Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

O objetivo geral deste procedimento é gerar células apresentadoras de antígeno artificiais baseadas em CD1D ou AAPC para a expansão de células NKT. Isso é realizado primeiramente adicionando proteínas para funcionalizar as microesferas magnéticas. Na segunda etapa, a população inicial de células NKT proveniente do sangue periférico é enriquecida.

Em seguida, os linfócitos T enriquecidos são cultivados em co-cultura com as A APC. Na etapa final, o fenótipo e a função da população celular A APC são avaliados. Por fim, a pureza dos subconjuntos de linfócitos T expandidos pode ser determinada por análise citométrica de fluxo. A principal vantagem das APCs em relação aos métodos atuais que utilizam células dendríticas é que as células dendríticas podem apresentar alta variabilidade entre doadores.

As APCs fornecem um método padronizado, reproduzível e pronto para uso para a expansão de células T NK. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando eu trabalhava com o Dr. Schneck e Oaky na Johns Hopkins. Eles foram pioneiros no campo do uso de complexos artificiais de apresentação de antígenos para a expansão de subpopulações clássicas de células T CD8.

Quem demonstrará o procedimento será o Dr. James East, pesquisador pós-doutorando, e o filho da Dra. Wendy, um pesquisador associado do meu laboratório. Comece transferindo um mililitro de esferas Dyna Bead M-450 com revestimento epóxi para um frasco de vidro borossilicato transparente com rosca de cinco mililitros. Em seguida, lave as esferas com três mililitros de tampão Bore 8 estéril em um tubo microcentrífuga separado de 1,5 mililitro.

Adicione 100 microgramas do dímero IG CD1D humano e 20 microgramas das moléculas coestimuladoras desejadas a um mililitro de PBS livre de cálcio e magnésio. Em seguida, coloque o frasco de vidro com as esferas sobre um ímã e aspire o tampão borato. Então, adicione a mistura proteica ao frasco de vidro e recoloque a tampa.

Misture imediatamente a solução invertendo o frasco, depois cubra a tampa com parafina e coloque-o em um rotador durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Coloque o frasco de vidro novamente no ímã e remova cuidadosamente a mistura proteica, evitando as microesferas. Lave as microesferas três vezes adicionando três mililitros de tampão de lavagem das microesferas e incubando-as no rotador a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Para confirmar que as proteínas estão carregadas de forma estável nas microesferas, marque uma alíquota das microesferas com anticorpos e analise-as por citometria de fluxo. Agora, transfira cinco vezes 10 à sétima microesferas para um pequeno frasco de vidro de 1,5 mililitro e lave as microesferas com um mililitro de PBS estéril. Em seguida, 48 a 72 horas antes do uso.

Carregue as esferas lavadas com antígeno em um mililitro de PBS estéril enquanto as esferas estão sendo carregadas com antígeno. Colete os PBMC diluindo primeiro o sangue do doador heparinizado com um volume igual de PBS à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 15 mililitros de PHI à temperatura ambiente, transfira para tubos cónicos de 50 mililitros e sobreponha lentamente 25 mililitros da mistura de sangue diluído sobre o PHI.

Em seguida, após centrifugar as amostras por 30 minutos a 700 ×g e temperatura ambiente com a frenagem desativada, use uma pipeta de Pasteur para transferir cuidadosamente a interface dos linfócitos para um novo tubo cônico de 50 mililitros. A seguir, lave os linfócitos com 50 mililitros de PBS, descartando o sobrenadante e combinando os tubos de um único doador em um único tubo.

Após lavar os PBMC novamente com 20 mililitros de PBS, conte as células e, em seguida, reconstitua-as em uma concentração de cinco vezes 10 à sétima células por mililitro em tampão max. Para isolar a fração de células T, incube 100 microlitros da solução de enriquecimento de células T PAN do kit de enriquecimento de células T humano EP com dois mililitros de PBMC por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, incube a solução com 100 microlitros de microesferas magnéticas à temperatura ambiente por mais 10 minutos.

Complete o volume final do solvente até 2,5 mililitros e, em seguida, coloque o tubo no ímã. Após cinco minutos, despeje rapidamente a fração positiva de CD3 em um tubo cônico de 15 mililitros. Agora, lave as células com cinco mililitros de tampão Max frio e conte as células viáveis.

Retire uma alíquota para coloração de fatores a fim de selecionar primeiro as células positivas para CD161. Re-suspenda os linfócitos T enriquecidos em 980 microlitros de tampão Max gelado e, em seguida, incube as células com 10 microgramas de anticorpo monoclonal anti-CD161 por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a lavagem das células, reconstitua o pellet em 800 microlitros de tampão Max e 200 microlitros de microesferas de IgG anti-US.

Incube esta solução a quatro graus Celsius por mais 10 minutos. Enquanto as células estão em incubação com os microesferas, adicione três mililitros de tampão max para equilibrar uma coluna LS. Após lavar esta fração celular, pipete lentamente as células em três mililitros de tampão max para dentro da coluna.

Agora, lave a coluna três vezes com três mililitros de tampão max fresco. Em seguida, adicione mais três mililitros de tampão max fresco à coluna e transfira a coluna para um tubo cônico de 15 mililitros. Elua as células positivas para CD161 e positivas para CD3 purificadas e, depois, conte a fração enriquecida em células NKT.

Inicie este passo com o cultivo conjunto de 10 elevado à sexta potência de células T CD161 positivas CD3 positivas enriquecidas e 10 elevado à sexta potência de APC em 16 mililitros de meio completo em placa. Adicione 160 microlitros por poço do co-cultivo a uma placa de poliestireno tratada para cultura de tecidos, com fundo redondo e tampa de baixa evaporação, no dia 12 a 14, colha e conte as células. Analise as populações por meio de citometria de fluxo, depois replante e realize novo co-cultivo.

As células T NKT expandidas, conforme acabou de ser demonstrado, congelam as células T NKT adicionais após a segunda rodada de expansão. Para testar a funcionalidade das células APC, faça primeiro um co-cultivo de cinco vezes 10 à quarta potência de células T NKT por poço com cinco vezes 10 à quinta potência de APC em um volume final de 200 microlitros de meio completo em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Após 24 a 48 horas, colete o sobrenadante do cultivo celular para análise por ELISA. Esta primeira figura demonstra que as proteínas CD1D-Ig estão estavelmente imobilizadas na superfície das microesferas magnéticas, conforme mostrado aqui.

Os anticorpos CD1D Ig e anti-CD28 são ambos expressos na superfície das microesferas magnéticas, conforme demonstrado neste gráfico. O hibridoma de células NK T de camundongo V alfa 14 positivo DN3A2-D3 foi cultivado em co-cultura com meio contendo antígeno alfa-galactosilceramida solúvel não carregado em APCs, ou com APCs carregadas com alfa-gal. Os sobrenadantes do cultivo foram então coletados e a produção de IL-2 foi medida por ELISA, fornecendo um método simples para testar cada lote de células apresentadoras de antígeno. Neste experimento, células T periféricas do sangue humano CD161 positivas e CD3 positivas foram enriquecidas por separação com microesferas magnéticas.

As células foram então estimuladas uma vez por semana durante 14 dias com A APC carregada com alfa galera e analisadas quanto à expressão de V alfa 24 e V beta 11. Importante ressaltar que, mesmo com uma população inicial relativamente baixa de células NKT de 0,03%, foi possível expandir as células para cerca de 67% de uma população positiva para V alfa 24 e positiva para V beta 11. Neste caso, células C um R CD 1D foram incubadas com células NKT nas proporções indicadas na presença ou ausência do antígeno alfa Gal SER em placas de 96 poços, em formato U, durante 20 a 24 horas.

A lise celular mediada por células NKT da linhagem de linfoma de células B foi então avaliada por um ensaio de liberação de cromo. Células NKT expandidas em PC foram capazes de lisar esta linhagem de células linfomatosas. Na presença ou ausência de alfa-galactosilceramida, as células NKT foram expandidas a partir dos PBMCs de voluntários saudáveis e de pacientes com câncer, e carregadas com alfa-galactosilceramida.

Com a APC, foi possível expandir as populações de células NKT de ambos os grupos. Ao utilizar uma população inicial de 2 milhões de células T CD161 positivas e CD3 positivas, pode-se obter mais de 10⁷ células após duas rodadas de expansão. As células NKT expandidas podem ser usadas em estudos funcionais, como demonstrado aqui.

As células NKT expandidas ex vivo permanecem responsivas à estimulação com Alpha GAL e nossos potentes produtores de IL-17A, TNF-alfa e interferon-gama. Deve-se observar que, se a população inicial de enriquecimento de linfócitos T for baixa e o segundo passo de enriquecimento com CD161 não puder ser realizado, a expansão mediada por A APC pode não produzir os resultados esperados. No entanto, se a porcentagem de células NKT circulantes for superior a 0,1%, uma expansão significativa de células NKT invariantes ainda deverá ser obtida.

Coletivamente, esses dados demonstram que o A A PC baseado em CD 1D pode ser usado para expandir e estimular efetivamente linfócitos T NK humanos primários seguindo este procedimento. Outros métodos, como PCR em tempo real, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais são a cinética da ativação dos linfócitos T NK após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de hepatologia explorarem o papel das células T NK na doença hepática gordurosa.