Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

O objetivo geral deste procedimento é isolar células epiteliais alveolares do tipo dois neuronais primárias puras e viáveis para análises funcionais e moleculares subsequentes. Primeiro, o pulmão e a traqueia de um camundongo sacrificado são instilados com uma solução de DYS displays e, em seguida, com agarose. O pulmão é então removido após a dispa ter digerido o tecido pulmonar.

O tecido é desintegrado manualmente. A suspensão resultante é filtrada por meio de uma série de malhas com tamanho de poro decrescente. Em seguida, as células epiteliais alveolares do tipo dois são coradas e isoladas por seleção negativa por citometria de fluxo.

Por fim, as células epiteliais alveolares do tipo dois isoladas podem ser utilizadas para realizar ensaios funcionais e moleculares com o objetivo de estudar seu papel nas infecções respiratórias e doenças autoimunes pulmonares. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da imunologia pulmonar, especialmente no contexto de doenças pulmonares autoimunes e infecções virais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o preparo do órgão e da suspensão celular é difícil de aprender.

O sucesso geral deste protocolo depende de vários detalhes importantes durante essas etapas. Para cada camundongo do experimento, aqueça previamente um tubo de 15 mililitros contendo quatro mililitros de DYS bays em um banho-maria a 37 graus Celsius; coloque pequenas alíquotas de 1% low. Mel Aros em água em um bloco aquecedor a 95 graus Celsius até liquefazer. Em seguida, resfrie a 45 graus Celsius e mantenha-os nessa temperatura até o próximo uso.

Para preparar o pulmão de camundongo, pulverize um camundongo que foi sacrificado por asfixia com CO2. Com etanol. Faça um corte longo ao longo da linha média ventral do corpo.

Em seguida, puxe a pele ventral distante e corte cuidadosamente, removendo o peritônio. Após a exsanguinação do camundongo, perfure cuidadosamente e remova o diafragma, depois corte as costelas. Para expor o coração e o pulmão, tenha especial cuidado para não lesar o pulmão com uma cânula de calibre 26 e uma seringa de 10 mililitros cheia de líquido frio.

Fure com PBS o ventrículo direito do coração e perfunda o pulmão com PBS até que esteja livre de sangue. Corte e remova as glândulas salivares para expor a traqueia. Além disso, corte cuidadosamente os músculos ao redor da traqueia.

Em seguida, insira uma cânula permanente de calibre 22 na traqueia. Remova a agulha e empurre o cateter plástico em direção ao pulmão. Fixe o cateter no lugar amarrando um pequeno pedaço de barbante ao redor da traqueia e do cateter.

Se desejar, prepare uma amostra de líquido de lavagem broncoalveolar lavando os pulmões com PBS ou meio utilizando o cateter inserido na traqueia. Armazene o líquido de lavagem sobre gelo até a análise subsequente. O aspecto mais difícil deste procedimento é a digestão e a desintegração tecidual.

Para garantir o sucesso deste protocolo, é necessário assegurar que a dispasa completa seja preenchida em todos os lobos pulmonares e após a digestão do tecido. É preciso desintegrar o tecido usando cuidadosamente uma seringa de dois mililitros, injetando um volume máximo de dois mililitros da dispasa preparada anteriormente no pulmão através do cateter, de modo que todos os lobos fiquem totalmente expandidos. Substitua a seringa por uma seringa de um mililitro contendo 0,5 mililitro da aros liquefeita e administre o conteúdo no pulmão.

Deixe a seringa no cateter para evitar o refluxo dos aros e cubra imediatamente o pulmão com tecido de laboratório, papel e gelo. Deixe o gel aerossol se estabelecer por alguns minutos. Remova o papel de tecido, a seringa de gelo e o cateter.

Em seguida, corte a traqueia e remova o pulmão, o coração e o timo da cavidade torácica. Lave os órgãos preparados em uma placa com PBS. Em seguida, separe o coração, o timo e a traqueia remanescente do pulmão e descarte-os.

Coloque o pulmão no tubo contendo os dois mililitros restantes de meio e incube à temperatura ambiente por 45 minutos. Ajuste a incubação para garantir um bloqueio eficiente dos receptores Fc das células fagocíticas antes do procedimento de marcação. Transfira o pulmão do meio para uma placa contendo sete mililitros de um micrograma por mililitro de anticorpo anti-CD1632 e 100 microlitros de DNAs em DMEM, usando dois pares de pinças, desintegrando completamente o tecido pulmonar ao puxá-lo para separar.

Em seguida, incube por 10 minutos à temperatura ambiente em um agitador ajustado a 200 RPM, se desejado. A suspensão celular pode então ser armazenada a quatro graus Celsius até o próximo passo. Pipete a suspensão celular através de uma série de malhas de náilon.

Primeiro, despeje a suspensão através de um filtro de 100 microns colocado sobre um tubo de 50 mililitros. Se estiver reunindo amostras, passe as suspensões celulares de camundongos do mesmo grupo pelo mesmo filtro. Se o filtro entupir, substitua-o por um novo.

Repita este processo com um filtro de malha de 70 mícrons. Tenha o cuidado de lavar bem cada malha, bem como os tubos e as placas, com DMEM para minimizar a perda de células e maximizar o rendimento. Em seguida, aspire a suspensão através de uma malha de 48 mícrons esticada sobre um anel de plástico ou vidro, conforme mostrado aqui.

Colete o fluxo em uma placa de Petri. Em seguida, repita este processo com uma peneira de 30 micrômetros. Dependendo do volume, transfira o filtrado para um ou mais tubos de 50 mililitros e centrifugue por 15 minutos a 160 ×g a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de tampão de lise de eritrócitos. Em seguida, interrompa rapidamente a lise pela adição de 13 mililitros de meio DMEM. Transfira a solução para um tubo de 15 mililitros e centrifugue por 12 minutos a 160 ×g e quatro graus Celsius.

Resuspenda as células em três mililitros de um coquetel de anticorpos primários contendo anticorpos contra CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD1632 e CD45. Incube as células por 10 minutos no escuro a quatro graus Celsius ou sobre gelo. Após a incubação, lave as células preenchendo o tubo com DMEM e centrifugue por 12 minutos a 160 × g e quatro graus Celsius.

Re-suspenda as células em um mililitro de DMEM e pré-filtre através de um filtro de 50 mícrons em um tubo para classificação celular. Conte as células para obter o número total de células na suspensão pulmonar. Utilize um bico de 100 micrômetros para a fonte de células de um EC2 imediatamente antes da fonte.

Agite a suspensão celular por vórtice com o fluido de envolvimento. A pressão do fluido e os comprimentos de onda de emissão e detecção do laser dependem do instrumento utilizado para a classificação celular por citometria de fluxo, bem como dos fluorocromos usados no procedimento de marcação com anticorpos. Primeiro, crie um gráfico de dispersão lateral versus fluorescência e selecione todas as células com alta área de dispersão lateral que sejam negativas para os fluorocromos utilizados na marcação.

Em seguida, gere gráficos de área de dispersão lateral versus área de dispersão frontal e altura de dispersão frontal versus área de dispersão frontal e altura de dispersão lateral versus área de dispersão lateral, e delimite a população para excluir quaisquer dupletes ou agregados celulares, coletando-os em um tubo contendo DMEM. Ao utilizar suspensões celulares pulmonares isoladas de camundongos saudáveis, a porta EC2 geralmente representará cerca de 42 ± 10% de todos os eventos. Para coletar as células classificadas, centrifugue por 20 minutos a 280 × g e 4 °C.

Re-suspenda as células epiteliais alveolares do tipo dois ou a EC2 em meio de cultura ou tampão, conforme necessário para análises subsequentes. As células epiteliais alveolares do tipo dois de camundongo primárias foram isoladas por seleção negativa por citometria de fluxo conforme descrito neste vídeo; a análise das células classificadas é mostrada aqui. Como indicado.

A pureza das células isoladas é aproximadamente 92 mais ou menos 5% Ciis spins de AEC2 classificadas foram coradas para a proteína C do surfactante. Uma imagem de contraste de fase é mostrada à esquerda e a imunofluorescência é mostrada à direita. Encontrou-se que quase 100% das células eram positivas para a proteína C do surfactante, confirmando assim o isolamento bem-sucedido de uma população pura. Para avaliar os efeitos da infecção in vivo pelo vírus influenza A, AEC2 foram isolados de camundongos C57BL/6 que receberam, por via intranasal, solução salina tamponada com fosfato ou vírus influenza A PR8 (A/34) um, dois ou três dias antes.

Esses gráficos mostram suspensões de células pulmonares de camundongos C57 Black Six machos não infectados e infectados há três dias, corados para classificação devido à recrutamento de células imunes para o pulmão infectado. A proporção de células negativas para fluorescência e com área de dispersão lateral alta é substancialmente reduzida na suspensão celular preparada a partir dos camundongos infectados há três dias em comparação com os não infectados. A expressão da proteína nuclear do vírus da influenza A em células C2 classificadas foi analisada por meio de marcação intracelular com um anticorpo específico para a proteína nuclear.

O histograma mostra que um C dois isolado de camundongos infectados in vivo produz um sinal de fluorescência específico após coloração intracelular para a proteína nucleocapsídeo do vírus da influenza A. A tabela mostra a intensidade média de fluorescência da coloração da proteína nuclear, ou seja, a intensidade do sinal produzido pela coloração intracelular da proteína nuclear de um EC2 isolado de camundongos infectados com o vírus da influenza. A infecção viral aumenta com a duração da infecção viral para demonstrar a viabilidade de um EC2 isolado de camundongos saudáveis e testar sua suscetibilidade à infecção pelo vírus da influenza A.

Influenza, a expressão da proteína nuclear do vírus também foi analisada em células isoladas infectadas ex vivo, conforme mostrado aqui. Uma proporção substancial de EC2 expressa a proteína nuclear viral seis horas após a infecção. Esses dados são resumidos aqui.

A porcentagem de uma EC2 positiva para a coloração intracelular da proteína nuclear viral depende da dose viral utilizada para o experimento de infecção ex vivo. Esses resultados mostram que o neurônio primário isolado, uma EC2, é viável e suscetível à infecção e replicação viral, avaliada pela expressão da proteína viral observada. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar de realizar cuidadosamente todas as etapas de digestão e desintegração do tecido.

Além disso, é muito importante lembrar de realizar rigorosamente o porteamento nas células negativas para fluorescência e na região de alta granularidade lateral. Ao realizar a separação seguindo este procedimento, outros métodos, como estudos moleculares e funcionais, podem ser realizados para determinar o papel do tipo dois das células da terceira porção do pulmão no contexto de infecções virais e doenças pulmonares autoimunes.