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O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade elétrica dos nervos, músculos e neurônios, bem como os movimentos correspondentes do aparelho alimentar durante programas motores de alimentação. Isso é realizado primeiramente removendo a massa bucal de um indivíduo anestesiado e fixando eletrodos em gancho aos nervos e músculos principais. O segundo passo consiste em colocar a massa bucal em uma câmara de registro e preparar os gânglios para gravação extracelular.

Em seguida, os neurônios-alvo são localizados utilizando eletrodos extracelulares. O passo final é induzir e registrar programas motores de alimentação, como mordida, deglutição e rejeição. Em última análise, o preparado suspenso da massa bucal é utilizado para demonstrar a atividade de nervos, músculos e neurônios individuais durante diferentes movimentos semelhantes à alimentação da massa bucal.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como estudos de gânglios isolados, é que os registros de nervos, músculos e neurônios individuais podem ser diretamente relacionados aos movimentos do aparelho alimentar. Auxiliando na demonstração do procedimento estará huu, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar o procedimento, anestesie um plegia saudável de 200 a 300 gramas em uma bandeja de dissecação, injetando cerca de 50% do peso corporal de cloreto de magnésio isotônico. Após a primeira injeção próxima à cauda do animal, massageie suavemente a superfície do animal para espalhar o cloreto de magnésio.

Administre injeções adicionais próximas à cabeça do animal conforme necessário. Após o animal deixar de responder a estímulos táteis suaves, fixe-o na bandeja com o lado dorsal voltado para cima. Coloque um alfinete na cauda e um alfinete em cada tentáculo anterior.

Em seguida, use a pinça para pinçar e levantar a pele do animal no meio da cabeça. Atrás dos chifres do rinoceronte, faça uma incisão coronal através da cabeça do animal, logo atrás do ponto que está sendo segurado. Depois disso, faça uma incisão sagital mediana entre os chifres do rinoceronte em direção à boca para expor a massa bucal.

Em seguida, puxe a aba de pele para longe da massa bucal e corte os nervos e o tecido conjuntivo que se prendem à parede do corpo. Para separar completamente essa aba de pele da massa bucal, certifique-se de não cortar nenhum nervo ou tecido intrínseco à massa bucal. Depois, segure e mantenha o esôfago.

Corte o esôfago posteriormente ao ponto que está sendo segurado. Puxe para cima o esôfago e levante a massa bucal atrás da massa bucal. Os gânglios cerebral, pleural e pedal formam um anel, com o gânglio cerebral ligado aos gânglios bucais pelos conectivos cerebrais bucais.

Deixe esses gânglios anulares aderidos à massa bucal e corte todos os nervos que se projetam desses gânglios para outras partes do corpo. Em seguida, corte o tecido conjuntivo ao redor da massa bucal e continue levantando a massa bucal à medida que ela se desconecta do corpo. Quando a massa bucal estiver presa apenas à boca, segure o esôfago e a massa bucal.

Verticalmente para cima. Faça um corte final logo anterior às mandíbulas para soltar a massa bucal do corpo. Coloque a massa bucal em uma solução contendo 50% de cloreto de magnésio isotônico e 50% de solução salina SIA para manter uma anestesia parcial enquanto os eletrodos são fixados.

Posteriormente, coloque a massa bucal com a solução em uma placa de Petri com fundo de charuto, cortando a artéria bucal na superfície ventral da massa bucal. Em seguida, remova os gânglios pleurais e pedais cortando suas conexões com o gânglio cerebral. Deixe o gânglio cerebral ligado aos gânglios bucais e à massa bucal por meio dos CBCs e seccione as demais conexões entre o gânglio cerebral e a massa bucal.

Reduza o esôfago e as glândulas salivares a pequenos comprimentos. Nesta etapa, fixe os eletrodos em gancho ao nervo ocular ular, aos dois nervos bucais musculares dois e três, e ao ramo A do nervo bucal dois. Utilize um procedimento semelhante ao demonstrado na publicação do JoVE por Collins e Shield, e resumido brevemente aqui.

Para cada descolamento de eletrodo, posicione o eletrodo próximo ao nervo ou músculo, coloque o nervo-alvo no gancho e levante suavemente usando um manipulador. Em seguida, seque a seção do nervo com um lenço de papel Kim. Aplique uma gota de cola super rápida em gel no nervo preso ao gancho e certifique-se de que o gancho esteja completamente coberto pela cola e que a ponta do fio de referência não esteja coberta pela cola.

Em seguida, utiliza-se uma seringa com uma peça de tubo de polietileno para aplicar a solução do recipiente sobre a cola, o que induzirá a solidificação da superfície da cola. O próximo passo é preparar um recipiente redondo de gravação de 100 por 50 milímetros de Pyrex para uso como câmara de gravação; aplique uma camada fina de graxa de vácuo na reentrância entre as câmaras cerebral e dorsal com a ponteira de uma pipeta, a fim de minimizar vazamentos. Em seguida, encha a câmara frontal com salina plescia.

Transfira cuidadosamente a massa bucal da placa de Petri para a câmara frontal do recipiente redondo de Pyrex e certifique-se de que nenhum dos eletrodos seja puxado com força, o que poderia romper os nervos. Tenha muito cuidado com os eletrodos em forma de gancho se o recipiente precisar ser transferido para outro microscópio estereoscópico. Para afinar a bainha.

Agrupe os eletrodos em cada lado da massa bucal. Segure cuidadosamente os eletrodos segurando a fita laboratorial que cobre os pinos do conector e, novamente, certifique-se de que nenhum dos eletrodos esteja tracionado com força. Quando a placa estiver posicionada sob o microscópio, os eletrodos devem ser dispostos suavemente sobre as bordas da placa e repousar sobre a plataforma durante as pausas e entre as etapas do experimento; areje a solução salina na câmara da massa bucal usando uma pedra difusora de ar de aquário.

Em seguida, fixe o gânglio cerebral na câmara traseira com os CBCs passando pelo entalhe. Aplique mais graxa de vácuo sobre os CBCs. Depois, adicione mais salina SIA a ambas as partes do recipiente para que os gânglios fiquem completamente submersos.

Certifique-se de que o nível de salina esteja abaixo da altura da graxa de vácuo entre as câmaras cerebral e bucal para que não ocorra vazamento entre as câmaras. Nesta etapa, a massa bucal deve repousar no fundo da câmara frontal. Em seguida, fixe os gânglios bucais na plataforma intermediária para evitar danificar os nervos que ainda estão ligados à massa bucal.

Coloque os alfinetes apenas na bainha entre dois nervos. Em seguida, adicione mais dois alfinetes na lateral das CBCs para esticá-las e fixá-las. Mantenha os gânglios bucais planos ou rotacionados, conforme a localização dos neurônios de interesse.

Para rotacionar o gânglio bucal, use um par de pinças finas para segurar um excesso de bainha do CBC e fixá-lo entre o nervo bucal dois e o nervo bucal três. Em seguida, a maioria dos corpos celulares próximos à câmara posterior, que não podem ser facilmente acessados pela parte superior do gânglio bucal, agora pode ser visualizada. Por último, adicione dois alfinetes na bainha do gânglio bucal próximos ao lado da massa bucal.

Para minimizar o movimento do gânglio bucal, segure a bainha do gânglio bucal próxima à câmara traseira e corte o excesso de bainha com tesoura fina, sem expor os corpos celulares. Para minimizar danos, remova apenas a quantidade de bainha necessária para visualizar os corpos celulares após a redução da espessura da bainha. Conecte todos os pinos de eletrodo aos seus conectores nos cabos que se ligam aos amplificadores.

Certifique-se de que os eletrodos não estejam puxados com força e estejam corretamente conectados aos respectivos cabos, e de que as polaridades estejam corretas para lavar qualquer cloreto de magnésio remanescente. Substitua o salino SIA na câmara do bulbo bucal por salino SIA fresco. Em seguida, passe um fio de seda através do tecido mole na parte frontal do bulbo bucal e dorsal à cartilagem da mandíbula.

Use dois pedaços de massa de modelar para fixar a sutura à borda do recipiente, suspendendo assim a massa bucal pela sua extremidade anterior. Um manipulador segura um eletrodo extracelular de vidro de forma que a ponta do eletrodo fique próxima ao gânglio bucal. Para localizar e identificar um neurônio, abaixe suavemente a ponta do eletrodo extracelular sobre a bainha.

Sobre o corpo celular do neurônio. Aplique uma corrente estimulante e, em seguida, mude o canal que está sendo usado para excitar o corpo celular para o modo de gravação, a fim de registrar a atividade no eletrodo extracelular e a atividade correspondente nos nervos para induzir a rejeição. Assim como programas motores estimulam o nervo bucal dois A com uma longa série de pulsos de dois hertz, um milissegundo, para gerar padrões de ees.

Os padrões continuam durante todo o período de estimulação e podem persistir até pouco tempo após o término da estimulação. Para induzir programas motores semelhantes à mordida, coloque alguns cristais de caracol sólido diretamente sobre o gânglio cerebral.

Padrões repetitivos geralmente começam dentro de cinco minutos e duram aproximadamente de 10 a 15 minutos antes de começar a diminuir para induzir a deglutição. Como nos programas motores, aplique caracol e aguarde até que a massa bucal gere mordidas fortes. Em seguida, durante uma mordida, coloque uma tira de alga na boca do animal de modo que ele agarre a alga.

Aqui está a estimulação e gravação do neurônio motor identificado B nove e a gravação desse mesmo neurônio, do músculo I dois e de vários nervos durante programas motores de alimentação. Abaixo estão as imagens de vídeo obtidas da mesma série de programas motores. Padrões de deglutição foram induzidos pela aplicação de carbacol ao gânglio cerebral e pela subsequente colocação de uma tira de alga no aparelho mastigador durante a mordida induzida por carbacol.

Nesta imagem, a rádula está protrata para agarrar a alga, e nesta imagem, a rádula retraiu-se, puxando a alga para dentro da boca. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar a preparação suspensa da massa bucal e obter registros dos programas motores de alimentação in vitro.