Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em Drosophila As larvas

O objetivo deste procedimento é analisar funções cerebrais superiores. Em um modelo simples, larvas de DFA por meio da apetência, aprendizado olfativo associativo. Isso é realizado primeiramente coletando 30 larvas alimentadas do terceiro estágio a partir de um frasco de alimento.

Em seguida, as larvas são treinadas por cinco minutos em uma placa de Petri com frutose como recompensa e um recipiente de odor em cada lado contendo um octanol como estímulo olfativo. Então, uma segunda fase de treinamento de cinco minutos é realizada em uma placa sem a recompensa de frutose e com recipientes de odor em cada lado contendo acetato de amila. Após três repetições das duas fases de treinamento, as larvas são expostas a recipientes de odor em lados opostos para um teste de cinco minutos sem recompensa.

Por fim, a preferência relativa de odor de um octal em comparação ao acetato de Amal indica que larvas de drosófila podem formar uma associação entre estímulos olfativos e recompensa de açúcar, e isso pode ser utilizado para estudar aprendizado associativo em um sistema geneticamente maleável. Este método, em combinação com interferência genética da função neural, pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da aprendizagem e da memória, como quais são os neurônios que sinalizam recompensa, ou quais são os neurônios necessários ou suficientes para a aquisição ou a recuperação de uma memória repetitiva? A demonstração do procedimento será feita por anti a postop.

Um estudante de doutorado do meu laboratório primeiramente prepare placas de Petri com aros a 2,5% sem frutose. Para preparar as placas com frutose, adicione a frutose aos aros dissolvidos e, em seguida, despeje a mistura na placa. Em seguida, rotule cada uma dessas placas com um símbolo diferente que cegará o experimentador.

O prato contendo frutose é a recompensa condicionada, e o prato simples é a ausência de recompensa. Para os estímulos condicionados, prepare um total de três recipientes personalizados de teflon para odores com 10 microlitros de octanol puro. As tampas possuem pequenos orifícios para permitir a evaporação do odor.

Em segundo lugar, prepare outros três recipientes de odor com 10 microlitros de acetato de amila diluído na proporção de um para 50 em óleo de parafina. Essa diluição é tão atrativa quanto os 10 microlitros de um octanal puro; comece coletando 30, alimentando, sem se dispersar. Em terceiro lugar, a partir de um frasco de alimento.

Este protocolo pode ser realizado a qualquer momento do dia. É independente dos ritmos circadianos. Transfira a lava para uma placa de Petri que contenha algumas gotas de água da torneira e mova-a cuidadosamente para frente e para trás com um pincel.

Em seguida, transfira a larva para um segundo recipiente de Petri que também contenha algumas gotas de água da torneira. Inspecione as larvas quanto à presença de pasta alimentar nas paredes de seus corpos. Agora, coloque o recipiente de Petri na montagem experimental para treinar as larvas a associar odores a uma determinada fonte de açúcar.

Coloque um recipiente com odor no lado esquerdo e no lado direito de um dos dois tipos de placa utilizados para os estímulos. Aqui se usa um odor octal, mas a escolha é arbitrária, já que o experimentador está cego quanto à recompensa. Em seguida, posicione o grupo de larvas thi no centro da placa.

Feche a tampa e aguarde cinco minutos enquanto os animais são expostos aos estímulos. Certifique-se de que as larvas consigam superar a tensão superficial da gota de água para que não fiquem presas e possam explorar livremente. Coloque um novo recipiente com acetato de amila em uma placa de Petri nova.

Após cinco minutos, use uma escova úmida para transferir as larvas para um tipo oposto de placa com estímulos opostos localizados em seus lados esquerdo e direito. Assim, o odor aqui é acetato de amila. Uma vez transferidas as larvas, feche a tampa e permita que os animais explorem por cinco minutos.

Quando esse tempo expirar, a primeira rodada de treinamento terá sido concluída. Realize mais duas rodadas de treinamento da mesma maneira que a primeira. Transfira os animais com uma escova úmida e exponha-os a cada combinação de estímulos e recompensas três vezes no total.

Para o local do teste experimental, coloque recipientes com odor fresco, um de cada estímulo em lados opostos de uma placa de Petri com ágar apenas não revestido. Transfira os animais treinados para o centro da placa. Feche a tampa e aguarde cinco minutos.

Após cinco minutos, utilize um molde sob a placa que defina claramente três zonas: esquerda, direita e central; conte o número de larvas em cada zona. A zona central corresponde a uma pontuação de ausência de preferência e torna a análise mais rigorosa e menos suscetível a vieses. Por fim, para concluir o experimento, selecione 30 novas larvas de terceiro estágio em fase de alimentação e repita o treinamento e o teste com a combinação oposta de recompensa e estímulos.

Continue utilizando os mesmos recipientes de odor. Vários testes controle são necessários para determinar se animais transgênicos possuem processamento normal de odorantes para os estímulos de recompensa. O teste de preferência por odor ingênua começa com a coleta e lavagem de 30 larvas, conforme realizado para o treinamento e os testes.

Em seguida, coloque as larvas em uma placa de Petri agro rose com apenas um frasco de estímulo em um dos lados. Feche a tampa e aguarde cinco minutos. Posteriormente, utilizando o molde, conte o número de larvas no lado próximo, no meio e no lado oposto da placa em relação ao estímulo.

Realize este teste para cada estímulo utilizado no experimento para verificar a preferência ingênua por açúcar. Prepare placas de Petri pela metade cortando ao meio o ágar de uma placa e preenchendo o espaço vazio com ágar fundido do outro tipo. Tenha cuidado para que ambas as metades tenham o mesmo volume e não formem uma borda definida.

Isso pode exigir prática com o meio preparado em recipiente dividido ao meio e mantido em temperatura ambiente, colocado sobre 30 larvas estrela, limpas e sem alimento. Coloque a terceira parte das larvas no centro do recipiente. Feche a tampa e aguarde cinco minutos.

Posteriormente, utilizando o molde, conte o número de larvas em cada lado e conte aquelas no centro. O procedimento descrito foi usado para treinar e testar larvas trenchgênicas. Usando os estímulos exemplares, os dados foram registrados como o número de larvas em diferentes regiões das placas de Petri.

Após cinco minutos fora dessa preferência de dados, os índices foram calculados e os índices de desempenho foram derivados dos grupos treinados reciprocamente. Como as larvas testadas eram transgênicas, foi oferecida também uma escolha entre um recipiente com odor preenchido e ar, bem como uma escolha entre aromas puros e aromas mais açúcar. Um exame dos índices calculados em um gráfico de caixa revelou que os animais foram capazes de aprender a distinguir um odor octal do acetato de ML usando aromas com frutose como reforço de apetite.

Os animais reconheceram ambos os estímulos como atrativos e demonstraram uma preferência ingênua pelo aroma de frutose em vez do aero. Esse paradigma experimental tem sido usado com sucesso com uma grande variedade de estímulos olfativos e visuais, bem como com uma ampla gama de estímulos recompensadores e aversivos. Esse paradigma, combinado com as muitas manipulações genéticas poderosas disponíveis em drosophila, é particularmente útil para dissecar redes neurais, por exemplo, manipulando geneticamente conjuntos específicos de neurônios, definidos pelos padrões de expressão do gal four, podendo-se avaliar os papéis funcionais desses neurônios na aprendizagem relacionada ao apetite.

Após este procedimento, juntamente com a interferência genética da função neuronal, pode-se analisar as redes neurais do cérebro larval envolvidas na aprendizagem e na memória. Devido à simplicidade do cérebro larval, isso pode ser alcançado até o nível de célula única.