Perfusão intravenosa de tinta Carbon Black Permite visualização dos vasos cerebrais

O objetivo geral deste procedimento é estudar a anatomia vascular cerebral de camundongos de maneira reprodutível. Primeiro, os vasos cerebrais são corados com látex colorido para comparação posterior com a coloração por tinta preta de carbono. Em seguida, as tintas pretas de carbono são misturadas e os animais são perfundidos com P-B-S-P-F-A e a mistura de tinta preta de carbono através do ventrículo esquerdo.

No passo final, o cérebro é coletado e são tiradas fotos para comparação e análise dos vasos cerebrais corados. Por fim, o software ImageJ é utilizado para analisar os pontos de anastomose entre as artérias cerebrais média e anterior. As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de doenças cerebrovasculares, particularmente o acidente vascular cerebral, pois pode ser usada para analisar a densidade vascular e a angiogênese.

Agora, este método pode fornecer informações sobre o sistema vascular do cérebro e também pode ser aplicado a outros sistemas, como na visualização de microvasos no coração, fígado ou rim. Após combinar a borracha de látex com tinta de negro de fumo em um tubo EP, aqueça a mistura a 37 graus Celsius em banho-maria. Use uma agulha de 23 a 25 gauge para coletar a borracha de látex aquecida em uma seringa de dois mililitros.

Em seguida, dissolva 12,5 miligramas de pó de papina hidrocloreto em um mililitro de solução salina normal estéril e, após a vórtex, recolha a solução resultante em uma seringa de insulina. A seguir, quebre a agulha de outra seringa de insulina estéril e coloque a agulha separada na extremidade de um tubo PE 10 com 20 centímetros de comprimento. Em seguida, conecte o tubo PE 10 à agulha da seringa de insulina contendo a solução de papina hidrocloreto.

Agora, preencha mais duas seringas de insulina com um mililitro de solução salina e leve todas as seringas, juntamente com os instrumentos de dissecação esterilizados, para a área cirúrgica antes da anestesia. Pese o camundongo, posicione-o em decúbito dorsal com anestesia contínua, fixe as patas e corte a pele sobre a veia femoral esquerda.

Agora localize a veia femoral e insira a ponta da agulha acoplada ao tubo PE 10. Em seguida, injete lentamente a solução de papina cloreto de hidrogênio a uma taxa de aproximadamente 100 microlitros por minuto e uma dose de 50 miligramas por quilograma de peso corporal. Após a injeção, abra a cavidade abdominal e, então, perfure o diafragma.

Em seguida, corte as costelas para expor o coração e prenda a aorta torácica descendente com pinça arterial. A seguir, faça um corte preciso sobre o átrio direito para drenar o sangue venoso. Então, injete dois mililitros de solução salina no ventrículo esquerdo.

A presença de ar nas soluções Profil ou na mistura de tinta combinada pode resultar em áreas vasculares do cérebro não coradas. Para garantir o sucesso, verifique com muita atenção se todas as suas seringas estão completamente livres de bolhas de ar. Agora, administre suavemente o conteúdo das seringas pré-cheias, uma após a outra, para a injeção manual do látex colorido ao longo de um período de 18 a 20 segundos e deixe o animal em repouso por cinco minutos.

Em seguida, após decapitar o animal, remova o osso do crânio e as meninges, tomando cuidado para não lesar a arquitetura do córtex ou dos vasos, e então retire cuidadosamente todo o cérebro. Coloque o cérebro em uma placa de cultura celular de 60 milímetros contendo de seis a oito mililitros de PFA a 4%, e então posicione uma régua sob a placa utilizando uma câmera acoplada ao microscópio cirúrgico. Tire fotos com uma ampliação de 25 x das superfícies dorsal e ventral do cérebro, com um ângulo de 90 graus entre o objetivo do microscópio e a placa de Petri.

Para quantificar a distância original, inicie o procedimento de coloração com tinta de fumo misturando duas alíquotas de 100 microlitros de tinta herts stemple farba ou CB um com duas alíquotas de 900 microlitros de tinta pelican scribal schwartz ou CB dois em dois tubos EP separados de 1,5 mililitro. Reúna as misturas de tinta em duas seringas de insulina separadas de um mililitro. Em seguida, tampe as seringas e coloque-as em um banho-maria a 37 graus Celsius, juntamente com outras duas seringas de insulina contendo um mililitro de solução salina cada.

Após tratar o camundongo conforme acabou de ser demonstrado, use pressão leve para injetar ambas as soluções de tinta de fuma preta no ventrículo esquerdo ao longo de 18 a 20 segundos por mililitro. Após remover o cérebro e tirar fotografias conforme acabou de ser demonstrado, coloque o cérebro em PFA 4% durante a noite, seguido por incubação em concentrações progressivamente crescentes de sacarose até que o cérebro flutuante submerja completamente. Inicie este passo induzindo isquemia cerebral focal transitória.

De acordo com um protocolo padrão de oclusão intraluminal da artéria cerebral média, ao final do período de reperfusão, corar a vasculatura com as tintas CB um e CB dois conforme acabou de ser demonstrado e, em seguida, corar todo o cérebro com solução de TTC 2% a 37 graus Celsius por cinco a 10 minutos. Para identificação do volume de infarto, a área infartada permanecerá branca, enquanto a área não isquêmica ficará vermelha. Coletar imagens conforme acabou de ser demonstrado para analisar a anatomia macroscópica dos vasos cerebrais, começando pela abertura de uma imagem da superfície corada do cérebro.

Com o software ImageJ, cérebros perfundidos com látex colorido podem apresentar graus variáveis de coloração dos vasos localizados na superfície ventral. Enquanto a perfusão de CB1 mais CB2 cora todos os vasos nas superfícies ventral e dorsal. Defina a escala em milímetros, marque os pontos anastomóticos entre a artéria cerebral anterior ou ACA e a artéria cerebral média ou ACM para criar uma linha imaginária conectando todos esses pontos anastomóticos.

Agora, meça a distância entre a linha anastomótica e a linha média a quatro e, em seguida, a seis milímetros da região frontal do polo cerebral. Após analisar três a quatro imagens por animal, calcule o valor médio. Compare os valores entre os diferentes grupos de animais para identificar a variação na anatomia cerebrovascular.

Em animais C57 black six J, a linha anastomótica entre a artéria cerebral anterior (ACA) e a artéria cerebral média (MCA) pode ser traçada mais próxima à linha média a quatro milímetros do que a seis milímetros, medidos caudalmente a partir do polo frontal, enquanto camundongos knockout para a lipoproteína APO E não apresentam diferença significativa neste aspecto. Em contraste, a linha anastomótica em camundongos SV129 encontra-se mais distante e mais paralela à linha média, tanto a quatro quanto a seis milímetros caudalmente a partir do polo frontal, para análise da anatomia vascular. Sob condições isquêmicas, identifique a borda da infarto como a margem tecidual com coloração vermelha e branca, que representa o tecido metabolicamente ativo e o tecido necrótico, respectivamente, e meça a distância dessa borda do infarto até a linha média a quatro milímetros e a seis milímetros caudalmente a partir do polo frontal do cérebro.

O protocolo descrito aqui supera as limitações técnicas da visualização convencional da vasculatura cerebral de roedores baseada em látex. Como mostra esta primeira imagem após a perfusão com látex colorido, apenas os grandes vasos na superfície ventral são corados, deixando toda a superfície dorsal não corada. Em contrapartida, a perfus inflammável com CB um mais CB dois resulta em preenchimento suficiente dos vasos pequenos e grandes de maneira igual.

A coloração é estável por sete dias sem qualquer alteração na qualidade. Utilizando o programa Image J, pode-se analisar a distância dos pontos anastomóticos entre a ACA e a ACM em relação à linha média, em todos os diferentes grupos de camundongos, que foram perfundidos com tintas para avaliar as diferenças na anatomia vascular regional. Embora a eliminação de um POE não afete a estrutura anatômica dos vasos cerebrais em camundongos C57 black six J, uma diferença significativa pode ser observada entre as linhagens C57 black six J e SV129.

Em modelos experimentais de acidente vascular cerebral em roedores, a coloração com TTC é amplamente utilizada para a visualização do volume de infarto. A coloração com CB um mais CCB dois também é aplicável em condições isquêmicas para observar alterações estruturais na vasculatura e demonstra alta estabilidade quando combinada com a coloração com TTC. Observe a visualização simultânea dos vasos cerebrais e do volume de infarto em cérebros isquêmicos induzidos por diferentes durações de isquemia cerebral e pontos de tempo de reperfusão.

A análise dos pontos anastomóticos entre a artéria cerebral anterior (a c) e a artéria cerebral média (MCA) após 45 ou 90 minutos de isquemia, combinada com períodos de reperfusão de um dia ou cinco dias, mostra, como esperado, que a diferença média entre a linha média e os pontos anastomóticos não apresentou diferença significativa entre os grupos. Além disso, a distância média estava na mesma faixa observada em animais não isquêmicos. No entanto, a distância da linha média até a borda da infarto difere significativamente entre os grupos, refletindo o aumento do volume de infarto com maiores graus de lesão por isquemia e reperfusão.

Essa técnica tem o potencial de abrir caminho para pesquisadores na área de acidente vascular cerebral experimental, a fim de explorar as terras vasculares no cérebro de camundongos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a anatomia do sistema vascular cerebral em camundongos, perfundindo o cérebro com tintas corantes ou nanquim, e de como analisar o tecido cerebral corado resultante com a ajuda do software Image J.