares.
- Caenorhabditis elegans serve como organismo modelo para estudos em biologia do desenvolvimento.
- Técnicas de imagem de alta resolução são essenciais para observar processos dinâmicos em espécimes vivos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a obtenção de imagens de estruturas subcelulares em embriões vivos sob condições anóxicas.
- Aprimorar a compreensão das respostas celulares à privação de oxigênio.
- Fornecer uma técnica de imagem flexível, adequada para diversas configurações experimentais.
Métodos Utilizados
- Preparação de nematoides marinhos transgênicos adultos jovens para gerar embriões.
- Uso de lâminas com tampão de ágar fino em uma câmara de microincubação.
- Anestesia dos nematoides marinhos com óleo de halo carbono para prevenir dessecação.
- Obtenção de imagens com microscópio confocal de disco giratório sob fluxo de gás nitrogênio para criar um ambiente anóxico.
Resultados Principais
- A técnica permite a imagem em tempo real da dinâmica subcelular em embriões.
- Manutenção bem-sucedida de condições anóxicas durante a aquisição de imagens.
- Flexibilidade demonstrada para diversos parâmetros experimentais.
- Fornecimento de informações sobre os efeitos da anoxia em processos celulares.
Conclusões
- Este método é uma ferramenta valiosa para estudar as respostas celulares à anóxia.
- Pode ser adaptado para diferentes sistemas modelo e condições experimentais.
- Os achados contribuem para a compreensão da dinâmica subcelular em condições de estresse.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa técnica permite a visualização em tempo real da dinâmica subcelular em embriões vivos sob condições anóxicas controladas, fornecendo subsídios mecanicistas sobre a parada do ciclo celular induzida por estresse. Ao capturar a parada reversível na prófase e o ancoramento dos cromossomos em C. elegans, ela auxilia na validação de alvos em vias que regulam a animação suspensa e a dormência metabólica. A abordagem oferece um sistema relevante para doenças, útil para investigar mecanismos de detecção de oxigênio com confiança preditiva na redução de riscos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da visualização da parada do ciclo celular induzida por anóxia in vivo, esclarecendo a dinâmica das vias na privação de oxigênio.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta de alterações subcelulares, sem artefatos de fixação.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao associar a exposição à anóxia a métricas quantificáveis de progressão do ciclo celular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados utilizando repórteres com marcação GFP para imageamento padronizado e reproduzível da dinâmica da divisão celular.
- Saídas Quantitativas: Gera dados de imagens sequenciais que permitem a medição do início, duração e cinética de recuperação da parada sob gradientes definidos de oxigênio.
- Escalabilidade da Plataforma: Adapta-se a fluxos de trabalho de triagem de alto conteúdo para moléculas pequenas ou modificadores genéticos que afetam vias de resposta ao estresse.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Relevância para Doenças: Modela a lesão por isquemia-reperfusão e o estresse hipóxico em contextos de desenvolvimento, alinhando-se à descoberta translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta à validação pré-clínica por meio do monitoramento de respostas celulares conservadas à anóxia em diferentes sistemas modelo.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avançar/não avançar com base em limiares de parada fenotípica reversível e recuperação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer dados de imagem em tempo real de células vivas que informam estudos de engajamento do alvo e modulação de vias antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de detecção de oxigênio por meio da visualização direta da parada e recuperação do ciclo celular em embriões.
- Triagem: Oferece sistemas prontos para ensaio com leituras quantitativas sobre a progressão mitótica, permitindo a triagem de compostos moduladores da animação suspensa.
- Análises: Fornece medidas com resolução temporal da duração da parada em prófase e da dinâmica cromossômica, facilitando análises comparativas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a estudos pré-clínicos ao modelar respostas ao estresse hipóxico relevantes para isquemia, acidente vascular cerebral e distúrbios metabólicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a leveduras, embriões de vertebrados e sistemas de cultura celular sob diferentes agentes estressores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade nos vínculos mecanicistas entre anóxia e regulação do ciclo celular.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio do controle do fluxo de gás e do design da câmara ambiental.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao permitir a detecção precoce de efeitos citotóxicos ou citostáticos em sistemas relevantes para doenças.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que visam vias do fator induzível por hipóxia (HIF) ou respostas ao estresse mitocondrial.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de linhagens transgênicas, preparação de embriões e microscopia de fluorescência em células vivas.
- Depende de microscopia confocal com disco giratório, sistemas de controle de fluxo de gás e manutenção de câmara ambiental.
- Necessita padronização dos tempos de exposição à anóxia, controle de temperatura e protocolos de recuperação entre equipes.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes sistemas modelo, incluindo estadiamento de embriões e compatibilidade de marcadores.
- Limitado pela necessidade de marcadores fluorescentes tolerantes ao oxigênio e pela possível fototoxicidade durante a aquisição prolongada em lapso de tempo.
