Name: O efeito sinérgico da luz visível e no Gentamicina Pseudomonas aeruginosa Microorganismos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Descubra o efeito sinérgico da luz visível e gentamicina contra Pseudomonas aeruginosa. Este método demonstra redução de 8 ordens de magnitude na viabilidade bacteriana, oferecendo nova estratégia para combater infecções resistentes.

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1. Cultura bacteriana <ol><li> P. Gram-negativo aeruginosa PAO1 estirpe foram cultivadas em Caldo de Luria (LB) a 37 ° C durante 18 horas. </li><li> A cultura de células foi então centrifugado a 7.500 rpm (rotações por minuto) durante 5 min e o sobrenadante foi removido. </li><li> As bactérias foram ressuspensas em 10% de LB e re-cultivadas durante mais 2 horas para permitir que a cultura de reentrar fase estacionária. </li><li> A suspensão de bactérias foi então dividida em dois grupos: no primeiro grupo (2 tubos) foram adicionados nenhum antibiótico, no segundo grupo a que adicionado o antibiótico gentamicina (50 ug / ml). </li></ol> 2. Determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) <ol><li> Para determinar a viabilidade das células 20 ul amostras foram tomadas a partir do experimento de aproximadamente cada 2 horas dentro do período de tempo de 24 horas. Diluição em série das amostras foram feitas e semeadas em placas de agar LB e incubadas durante a noite a 37 ° C. </li><li> Para cada tratamento, os UFCs por plate foi determinado e foi feita uma comparação entre os períodos de tempo e vários tratamentos. A redução log de CFU foi calculada como descrito na equação. (1): Log redução = Logu-LogC [UFC / ml] Quando L é o valor das unidades formadoras de colónias em cada ponto temporal; UFC é a unidade de formação de colónias, enquanto as unidades de UFC / ml igual a: CFU / ml = (número de colónias factor de diluição x) / (volume do inoculado) E C é o UFC encontradas na amostra de controlo no tempo de início. Note-se que U designa a formação de colónias fator de medição instantânea. </li><li> O factor de diluição é o número de diluições enquanto que em cada uma delas na concentração de bactérias foi reduzido por um factor de 10. O volume inoculado foi sempre de 200 micro litros e está relacionado com o tamanho do nosso tubo de ensaio. </li></ol> Assim, para resumir o ponto de vista da concentração, o antibiótico gentamicina numa concentração foi de 50 ug / ml. Em relação às bactérias, até ao final doo processo tivemos total oito diluições. Cada diluição foi por um factor de 10 e foi realizado em tubos de 200 ul. O ponto de partida foi de 20 ul das amostras adicionados ao tubo 200 ul (e, portanto, a concentração inicial foi 20/200C 0 = 0.1C0 C com 0 sendo a concentração inicial em 20 ul das amostras) e a concentração final foi reduzido de 8 ordens de grandeza devido às oito diluições. 3. Iluminação <ol><li> CW laser Nd: YAG (comprimento de onda de 532 nm e potência óptica média de 200 mW) foi dividido em dois caminhos ópticos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe. O diâmetro do feixe laser foi de cerca de 10 mm. O tempo de exposição foi de 24 horas. </li><li> Q-switched pulsado Nd: YAG (comprimento de onda de 532 nm, potência média de 300 mW e pico de potência óptica de 2,5 MW) também foi dividido em dois caminhos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe. O diâmetro do ponto era de 6 mm. A largura do pulso do laser Q-switched foi 6 nseg e a taxa de repetição foi de 15Hz. Odensidade de potência média foi de 106 mW / cm 2 ea densidade de potência de pico foi de 8,83 kW / mm 2. O tempo de exposição foi de 24 horas. </li></ol> Note-se que a suspensão bacteriana foi agitada durante a irradiação e que foi mantido sob condições de cultura adequadas para o crescimento bacteriano (em todos os tubos não era Caldo Luria meio para permitir que as bactérias para crescer).

<ol><li>Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxic+Effect+of+Visible+Light+on+Porphyromonas+gingivalis+and+Fusobacterium+nucleatum%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study.</a> Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).</li>
<li>Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+470-nm+light+kills+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro.</a> Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).</li>
<li>Guffey, J. S., Wilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bactericidal+effects+of+405-nm+and+470-nm%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm.</a> Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Staphylococcus+aureus+strains+to+broadband+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light.</a> Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+Mechanism+for+visible+light+induced+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A possible Mechanism for visible light induced wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-induced+killing+of+bacteria+as+a+function+of+wavelength%3A+Implication+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).</li>
<li>Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Visible+Light+Phototoxicity+on+Porphyromonas+gingiwalis+and+Fusobacferium+nucleaturn%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn.</a> Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).</li>
<li>Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+630-%2C+660-%2C+810-%2C+and+905-nm+laser+irradiation+delivering+radiant+exposure+of+1-50+J%2Fcm2+on+three+species+of+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Laser+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro.</a> J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).</li>
<li>Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Photoresponses+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+to+514%2C+532%2C+and+633+nm+Low+Level+Lasers+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro.</a> Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406, 952-964 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R., Demidova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+low+level+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of low level light therapy.</a> Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).</li>
<li>Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+disruption+of+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser disruption of biofilm.</a> Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).</li>
<li>Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+light+enhancement+of+susceptibility+of+bacteria+to+gentamycin+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic.</a> Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A fototerapia tem sido um campo de pesquisa multidisciplinar avançado nos últimos anos, surgindo como uma abordagem promissora para o tratamento de inúmeras doenças. Neste contexto, o uso de luz na gama do visível tem sido extensivamente estudada. Por exemplo, verificou-se que as feridas infectadas podem ser curadas de forma mais eficaz por expondo-os a luz intensa visível para fins de esterilização. O mecanismo de ação para esta abordagem foi provado ser através da indução de radicais de oxigênio induzido pela luz (ROS...

<table><tbody><tr><td>Caldo Lauria</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>Difco</td><td>231710</td><td></td></tr></tbody></table>

o efeito sinérgico da luz visível e no gentamicina<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; microorganismos

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

Recentemente houve várias publicações sobre o efeito bactericida da luz visível, a maioria deles alegando que parte azul do espectro (400 nm-500 nm) é responsável pela morte de vários patógenos 1-5. O efeito fototóxico de luz azul foi sugerida para ser uma sequência de espécies reactivas de oxigénio induzido pela luz (ROS) por formação bacterianas endógenas fotossensibilizadores que absorvem a luz na maior parte da região azul 4,6,7. Há também relatos de efeito biocida de vermelho e perto infra vermelho 8, bem como luz verde 9. No presente estudo, foi desenvolvido um método que nos permitiu caracterizar o efeito da alta de energia verde (comprimento de onda de 532 nm) luz contínua (CW) e pulsou Q-switched (QS) em Pseudomonas aeruginosa. Usando este método, também foi estudado o efeito da luz verde combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina) sobre a viabilidade das bactérias. P aeruginosa é alternadaommon noscomial patógeno oportunista causando várias doenças. A tensão é bastante resistente a vários antibióticos e contém muitos previram tipo Mex AcrB / multidroga RND sistemas de efluxo 10. O método utilizado fase estacionária bactérias livres-vivas gram-negativas (estirpe de P. aeruginosa PAO1), cultivada em Caldo de Luria (LB) exposto a Q comutado e / ou CW lasers com e sem a adição do antibiótico gentamicina. A viabilidade celular foi determinada em diferentes pontos no tempo. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com laser por si só, não reduziu a viabilidade das células em comparação com o controlo não tratado e que o tratamento com gentamicina sozinho resultou apenas em uma redução de 0,5 log na contagem viável de P. aeruginosa. O laser de tratamento combinado e gentamicina, no entanto, resultou num efeito sinérgico e a viabilidade de P. aeruginosa foi reduzido em 8 de log. O método proposto pode ainda ser impletadas por meio do desenvolvimento de cateter como dispositivo capaz de injectar uma solução de antibiótico no órgão infectada simultaneamente iluminar a área com luz.

A configuração da base de laser encontra-se esquematicamente apresentada na Figura 1. A primeira condição experimental utilizado CW um laser Nd: YAG tendo comprimento de onda de 532 nm (a segunda harmónica do Nd: YAG) e potência óptica média de 200 mW. Este feixe foi dividido em dois caminhos ópticos usando óptica 50% / 50% divisor de feixe de tal forma que cada raio dividido tinha potência de 100 mW. O diâmetro do feixe laser foi de cerca de 10 mm e, assim, a densidade de potência é de cerca de 100 mW ...

Mostra-se que um dispositivo biomédicas desenvolvida que envolve o tratamento a laser visível contínua ou pulsada que é combinado com o tratamento com antibióticos (gentamicina), resulta num efeito sinérgico significativo estatisticamente levando a uma redução da viabilidade da<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; PAO1, por 8 log é comparado ao tratamento com antibióticos só.

O efeito sinérgico da luz visível e no Gentamicina<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Microorganismos

Recentemente, houve diversas publicações sobre o efeito bactericida da luz visível, a maioria delas alegando que a parte azul do espectro (400 nm-500 nm)...

O objetivo geral do procedimento a seguir é validar experimentalmente o aumento da eficácia da gentamicina pela luz visível sobre Pseudomona aerogen em solução. Isso é realizado primeiramente cultivando a cultura bacteriana experimental. Na segunda etapa, as bactérias são iluminadas na presença ou ausência de tratamento com antibiótico.Por fim, as amostras são coletadas do cultivo ao longo de um período de 24 horas, e então as unidades formadoras de colônia dentro do cultivo celular em cada ponto temporal são quantificadas. Em última análise, pode-se avaliar o efeito da iluminação sobre a suscetibilidade bacteriana à eliminação pelo tratamento com antibióticos. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia in vivo de infecções, já que a iluminação aumenta a eficácia do tratamento com antibióticos.A demonstração do procedimento será realizada por Anna Resnick, aluna de mestrado no meu laboratório. Comece cultivando a cultura bacteriana de interesse no meio de crescimento apropriado. Aqui, a cepa gram-negativa P. aeruginosa, PAO1, está sendo cultivada em caldo Luria a 37 graus Celsius por dezoito horas.Em seguida, centrifugue as células por cinco minutos a aproximadamente 3.145 ×g e temperatura ambiente. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda as bactérias em caldo Lauria a 10%. Reincube as células por mais duas horas em caldo Lauria a 37 graus Celsius para permitir que a cultura reentre na fase estacionária. Em seguida, divida a suspensão bacteriana em dois grupos, adicionando gentamicina a um dos grupos.Agora, coloque cada uma das culturas sobre agitadores magnéticos e ligue-os. Em seguida, divida um laser de onda contínua nd YAG, ou alternativamente um laser pulsado nd YAG com comutação Q, em dois caminhos ópticos para iluminar as culturas assim que a iluminação for iniciada. Comece a retirar amostras de 20 microlitros dos grupos controle e tratados com antibiótico aproximadamente a cada duas horas durante 24 horas.No dia seguinte, dilua seriamente as amostras obtidas. Por exemplo, neste experimento, as bactérias foram diluídas oito vezes por um fator de 10 em volumes de inoculação de 200 microlitros. Em seguida, plaque a diluição em caldo luria, em placas de ágar, e incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius na manhã seguinte.Determine o número de unidades formadoras de colônia ou UFC por placa para cada tratamento e, em seguida, calcule a redução logarítmica em UFC conforme ilustrado aqui. Observe que você denota os valores de unidades formadoras de colônia em cada ponto temporal exatamente no momento da medição. UFC denota a unidade formadora de colônia e C denota a UFC encontrada na amostra controle no tempo inicial.Além disso, as unidades de UFC por mililitro equivalem ao número de colônias multiplicado pelo fator de diluição dividido pelo volume de inoculação. Aqui é apresentado um esquema da configuração baseada em laser, na qual um laser de onda contínua NDA ou um laser com comutação Q é dividido em dois caminhos usando um divisor óptico de feixe 50/50. Ambas as amostras são posicionadas sobre um agitador.Esta imagem mostra a configuração experimental na qual o laser é dividido entre dois tubos para eliminar ambos os tubos em condições idênticas. Uma cultura é tratada com antibióticos e a outra, a controle, não é tratada. Em seguida, as bactérias são expostas aos lasers por 24 horas.Este gráfico mostra a iluminação efetiva sobre o crescimento de p aerogen com luz laser de onda contínua ou laser com chave Q, respectivamente, na presença ou ausência de tratamento com antibiótico nas amostras de controle, sem exposição à luz. Não houve redução na viabilidade celular, independentemente de as culturas terem recebido antibióticos, sugerindo que as bactérias são resistentes à gentamicina, nem o tratamento com o laser isolado afetou o crescimento celular. No entanto, nas culturas tratadas com o laser e com o antibiótico, a viabilidade bacteriana foi reduzida em várias ordens de magnitude.O efeito mais acentuado foi medido após 24 horas, período em que a combinação de laser de onda contínua ou com chaveamento Q reduziu a viabilidade das células bacterianas em oito ordens de magnitude, em comparação com os grupos-controle tratados apenas com antibiótico ou apenas com luz. Esses dados sugerem uma solução para o tratamento de bactérias resistentes a antibióticos. Assim, os pontos nesta figura representam os pontos de espalhamento de luz para facilitar a administração dual de iluminação a laser difusa e tratamento com antibiótico por meio de um cateter inserido no tecido infectado por bactérias.Esta figura final do espectro de absorção em torno de 532 demonstra claramente que tanto a linhagem bacteriana p aerogen quanto o antibiótico gentamicina são transparentes nesse comprimento de onda, tornando esse comprimento de onda uma escolha viável para o tratamento combinado. A técnica apresentada abriu caminho para que pesquisadores na área de microbiologia e medicina explorem a eficácia dessa técnica, bem como em biofilmes e sistemas orgânicos. Não se esqueça de que trabalhar com micro-organismos pseudomona orgen pode ser extremamente perigoso, portanto, a técnica asséptica adequada e um ambiente e equipamentos esterilizados devem sempre ser utilizados ao realizar este procedimento.

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