Name: Um In Vitro Preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em Aplysia californica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Aprenda a registrar atividade elétrica de nervos, músculos e neurônios durante programas motores de alimentação em Aplysia californica. Este método permite observar movimentos fisiológicos do aparelho bucal in vitro.

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<ol><li>Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinematics+of+multifunctionality%3A+comparisons+of+biting+and+swallowing+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica.</a> J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).</li>
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<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).</li>
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<li>Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+movement+with+behavior-specific+and+behavior-independent+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules.</a> J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O trabalho anterior tem caracterizado programas Aplysia a motor em animais intactos e em preparações reduzidas, tais como gânglio isolado. No animal intacto, embora as gravações de neurónios individuais foram obtidos 5, tais experiências são muito difíceis, e os eléctrodos não podem ser movidos entre os neurônios durante a alimentação. Em gânglios isolado, os movimentos de alimentação induzidos pela actividade neural não pode ser observado. A preparação da massa suspensa bucal faz a ponte entre esses...

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>Biológico, Certificado</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>ACS Certificado</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexaidratado</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99% </td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptaidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>ACS Certificado </td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio diidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td>ACS Certificado </td></tr><tr><td>Glicose (dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>Tampão MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>Carbacol</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>Certificado</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Certificado</td></tr><tr><td>Vidro capilar de barril simples</td><td>A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas Flaming-Brown modelo P-80/PC</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Filamento utilizado: FT345B</td></tr><tr><td>Fio de aço inoxidável com revestimento de esmalte</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0,001D, revestimento h </td></tr><tr><td>Cola Silicone II doméstica </td><td>GE</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Supercola Duro Quick-Gel </td><td>Henkel corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Amplificador modelo 1700 da A-M Systems </td><td>A-M Systems</td><td></td><td>Configurações do filtro: 300-500 Hz para nervos, 10-500 Hz para músculo I2</td></tr><tr><td>Estimulador Multicanal Pulsemaster</td><td>World Precision Instruments</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>Isolador de Estímulo</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>AxoGraph Scientific</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Contador Totalizador Veeder-Root</td><td>Danaher</td><td>C342-0562</td><td></td></tr><tr><td>Pinos Conectores Dourados</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Soquetes Conectores Dourados</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Elástomero de Silicone Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recipiente cristalizador 100 x 50 mm</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graxa de Alto Vácuo</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Massa de Modelar</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>Fios Cirúrgicos de Seda</td><td>Ethicon</td><td>K89OH</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Ar Whisper</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Aquário</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Arejador Elite</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Cirúrgica de Mola Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina Dumont nº5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Alga Nori para Sushi Yaki</td><td>Rhee Bros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in vitro</em&gt; preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em<em&gt; aplysia californica</em

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifuncionalidade, a capacidade de uma estrutura periférica de gerar múltiplos comportamentos distintos 1, permite animais para se adaptar rapidamente seus comportamentos a ambientes em mudança. O molusco marinho Aplysia californica fornece um sistema tratável para o estudo da multifuncionalidade. Durante a alimentação, Aplysia gera vários tipos distintos de comportamento utilizando o mesmo aparelho de alimentação, a massa bucal. Os gânglios que controlam esses comportamentos conter um número de grandes neurônios identificados que são acessíveis para estudo eletrofisiológico. A actividade destes neurónios tem sido descrita em programas motores que podem ser divididos em dois tipos, os programas e ingestivo egestive, com base no tempo de actividade neural que fecha o parente grasper alimento para a actividade neural que prolonga-se ou retrai a grasper 2. Contudo, nos gânglios isolado, os movimentos musculares que produzem esses comportamentos são ausentes, tornando-mais difícil de ser determinado se os programas motores observados são correlatos de comportamentos reais. Em gravações nervosas in vivo, e os músculos foram obtidos correspondente a programas de alimentação 2,3,4, mas é muito difícil de gravar directamente a partir de neurónios individuais 5. Além disso, in vivo, programas ingestivo pode ainda ser dividido em mordidas e 1,2 engole, uma distinção que é difícil de fazer na maioria descrito anteriormente em preparações in vitro. A preparação de massa suspensa bucal (Figura 1) faz a ponte entre núcleos isolados e animais intactos. Nesta preparação, comportamentos ingestivo - incluindo tanto a morder e engolir - e comportamentos egestive (rejeição) pode ser provocada, ao mesmo tempo, como neurónios individuais podem ser registados a partir de e estimulada utilizando eléctrodos extracelulares 6. Os movimentos de alimentação associados com estes comportamentos diferentes podem ser recorded, quantificado e relacionado diretamente para os programas motores. Os programas de motor na preparação de massa suspensa bucal parecem ser mais semelhantes aos observados in vivo do que os programas motores em gânglios provocou isolado. Assim, os programas de motor desta preparação pode estar mais directamente relacionada com comportamento in vivo e, ao mesmo tempo, os neurónios individuais são mais acessíveis para a gravação e a estimulação do que nos animais intactos. Além disso, como um passo intermediário entre gânglios isolado e animais intactos, os achados da massa suspensa bucal pode auxiliar na interpretação de dados obtidos em ambas as configurações mais reduzidas e mais intacta. A preparação da massa suspensa bucal é uma ferramenta útil para caracterizar o controle neural da multifuncionalidade na Aplysia.

Quando um eletrodo extracelular é posicionado acima do soma de um neurônio e usado para estimular o neurônio, pode-se observar uma correspondência um-a-um entre os potenciais de ação no canal do soma e nos nervos aos quais o neurônio projeta (Figura 6, painel esquerdo, estimulação do neurônio identificado B9). O canal do soma (canal superior) é configurado no modo de estimulação quando a corrente é aplicada (tempo 1 na figura) e, em seguida, é rapidamente comutado para o modo de gravação (tempo 2). Mante...

Nós descrevemos uma técnica para gravar extracelularmente e estimular a partir de nervos, músculos e neurônios individuais identificados<em&gt; In vitro</em&gt; Enquanto eliciar e observar diversos tipos de comportamentos de alimentação no aparelho de alimentação de<em&gt; Aplysia</em&gt;.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em<em&gt; Aplysia californica</em

A multifuncionalidade, a capacidade de uma única estrutura periférica gerar múltiplos e distintos comportamentos1, permite que os animais adaptem rapidamente seus comportamentos...

O objetivo geral deste procedimento é registrar a atividade elétrica dos nervos, músculos e neurônios, bem como os movimentos correspondentes do aparelho alimentar durante programas motores de alimentação. Isso é realizado primeiramente removendo a massa bucal de um indivíduo anestesiado e fixando eletrodos em gancho aos nervos e músculos principais. O segundo passo consiste em colocar a massa bucal em uma câmara de registro e preparar os gânglios para gravação extracelular.Em seguida, os neurônios-alvo são localizados utilizando eletrodos extracelulares. O passo final é induzir e registrar programas motores de alimentação, como mordida, deglutição e rejeição. Em última análise, o preparado suspenso da massa bucal é utilizado para demonstrar a atividade de nervos, músculos e neurônios individuais durante diferentes movimentos semelhantes à alimentação da massa bucal.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como estudos de gânglios isolados, é que os registros de nervos, músculos e neurônios individuais podem ser diretamente relacionados aos movimentos do aparelho alimentar. Auxiliando na demonstração do procedimento estará huu, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para iniciar o procedimento, anestesie um plegia saudável de 200 a 300 gramas em uma bandeja de dissecação, injetando cerca de 50% do peso corporal de cloreto de magnésio isotônico. Após a primeira injeção próxima à cauda do animal, massageie suavemente a superfície do animal para espalhar o cloreto de magnésio.Administre injeções adicionais próximas à cabeça do animal conforme necessário. Após o animal deixar de responder a estímulos táteis suaves, fixe-o na bandeja com o lado dorsal voltado para cima. Coloque um alfinete na cauda e um alfinete em cada tentáculo anterior.Em seguida, use a pinça para pinçar e levantar a pele do animal no meio da cabeça. Atrás dos chifres do rinoceronte, faça uma incisão coronal através da cabeça do animal, logo atrás do ponto que está sendo segurado. Depois disso, faça uma incisão sagital mediana entre os chifres do rinoceronte em direção à boca para expor a massa bucal.Em seguida, puxe a aba de pele para longe da massa bucal e corte os nervos e o tecido conjuntivo que se prendem à parede do corpo. Para separar completamente essa aba de pele da massa bucal, certifique-se de não cortar nenhum nervo ou tecido intrínseco à massa bucal. Depois, segure e mantenha o esôfago.Corte o esôfago posteriormente ao ponto que está sendo segurado. Puxe para cima o esôfago e levante a massa bucal atrás da massa bucal. Os gânglios cerebral, pleural e pedal formam um anel, com o gânglio cerebral ligado aos gânglios bucais pelos conectivos cerebrais bucais.Deixe esses gânglios anulares aderidos à massa bucal e corte todos os nervos que se projetam desses gânglios para outras partes do corpo. Em seguida, corte o tecido conjuntivo ao redor da massa bucal e continue levantando a massa bucal à medida que ela se desconecta do corpo. Quando a massa bucal estiver presa apenas à boca, segure o esôfago e a massa bucal.Verticalmente para cima. Faça um corte final logo anterior às mandíbulas para soltar a massa bucal do corpo. Coloque a massa bucal em uma solução contendo 50% de cloreto de magnésio isotônico e 50% de solução salina SIA para manter uma anestesia parcial enquanto os eletrodos são fixados.Posteriormente, coloque a massa bucal com a solução em uma placa de Petri com fundo de charuto, cortando a artéria bucal na superfície ventral da massa bucal. Em seguida, remova os gânglios pleurais e pedais cortando suas conexões com o gânglio cerebral. Deixe o gânglio cerebral ligado aos gânglios bucais e à massa bucal por meio dos CBCs e seccione as demais conexões entre o gânglio cerebral e a massa bucal.Reduza o esôfago e as glândulas salivares a pequenos comprimentos. Nesta etapa, fixe os eletrodos em gancho ao nervo ocular ular, aos dois nervos bucais musculares dois e três, e ao ramo A do nervo bucal dois. Utilize um procedimento semelhante ao demonstrado na publicação do JoVE por Collins e Shield, e resumido brevemente aqui.Para cada descolamento de eletrodo, posicione o eletrodo próximo ao nervo ou músculo, coloque o nervo-alvo no gancho e levante suavemente usando um manipulador. Em seguida, seque a seção do nervo com um lenço de papel Kim. Aplique uma gota de cola super rápida em gel no nervo preso ao gancho e certifique-se de que o gancho esteja completamente coberto pela cola e que a ponta do fio de referência não esteja coberta pela cola.Em seguida, utiliza-se uma seringa com uma peça de tubo de polietileno para aplicar a solução do recipiente sobre a cola, o que induzirá a solidificação da superfície da cola. O próximo passo é preparar um recipiente redondo de gravação de 100 por 50 milímetros de Pyrex para uso como câmara de gravação; aplique uma camada fina de graxa de vácuo na reentrância entre as câmaras cerebral e dorsal com a ponteira de uma pipeta, a fim de minimizar vazamentos. Em seguida, encha a câmara frontal com salina plescia.Transfira cuidadosamente a massa bucal da placa de Petri para a câmara frontal do recipiente redondo de Pyrex e certifique-se de que nenhum dos eletrodos seja puxado com força, o que poderia romper os nervos. Tenha muito cuidado com os eletrodos em forma de gancho se o recipiente precisar ser transferido para outro microscópio estereoscópico. Para afinar a bainha.Agrupe os eletrodos em cada lado da massa bucal. Segure cuidadosamente os eletrodos segurando a fita laboratorial que cobre os pinos do conector e, novamente, certifique-se de que nenhum dos eletrodos esteja tracionado com força. Quando a placa estiver posicionada sob o microscópio, os eletrodos devem ser dispostos suavemente sobre as bordas da placa e repousar sobre a plataforma durante as pausas e entre as etapas do experimento; areje a solução salina na câmara da massa bucal usando uma pedra difusora de ar de aquário.Em seguida, fixe o gânglio cerebral na câmara traseira com os CBCs passando pelo entalhe. Aplique mais graxa de vácuo sobre os CBCs. Depois, adicione mais salina SIA a ambas as partes do recipiente para que os gânglios fiquem completamente submersos.Certifique-se de que o nível de salina esteja abaixo da altura da graxa de vácuo entre as câmaras cerebral e bucal para que não ocorra vazamento entre as câmaras. Nesta etapa, a massa bucal deve repousar no fundo da câmara frontal. Em seguida, fixe os gânglios bucais na plataforma intermediária para evitar danificar os nervos que ainda estão ligados à massa bucal.Coloque os alfinetes apenas na bainha entre dois nervos. Em seguida, adicione mais dois alfinetes na lateral das CBCs para esticá-las e fixá-las. Mantenha os gânglios bucais planos ou rotacionados, conforme a localização dos neurônios de interesse.Para rotacionar o gânglio bucal, use um par de pin&ccedil;as finas para segurar um excesso de bainha do CBC e fix&aacute;-lo entre o nervo bucal dois e o nervo bucal tr&ecirc;s. Em seguida, a maioria dos corpos celulares pr&oacute;ximos &agrave; c&acirc;mara posterior, que n&atilde;o podem ser facilmente acessados pela parte superior do g&acirc;nglio bucal, agora pode ser visualizada. Por &uacute;ltimo, adicione dois alfinetes na bainha do g&acirc;nglio bucal pr&oacute;ximos ao lado da massa bucal.Para minimizar o movimento do gânglio bucal, segure a bainha do gânglio bucal próxima à câmara traseira e corte o excesso de bainha com tesoura fina, sem expor os corpos celulares. Para minimizar danos, remova apenas a quantidade de bainha necessária para visualizar os corpos celulares após a redução da espessura da bainha. Conecte todos os pinos de eletrodo aos seus conectores nos cabos que se ligam aos amplificadores.Certifique-se de que os eletrodos não estejam puxados com força e estejam corretamente conectados aos respectivos cabos, e de que as polaridades estejam corretas para lavar qualquer cloreto de magnésio remanescente. Substitua o salino SIA na câmara do bulbo bucal por salino SIA fresco. Em seguida, passe um fio de seda através do tecido mole na parte frontal do bulbo bucal e dorsal à cartilagem da mandíbula.Use dois pedaços de massa de modelar para fixar a sutura à borda do recipiente, suspendendo assim a massa bucal pela sua extremidade anterior. Um manipulador segura um eletrodo extracelular de vidro de forma que a ponta do eletrodo fique próxima ao gânglio bucal. Para localizar e identificar um neurônio, abaixe suavemente a ponta do eletrodo extracelular sobre a bainha.Sobre o corpo celular do neurônio. Aplique uma corrente estimulante e, em seguida, mude o canal que está sendo usado para excitar o corpo celular para o modo de gravação, a fim de registrar a atividade no eletrodo extracelular e a atividade correspondente nos nervos para induzir a rejeição. Assim como programas motores estimulam o nervo bucal dois A com uma longa série de pulsos de dois hertz, um milissegundo, para gerar padrões de ees.Os padrões continuam durante todo o período de estimulação e podem persistir até pouco tempo após o término da estimulação. Para induzir programas motores semelhantes à mordida, coloque alguns cristais de caracol sólido diretamente sobre o gânglio cerebral.Padrões repetitivos geralmente começam dentro de cinco minutos e duram aproximadamente de 10 a 15 minutos antes de começar a diminuir para induzir a deglutição. Como nos programas motores, aplique caracol e aguarde até que a massa bucal gere mordidas fortes. Em seguida, durante uma mordida, coloque uma tira de alga na boca do animal de modo que ele agarre a alga.Aqui está a estimulação e gravação do neurônio motor identificado B nove e a gravação desse mesmo neurônio, do músculo I dois e de vários nervos durante programas motores de alimentação. Abaixo estão as imagens de vídeo obtidas da mesma série de programas motores. Padrões de deglutição foram induzidos pela aplicação de carbacol ao gânglio cerebral e pela subsequente colocação de uma tira de alga no aparelho mastigador durante a mordida induzida por carbacol.Nesta imagem, a rádula está protrata para agarrar a alga, e nesta imagem, a rádula retraiu-se, puxando a alga para dentro da boca. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar a preparação suspensa da massa bucal e obter registros dos programas motores de alimentação in vitro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Aplysia Preparação de Ganglia para Análises Eletrofisiológicas e Moleculares de Neurônios Únicos

Os ensaios comportamentais fornecem ferramentas poderosas para a compreensão da função neuronal. Aqui apresentamos vários protocolos para quantificar o comportamento alimentar predatório encontrado no nematóide modelo Pristionchus pacificus e seus parentes. Além disso, fornecemos métodos para analisar adaptações alimentares predatórias, incluindo estruturas bucais e dentes.

Ensaiar comportamentos alimentares predadores em<em&gt; Pristionchus</em&gt; E outros nematóides

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

Aqui nós apresentamos um protocolo para o lesioning cirúrgico minimamente invasor dos músculos intrínsecos ao instrumento de alimentação do molusco marinho Aplysia californica para compreender os papéis destes músculos durante o comportamento de alimentação.

Técnica de lesão minimamente invasiva para músculos intrínsecos ao Odontophore de Aplysia californica

Este protocolo apresenta um método para a atividade populacional neuronal de imagem com resolução unicelular em espécies invertebrados não transgênicas usando corantes sensíveis à tensão de absorvância e uma matriz de fotodiodo. Essa abordagem permite um fluxo de trabalho rápido, onde imagens e análises podem ser perseguidas ao longo de um único dia.

Imagem óptica baseada em fotodiodo para dinâmica de rede de gravação com resolução de neurônio único em invertebrados não transgênicos

Este protocolo detalha um ensaio quantitativo de defecação em jovens mutantes RAC1/ CED-10 Caenorhabditis elegans, fornecendo um modelo direto para estudar os estágios da doença prodrômica de Parkinson. Ela supera limitações de outros modelos animais e facilita o teste de estratégias terapêuticas que visam a patologia parkinsoniana precoce.

Avaliação da Motilidade Gastrointestinal em Mutantes RAC1/CED-10 de Caenorhabditis elegans como uma ferramenta para estudar a doença de Parkinson precoce

Aprenda a registrar atividade elétrica de nervos, músculos e neurônios durante programas motores de alimentação em Aplysia californica. Este método permite observar movimentos fisiológicos do aparelho bucal in vitro.

Um In Vitro Preparação para divulgação e gravação de programas de alimentação do motor com movimentos fisiológicos em Aplysia californica (Vídeo) | JoVE Journal

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