Name: Neo-Islet Formação em fígado de ratos diabéticos por Helper dependente de Transferência de Gene adenoviral Vector Mediada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Aprenda a induzir formação de neo-ilhotas no fígado de camundongos diabéticos usando vetores adenovirais helper-dependentes. Este método de terapia gênica normaliza a glicemia e os níveis de insulina.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi suportado por concessões do NIH: R03 DK089061-01 (VKY); NIH: K08 DK068391 (VKY), o Diabetes e Endocrinologia Centro de Pesquisa (DERC - P30DK079638) no Baylor College of Medicine, uma bolsa de piloto e de viabilidade de do DERC (VKY); Juvenile Diabetes Research Foundation: JDRF Prêmio # 5-2006-134 (VKY).

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

HDAds têm sido desenvolvidas para ultrapassar a fraqueza de anúncios geração inicial e para aproveitar para aplicação de terapia génica. No entanto, os desafios técnicos permanecem. Por exemplo, requer HDAD HV para embalagens HDAD e amplificação vector não é tão eficiente como os anúncios geração antecipada. HV é um anúncio de primeira geração e de qualquer contaminação de compromisso da eficácia da HV HDAD. Portanto, transfecção altamente eficiente e as condições ideais para cada passagem de série são críticos. Um outro parâmetro crítico para a produção de vector é que a passagem (P1-P4) deve ser utilizada para a passagem subsequente de 5, que é directamente utilizado como inoculo para as células em suspensão. Para a experiência, os melhores resultados são obtidos utilizando a passagem pela qual HDAD proporção vector é dramaticamente aumentada na seguinte passagem (P3 na Figura 2). O rendimento de vectores HDAD depende cassetes transgene. Durante a produção de vector, ambos os transgenes são expressos porque ambos os genes estão sobpromotor onipresente. Ngn3 é um factor de transcrição e BTC é um factor de crescimento, o que sugere que o factor de transcrição HDAD vector expressando o que pode influenciar a linhagem de células inibe a amplificação vector, enquanto que a hormona do crescimento expressando ajuda na replicação do vector e embalagem. Com diabetes assumindo proporções epidêmicas, novas abordagens para restaurar b célula de massa são necessários. Neste relatório, nós descrevemos métodos para aproveitar as vantagens de vetores HDAD para efetuar a transferência de genes de ilhota linhagem definir fator de transcrição, Ngn3 juntamente com o fator de crescimento ilhota, betacelulina para induzir neogênese ilhota em regiões periportal do fígado. Para avaliar a eficácia do presente, é importante escolher os ratos com hiperglicemia estável e assegurar que os controlos apropriados são sempre incluídas. Para estas experiências de transferência de genes, o vector vazio trataram ratos diabéticos deve sempre ser utilizado. Além disso, utilizando-HDAD Ngn3 e HDAD-Btc tratadas individualmente diabética mice serve para testar a contribuição desses dois genes em ilhota neogênese. Como os nossos dados demonstram que Ngn3 por si só é suficiente para induzir a ilhota neogénese, mas a adição do factor de crescimento, BTC, serve para aumentar a resposta levando à indução de ilhota neogénese robusto. Também é importante para testar se o vector de expressão é de facto conseguida no tecido alvo, o fígado e também para demonstrar que a insulina testados no plasma de ratinhos tratados não é proveniente de ilhotas residuais no pâncreas, demonstrando a ausência de pâncreas ilhotas nos ratos diabéticos. Em resumo, a vantagem de o sistema HDAD vector para a transferência de gene é a sua capacidade de clonagem elevada, a transdução eficiente e da expressão do gene de longa duração no fígado com toxicidade crónica mínimo, assim como a sua natureza de não integração do genoma do vector no hospedeiro cromossomo. As limitações principais são os passos complexos envolvidos na sua produção e do seuaplicação in vivo é essencialmente limitada ao fígado, sendo o mais popular Ad serotipo 5. Islet neogénese podem ser induzidas a restaurar completamente a insulina no plasma e de tolerância à glucose em ratos diabéticos através da indução de neogénese ilhota no fígado, por transferência de genes de factor de transcrição ilhota linhagem definidora, Ngn3 juntamente com o factor de crescimento das ilhotas, betacelulina. Neste relatório, nós apresentamos o protocolo ideal para gerar alta qualidade HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC, e demonstrar técnicas para induzir e avaliar neogênese ilhota nos fígados dos camundongos diabéticos para reverter a hiperglicemia. Nota de rodapé: Os vectores virais e as linhas de células descritas aqui estão disponíveis a partir do núcleo Vector Laboratory Produção, Diabetes Research Center, Baylor College of Medicine ( <a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a> ). Alguns kits comerciais também estão disponíveis para a geração de vírus (por exemplo, HDAD Microbix biosystems Inc.).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> ProFectionR kit Transfecção mamíferos </td><td> Promega </td><td> E1200 </td></tr><tr><td> Kit Blood &amp; Tissue Dneasy (50) </td><td> Qiagen </td><td> 69504 </td></tr><tr><td> Perfecta SYBR Green Supermix, ROX </td><td> Quanta Biociências </td><td> 95055-500 </td></tr><tr><td> Deoxicolato de sódio </td><td> Sigma </td><td> D6750-25G </td></tr><tr><td> MEM em pó </td><td> Invitrogen </td><td> 61100087 </td></tr><tr><td> Estreptomicina penicilina </td><td> Sigma </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Sigma </td><td> H0654-1G </td></tr><tr&gt; <td> MEM ÁGUIA Joklik </td><td> Sigma </td><td> M0518-10L </td></tr><tr><td> Rnase </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td></tr><tr><td> DNase I, grau II </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Estreptozocina </td><td> Sigma </td><td> s0130 </td></tr><tr><td> Vidro giratório frascos </td><td> Corning </td><td> 4500-3L </td></tr><tr><td> Vidro giratório frascos </td><td> Corning </td><td> 4500-250 </td></tr><tr><td> Deslize A-lyzer Casset </td><td> PIERCE CH </td><td> PI66380 </td></tr><tr><td> Tubo optiseal poli allomer, 11,2 ml </td><td> Beckman Coulter </td><td> 362181 </td></tr><tr><td> Cloreto de césio 1 kg </td><td> JT4042-2 </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman LE-80K </td><td> Beckman Coulter </td><td> Ultracentrífuga LE-80K ideal </td></tr><tr><td> Filtrar </td><td> VWR </td><td> 28143-338 </td></tr><tr><td> centrifugar m tubo de 500l </td><td> Corning </td><td> 431123 </td></tr><tr><td> tailveiner limitador </td><td> Braintree científica, INC </td><td> tv-150 </td></tr><tr><td> A insulina, Rato ELISA </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td></tr><tr><td> microvette CB300 </td><td> Sarstedt </td><td> 16.443.100 </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td></tr><tr><td> Rato peptídeo C ELISA Kit </td><td> Wako Pure Chemical Industries, Ltd </td><td> # 631-07231 </td></tr><tr><td> cobaia anticorpo anti-insulina </td><td> Abcam </td><td> ab7842 </td></tr><tr><td> anticorpo de cabra anti-Pdx1 </td><td> presente do Dr. Christopher Wright </td><td></td></tr><tr><td> rato anti Ngn3 anticorpo </td><td> Consórcio de Biologia das células beta, Univ. da Pensilvânia </td><td> AB2013 </td></tr><tr><td> rato anti Nkx6.1 anticorpo </td><td> Consórcio de Biologia das células beta, Univ. de Pennsylvania </td><td> F64A6B4 </td></tr><tr><td> anticorpo anti-betacelulina </td><td> Cell Sciences </td><td> PAAQ1 </td></tr><tr><td> ALT (TGP) SET Reagente de Cor. </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A526 - 120 </td></tr><tr><td> AST / (TGO), Cor conjunto de reagentes Endpoint </td><td> Teco Diagnóstico </td><td> A561-120 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes e equipamentos específicos.

neo-islet formação em fígado de ratos diabéticos por helper dependente de transferência de gene adenoviral vector mediada

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

A diabetes tipo 1 é causada pela destruição mediada por células T auto-imune das células produtoras de insulina no pâncreas. Até agora, a reposição de insulina é ainda a terapêutica maior, porque transplante de ilhotas foi limitada pela disponibilidade de dadores e pela necessidade de imunossupressão a longo prazo. Induzida por ilhota neogénese por transferência de genes de Neuogenin3 (Ngn3), a linhagem de ilhotas de definição factor de transcrição específico e betacelulina (BTC), um factor de crescimento de ilhotas tem o potencial de curar a diabetes do tipo 1. Vectores adenovirais (Ads) são vectores de transferência de genes altamente eficiente, no entanto, os anúncios geração iniciais têm várias desvantagens para a utilização in vivo. Ajudante de dependentes de Anúncios (HDAds) são os anúncios mais avançadas que foram desenvolvidos para melhorar o perfil de segurança da primeira geração de anúncios e para prolongar transgene expressão 1. Eles não têm a toxicidade crônica porque faltam seqüências virais codificação 2-5 e manter somente o anúncio cis elements necessárias para a replicação do vector e embalagem. Isto permite a clonagem de genes de até 36 kb. Neste protocolo, descrevemos o método para gerar HDAD-Ngn3 e HDAD-BTC e entregar esses vetores em ratos STZ-induzidos diabéticos. Os nossos resultados mostram que a co-injecção de HDAD-Ngn3 e &quot;ilhéus&quot; neo-HDAD Btc induz no fígado e inverte a hiperglicemia em ratos diabéticos.

Nós descrevemos a formação de neo-hepática ilhota em STZ (estreptozotocina) induzida ratos diabéticos por transferência de genes de Neurogenin3 (Ngn3) e betacelulina (BTC), utilizando ajudante dependente do vector adenoviral (HDAD) e reversão da hiperglicemia. O nosso método tem vantagens do ajudante dependente de vectores adenovirais com a sua grande eficácia na transdução in vivo e a expressão do gene de longa duração.

Neo-Islet Formação em fígado de ratos diabéticos por Helper dependente de Transferência de Gene adenoviral Vector Mediada

O diabetes tipo 1 é causado pela destruição autoimune, mediada por células T, das células produtoras de insulina no pâncreas. Até o momento, a reposição de insulina continua sendo a ...

O objetivo geral do experimento a seguir é induzir neo-ilhotas no fígado de camundongos diabéticos por meio da transferência gênica mediada por vetor adenoviral dependente de auxiliar. Isso é conseguido gerando vetores adenovirais dependentes de auxiliar que carregam o fator de transcrição da ilhota neurogene em três e o fator de crescimento da ilhota betalina, a fim de induzir a formação de neo-ilhotas periportais no fígado; os vetores são então injetados em camundongos diabéticos. Os camundongos diabéticos tratados são posteriormente testados quanto à normalização da glicose sanguínea, insulina plasmática e à presença de células beta produtoras de insulina no fígado.Os resultados desses ensaios demonstram que a hiperglicemia é revertida em camundongos tratados com vetor devido à formação de neo-pálpebras nas regiões periportais do fígado. A vantagem do vetor adenoviral dependente de herpa é o amplo tropismo e alta capacidade crônica. Além disso, o vetor adenoviral dependente de herpa não contém nenhuma região codificadora de avir.É por isso que ele não apresenta toxicidade crônica. As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento do diabetes, pois a indução de novos ilhotas é uma alternativa eficaz ao transplante de ilhotas, que é limitado pela escassez de doadores, falha do enxerto e imunidade alo. Geralmente, indivíduos novos nesse método terão dificuldades, pois o processo de transfeção é difícil devido ao grande tamanho do vetor classe-parceiro.E para minimizar a contaminação por vírus no ambiente, o processo de amplificação e purificação deve ser manipulado com cuidado. A produção de vetores adenovirais dependentes de auxiliares envolve múltiplas etapas que devem ser cuidadosamente seguidas para obter resultados ideais. Em preparação para a semente de transfeção, semeie 800.001 células em cada um de dois pratos de seis centímetros.Incubar a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono. Após dois dias, as células estarão 70 a 80% confluentes para transfeção. No dia da transfeção.Substitua o meio de crescimento por cinco mililitros de meio fresco e incube as células por três horas. Em seguida, utilizando o kit de transfeção de mamíferos ProFection da Promega, transfete as células um 16 com 10 microgramas de DNA que codifica o neurogene três, referido doravante como três, ou uma célula beta, referida doravante como BTC. No dia seguinte, lave as células duas vezes com um mililitro de meio de crescimento a cada vez.Adicione o vírus auxiliar na proporção de 500 partículas vetoriais por célula em 0,1 mililitros de PBS com cálcio e magnésio. Em seguida, coloque as células no incubador a cada 10 minutos. Agite suavemente as placas para distribuir uniformemente o vírus auxiliar.Após 60 minutos, adicione 1,5 mililitros de meio de manutenção e retorne as placas ao incubador por 24 horas. No dia seguinte, adicione mais um mililitro de meio de manutenção. Em seguida, utilizando um microscópio óptico padrão, examine as células para avaliar os efeitos citopáticos.Células infectadas ficarão arredondadas e destacadas. Continue incubando as células infectadas até o segundo dia. Neste ponto, mais de 80% das células devem apresentar efeitos citopáticos.Colete o lisado viral bruto pipetando para cima e para baixo e transfira-o para um tubo de cinco mililitros contendo o lisado viral bruto. Adicione 10% do volume de sacarose a 40%. Rotule este tubo como LVB para passagem zero do lisado viral bruto para piolhos.Para liberar partículas virais, congele e descongele o tubo contendo o lisado viral bruto três vezes, alternando a colocação do tubo em um congelador a menos 80 °C e em um banho-maria a 37 °C. Após o terceiro ciclo de congelamento e descongelamento, utilize o meio para amplificar ainda mais o vetor conforme descrito no texto acompanhante. O processo de amplificação do vetor produzirá um lisado viral bruto da passagem cinco ou P cinco do vetor.Para a produção em larga escala de adenovírus dependentes de vetor auxiliar, comece descongelando e congelando três vezes o P cinco do procedimento de amplificação do vetor, como antes, durante o processo de congelação e descongelação. Transfira uma quantidade de 16 células de um frasco agitado de três litros para frascos cónicos de 500 mililitros e centrifugue-os a 1000 vezes G durante cinco minutos. Após a centrifugação, remova todo o sobrenadante, exceto 100 mililitros.Em seguida, ressuspenda as células e transfira-as para um frasco agitado de 250 mililitros contendo as células ressuspendidas. Adicione todo o lisado viral bruto P5. Em seguida, adicione o vírus auxiliar na proporção de 200 partículas virais por célula e incube por uma hora a 37 graus Celsius a 60 RPM.Após a incubação, transfira um mililitro da suspensão celular para um poço de uma placa de 12 poços. Transfira o restante da suspensão celular para um novo frasco agitado de três litros e adicione dois litros de meio de crescimento em suspensão. Incube o frasco e a placa por dois dias em uma incubadora de dióxido de carbono a 60 RPM. Nos próximos dois dias, monitore as células na placa quanto a efeitos citopáticos.Se as células na placa apresentarem efeitos citopáticos, as células no frasco agitado também apresentarão efeitos citopáticos. Após a incubação, colete as células por centrifugação e ressuspenda com 15 mililitros de tris 100 milimolar. HCL em um tubo de 50 mililitros identificado como P seis.Armazene este tubo a menos 80 graus Celsius até a purificação. Para purificar o vetor, adicione um mililitro de desoxicolato de sódio a 5% ao tubo descongelado contendo o lisado viral bruto P6. Misture suavemente e incube por 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione cloreto de magnésio, RNA A e DNA 1 e incube a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, centrifugue o tubo a 6.000 ×g por 10 minutos. Após a centrifugação, colete o sobrenadante em um novo tubo de 50 mililitros e transfira para um tubo de ultracentrífuga NVT 65 esterilizado. Adicione 2,8 mililitros de uma solução de cloreto de césio de baixa densidade a 1,25 gramas por mililitro.Em seguida, utilizando uma pipeta de dois mililitros, sobrepõe-se 2,8 mililitros de uma solução de cloreto de CM de alta densidade a 1,41 gramas por mililitro ao tubo, tocando a pipeta no fundo do tubo e liberando lentamente a solução. A seguir, utilizando uma pipeta de dois mililitros, sobrepõe-se de cinco a seis mililitros do sobrenadante. Tocando a parede lateral do tubo e liberando lentamente a solução, o tubo deve ser preenchido até o gargalo.Caso contrário, pode colapsar durante a centrifugação em alta velocidade. Use tris HCl 100 milimolar para completar o tubo, se necessário. Em seguida, centrifugue a 10 graus Celsius por 30 minutos a 237.000 × g a 10 graus Celsius.Após a ultracentrifugação em gradiente de densidade, uma única faixa opalescente de vetor é visível abaixo dos detritos celulares opacos. Às vezes, uma faixa auxiliar muito tênue pode ser observada abaixo da faixa de vetor mais proeminente. Limpe o tubo na faixa opalescente inferior com etanol a 70%.Em seguida, utilizando uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 22, fure a parede do tubo na base da faixa do vetor e colete a faixa opalescente inferior. Transfira o material do vetor coletado para novos tubos esterilizados para ultracentrifugação e, então, sobreponha solução de cloreto de césio com densidade de 1,35 gramas por mililitro para preencher os tubos até o gargalo.Centrifugue a 10 graus Celsius a 237.000 × g durante a noite. Após o segundo gradiente de densidade, realize a ultracentrifugação e colete a faixa opalescente como anteriormente. Transfira a faixa para uma cassete de diálise e realize a diálise contra três litros de T tris estéril, HCl contendo cloreto de magnésio e sacarose, a quatro graus Celsius durante a noite; no dia seguinte.Para remover o vetor adenoviral dependente de auxiliar da cassete de diálise, use uma seringa de três mililitros para injetar dois mililitros de ar na cassete a partir do canto superior. Vire a cassete de modo que a seringa e a agulha fiquem no canto inferior e, mantendo a cassete na posição vertical, aspire a solução para dentro da seringa. Transfira a solução, que agora contém o vírus purificado, para tubos criogênicos identificados.Aliquotar 20 microlitros para titulação física e 50 microlitros para caracterização do DNA em tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e, em seguida, congelar. Os tubos criogênicos contêm o vírus purificado a menos 80. O vírus purificado deve então ser avaliado quanto à pureza mais rigorosa e à eficácia in vitro.Conforme descrito no documento complementar, a estreptozotocina é usada para induzir diabetes. Neste estudo, conforme descrito no documento complementar, monitore semanalmente os níveis de hiperglicemia em camundongos tratados com estreptozotocina. Assim que a glicemia atingir entre 250 e 500 miligramas por decilitro durante 48 horas, coloque os camundongos no suporte para veia caudal para uma injeção na veia da cauda.Coloque a cauda em um tubo de 50 mililitros contendo água morna para dilatar as veias da cauda. Em seguida, limpe a cauda com um tecido embebido em etanol 70%. Carregue uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 30 e meio com a concentração apropriada do vetor e verifique se não há bolhas na seringa.Em seguida, com o polegar e o indicador, segure a cauda abaixo do local da injeção e insira a agulha na veia da cauda. Se a agulha estiver dentro da veia, pode-se observar um reflexo de sangue no hub da agulha. Injete o vetor lentamente.Se a agulha estiver adequadamente posicionada, não haverá resistência durante a injeção após a administração. Remova a agulha e pressione o local da injeção com gaze para interromper qualquer sangramento antes de devolver o camundongo à gaiola. Após o tratamento com vetor, monitore a glicemia em jejum de seis horas e o peso corporal semanalmente, e acompanhe os níveis de insulina e enzimas hepáticas a cada duas semanas.Realize um teste de tolerância à glicose seis semanas após o tratamento para verificar se a secreção de insulina estimulada por glicose foi restaurada in vivo nas três e seis semanas após o tratamento. Colete o fígado e o pâncreas dos camundongos para análise de MNA tecidual e coloração imuno-histoquímica, a fim de avaliar se a neoformação de ilhotas pode ser induzida no fígado de camundongos diabéticos por meio da transferência gênica mediada por vetor adenoviral. Os vetores adenovirais dependentes de auxiliar ou H-D-A-D-N-G-N três e vetores BTC foram preparados e purificados conforme descrito neste vídeo, sendo administrados a camundongos diabéticos induzidos por estreptozotocina por injeção na veia da cauda.Vetores vazios e vetores H-D-A-D-B-T-C isolados serviram como controles negativos. A glicemia foi então monitorada a cada dois dias por sete a 10 dias após a injeção. A hiperglicemia foi revertida em camundongos injetados com HDAD e GN três e H-D-A-D-B-T-C, mas não em camundongos controles.A secreção de insulina estimulada pela glicose também foi monitorada por meio de um teste de tolerância à glicose realizado seis semanas após o tratamento, conforme mostrado aqui. A secreção de insulina foi restaurada nos camundongos injetados com HDAD e GN três e H-D-A-D-B-T-C para avaliar se a insulina foi sintetizada no fígado. O teor de peptídeo C e insulina foi analisado no fígado.As concentrações de peptídeo C e o conteúdo total de insulina foram medidos utilizando um kit comercial de ELIZA. A presença de peptídeo e insulina em razões molares confirma que a insulina detectada no fígado está, de fato, sendo sintetizada no próprio fígado. A imuno-histoquímica revelou células positivas no fígado de camundongos tratados com HDAD, NGN três e H-D-A-D-B-T-C, mas não em camundongos tratados com vetor controle. A imunomarcação também demonstrou que não havia ilhotas residuais no pâncreas dos camundongos tratados com NGN três BTC.A expressão do fator de transcrição específico da linhagem da pálpebra também foi avaliada por imunomarcação do fígado. Como mostrado aqui, NGN três foi expresso no fígado de camundongos tratados com NGN três BTC, mas não em camundongos tratados com vetor vazio.Da mesma forma, o BTC foi expresso em um nível mais alto no fígado de camundongos tratados com NGN três BTC em comparação com o observado com o tratamento com vetor vazio, conforme visto aqui. A imuno-histoquímica P DX um revelou localização nuclear nos fígados tratados com NGN três BTC, mas não nos fígados de camundongos tratados com vetor vazio. NK X 6.1 também foi detectado apenas nos fígados de camundongos tratados com NGN três BTC analisados.Conjuntamente, esses resultados sugerem a indução bem-sucedida da formação de uma nova pálpebra no fígado de camundongo. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como gerar vetores adenovirais dependentes de auxílio para transferir genes determinantes da linhagem da pálpebra para o fígado, com o objetivo de induzir a neoformação da pálpebra. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três semanas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o vírus auxiliar é um avir de primeira geração que nos auxilia. A contaminação deve ser mantida ao mínimo para aplicações in vivo.

neo-islet-formation-liver-diabetic-mice-helper-dependent-adenoviral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Transplante de ilhotas isoladas foi proposto para ser um potencial tratamento para diabetes tipo 1. Aqui nós descrevemos um método para isolar ilhotas de rato pancreata e transplantá-las para o espaço subcapsular do rim.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Este protocolo permite uma para identificar factores que modulam a massa de células funcional de beta para encontrar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes. O protocolo é constituído por um método simplificado para avaliar a replicação de ilhotas e função das células beta em ilhéus isolados de ratos após a manipulação da expressão do gene com adenovírus.

Avaliação de replicação e função das células beta no Adenovirally transduzidas isoladas ilhotas de roedores

Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Este protocolo demonstra isolamento de manchas murinas e semeadura em um andaime decelularizado. As ilhotas suportadas em andaimes foram transplantadas para a almofada de gordura epididimática de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ). As ilhotas sobreviveram no local do transplante e revertearam a condição hiperglicêmica.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

É apresentado um método para o omental transplante de ilhotas em um rato. As ilhotas isoladas são misturadas com hidrogel e a mistura é colocada em bolsa omental de um rato diabético. Então, a glicose no sangue é monitorada, e é realizada a análise imuno-histoquímico.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação da expressão do transgene usando pEUI(+) singular gene interruptor por tebufenozide tratamento.

Um isoinokosterone baseado no Receptor Singular Gene interruptor para deliberada expressão do Transgene com robustez, reversibilidade e insignificante Leakiness

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Um protocolo para criar pseudoislets humanos modificados gene das pilhas de ilhotas humanas dispersas que são transados pelo Lentivirus que carreg o RNA curto do hairpin (shRNA) é apresentado. Este protocolo utiliza prontamente-as embarcações disponíveis da enzima e da cultura, podem ser executadas facilmente, e produzem os pseudoislets humanos genetically modificados apropriados para estudos funcionais e morfológicos.

Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

Este protocolo descreve um método simples e minimamente invasivo para transplante e obtenção de imagens de células NIT-1 em camundongos imunodeficientes combinados não-obesos diabéticos (NOD)-graves desafiados com esplenócitos purificados de camundongos NOD espontaneamente diabéticos.

Monitoramento Bioluminescente da Sobrevida do Enxerto em Modelo de Transferência Adotiva de Diabetes Autoimune em Camundongos

Fornecemos um protocolo minimamente invasivo para o transplante intramuscular de ilhéus de células-tronco pancreáticas derivadas de células-tronco humanas em camundongos imunodeficientes, para implantação in vivo e análise posterior.

Transplante Intramuscular de Células Endócrinas Pancreáticas Derivadas de Células-Tronco Humanas Pluripotentes em Camundongos

Aprenda a induzir formação de neo-ilhotas no fígado de camundongos diabéticos usando vetores adenovirais helper-dependentes. Este método de terapia gênica normaliza a glicemia e os níveis de insulina.

Neo-Islet Formação em fígado de ratos diabéticos por Helper dependente de Transferência de Gene adenoviral Vector Mediada

Explorar mais vídeos