Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

O objetivo geral deste procedimento é identificar odorantes biologicamente eficazes em misturas complexas por meio de gravações no cérebro de abelhas operárias. Isso é realizado primeiro coletando misturas com efeito comportamental e, em segundo lugar, preparando o cromatógrafo a gás e os sistemas de gravação multicanal para o experimento. O terceiro passo é preparar e dissecar o cérebro da abelha operária para as gravações neurais no lobo antenal.

O experimento é então conduzido inserindo os eletrodos em um lóbulo antenal e medindo as respostas aos voláteis soprados por meio da análise da atividade neural em resposta a misturas complexas e seus constituintes individuais. Odorantes biologicamente ativos podem ser identificados por cromatografia gasosa. Assim, a principal vantagem desta técnica em relação a outras, como a G-C-E-A-G, é a sensibilidade dos neurônios do lobo antenal e a capacidade de caracterizar como os neurônios no cérebro respondem a voláteis florais específicos.

A demonstração visual deste método é fundamental, pois etapas combinadas de eletrofisiologia e análise química são difíceis de aprender devido à técnica de gravação da preparação eletrofisiológica e aos passos necessários para coletar os voláteis do espaço cabeça. Embora esta técnica possa fornecer informações sobre o processamento olfativo de abelhas operárias, ela também pode ser aplicada a outros sistemas, como vetores de doenças, por exemplo, mosquitos ou barbeiros, ou pragas agrícolas, como pulgões ou mariposas. Para este procedimento, prepare previamente um eletrodo de referência feito de fio de tungstênio em um micromanipulador em um segundo.

O micro manipulador possui um eletrodo multicanal, como um fio enrolado, tede ou eletrodo multicanal de silício, conectado a um pré-amplificador que tem um gás cromatográfico com saída em uma mesa BNC blindada. A saída do detector do GC é conectada ao amplificador e ao sistema de aquisição de dados de forma que os sinais neurais e do GC sejam sincronizados. Neste exemplo, o gás de arraste do GC é hélio e está em uma coluna GC DB cinco.

O CG utiliza uma entrada com divisão de fluxo com a temperatura ajustada a 200 graus Celsius e com a temperatura do detector de ionização de chama definida em 230 graus Celsius. Após o aquecimento das amostras no CG, o efluente da coluna é dividido igualmente entre o detector de ionização de chama e a antena B, utilizando um conector em Y de vidro. Neste exemplo, o CG é usado para liberar os voláteis coletados por absorção dinâmica das flores de Mimus Lewis eye, uma planta silvestre alpina nativa da Califórnia.

Alternativamente, em vez de usar o gc, compostos voláteis individuais ou misturas de compostos podem ser administrados por pulsos de ar. Lançados através de uma seringa de vidro separada contendo um pedaço de papel de filtro no qual os compostos foram depositados. Os pulsos de ar são desviados de uma corrente de ar constante utilizando uma válvula ativada por solenoide controlada por um computador.

Inicie os preparativos cortando cerca de um centímetro da extremidade de uma ponteira de pipeta de um mililitro. Coloque uma abelha no interior da ponteira e empurre-a suavemente em direção à extremidade oposta até que somente a cabeça fique exposta. Usando cera dental derretida, faça um molde ao redor da cabeça exposta.

A cera deve aderir aos olhos compostos para imobilizar completamente a cabeça, mas não deve entrar em contato com a antena, se necessário. Use pinos pequenos para imobilizar as antenas. Em seguida, faça uma incisão em forma de janela quadrada na cápsula cefálica usando uma lâmina afiada, como um microescalpelo.

Comece a cortar diretamente atrás da antena e ao lado de um dos olhos compostos. Corte uma linha reta entre os olhos. Em seguida, corte dorsalmente até que a cápsula cefálica se curve em direção ao tórax.

Continue o corte até a extremidade oposta da cápsula cefálica. Finalmente, corte de volta ao ponto inicial para completar o quadrado. Use pinça para remover a cutícula.

A cutícula adjacente à antena deve ser removida, caso contrário impedirá o eletrodo assim que o cérebro for exposto. Imediatamente, superperfunda o tecido com salina para insetos. Certifique-se de que os lobos antenais estejam bem expostos.

Em seguida, use cuidadosamente um par de pinças muito finas para remover a bainha perineural imediatamente acima dos lóbulos antenais. Tenha muito cuidado para não perfurar o cérebro da abelha com as pinças. A preparação da abelha está agora pronta para o registro eletrofisiológico.

Inicie fixando a abelha preparada em um grampo acoplado a uma base magnética. Mantenha-a superperfundida com salina para insetos fornecida a partir de um reservatório com um controlador de fluxo. Em seguida, insira o eletrodo de referência no tecido cerebral contralateral.

Em seguida, insira o eletrodo multicanal em um dos lóbulos antenais da abelha. Quando os eletrodos estiverem posicionados, aguarde de 30 a 60 minutos para que as gravações se estabilizem.

Neste período, prepare-se para detectar os picos extracelulares dos neurônios também por limiarização. Pode ser necessária a limiarização manual em alguns canais devido ao ruído nos canais de gravação. Em seguida, verifique se a rampa de temperatura da corrida de CG está correta.

Neste exemplo, a temperatura começa em 50 graus Celsius por quatro minutos e depois aumenta 10 graus por minuto até uma temperatura final de 220 graus Celsius, ou é mantida por seis minutos. Quando as formas de onda das unidades nos canais de gravação se tornam consistentes, considera-se que as gravações neurais estão estáveis. Uma vez estabilizadas, carregue a seringa com o odor do espaço aéreo floral e injete o odor no bocal de injeção do gc.

Em seguida, comece imediatamente a gravar os sinais dos eletrodos após a conclusão da corrida de CG. Deixe o preparo em repouso por cinco a 15 minutos. Depois, injete outra amostra na CG ou estime o preparo utilizando compostos voláteis individuais ou misturas de compostos.

Se em algum momento a atividade espontânea parar ou mudar repentinamente, verifique a infusão de solução salina e deixe o preparo descansar por 15 minutos. Caso a atividade não retorne ao nível anterior, descarte o preparo. Após o experimento, fixe o cérebro com as sondas ainda no tecido, em seguida excise o cérebro, remova o fixador e desidrate o cérebro.

Os locais dos canais de gravação podem então ser identificados por microscopia confocal a partir do aroma floral de mimus Luci. O número total de voláteis está sendo liberado. A CG é tipicamente entre 60 e 70 compostos.

O aroma de Mimus Luci é predominantemente composto por monoterpenoides, incluindo beta myosin e alpha pinine. O restante do aroma é composto por voláteis de seis carbonos. Várias preparações foram estimuladas com três microlitros do extrato ocular de Mimus Lewis.

Esta gravação de uma das oito unidades neurais registradas pelo eletrodo multicanal mostra como um neurônio é seletivo a voláteis específicos. Neste exemplo, a dine é o composto apresentado. Abaixo estão as respostas de oito unidades neurais.

Cerca da metade do conjunto foi inresponsiva. Isso é surpreendente dada a diversidade de compostos voláteis mencionados no espaço floral, mas essa observação é consistente entre preparações e relatada por outros estudos. A taxa de disparo normalizada das unidades responsivas mostra que há uma forte seletividade por um grupo de odorantes.

Os odorantes destacados pelas setas provocaram as respostas mais robustas. São a demina e a trans beta osaína. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar seu inseto para o experimento e, em seguida, realizar o experimento utilizando cromatografia gasosa com gravação multicanal.

O objetivo, então, é identificar odorantes putativamente eficazes do ponto de vista comportamental em um bouquet complexo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas, se executada corretamente seguindo este procedimento. Outros métodos, como testes comportamentais com os odorantes identificados, podem ser realizados para determinar completamente a eficácia dos voláteis na mediação da resposta comportamental do inseto.