Identificação de voláteis olfativas utilizando cromatografia gasosa-Multi-unidade Gravações (GCMR) no lobo antenal Inseto

O objetivo geral deste procedimento é identificar odores biologicamente eficazes em sentido complexo por meio de gravações no cérebro da abelha. Isso é feito primeiro coletando o sentido do efeito comportamental e, em segundo lugar, preparando o cromatógrafo gasoso e os sistemas de gravação multicanal para o experimento. O terceiro passo é preparar e dissecar o cérebro da abelha para as gravações neurais na antena do lóbulo da fábrica.

O experimento é então conduzido inserindo os eletrodos no lóbulo de uma antena e medindo as respostas aos voláteis inchados pela análise da atividade neural em resposta ao sentido complexo e seus constituintes individuais. Podem ser identificados odores biologicamente ativos obtidos por cromatografia gasosa. Portanto, a principal vantagem dessa técnica em relação a outras técnicas, como o G-C-E-A-G, é a sensibilidade dos neurônios de carga da antena e a capacidade de caracterizar como os neurônios do cérebro respondem a voláteis florais específicos.

A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas analíticas eletrofisiológicas e químicas combinadas são difíceis de aprender devido à técnica de registro de preparação eletrofisiológica e às etapas necessárias para coletar voláteis do headspace. Embora essa técnica possa fornecer informações sobre o processamento olfativo de abelhas, ela também pode ser aplicada a outros sistemas, como fatores de doenças como mosquitos ou barbeiros, ou pragas agrícolas como pulgões ou mariposas. Para este procedimento, preparei um eletrodo de referência feito de fio de tungstênio em um micro manipulador em um segundo.

O micro manipulador tem um eletrodo multicanal, como um fio enrolado, tede ou eletrodo multicanal de silício conectado a um pré-amplificador tem um cromatógrafo gasoso com uma saída em uma mesa BNC blindada. A saída do detector de GCs é conectada com o amplificador e o sistema de aquisição de dados, de modo que os sinais neurais e GC sejam sincronizados. Neste exemplo, o gás portador de GC é hélio e está em uma coluna DB cinco GC.

O GC usa uma entrada de lista dividida com a temperatura definida para 200 graus Celsius e tem a temperatura do detector de ionização de chama definida para 230 graus Celsius. Depois que as amostras são aquecidas no gc, o efluente da coluna é dividido um a um entre o detector de ionização de chama e a antena B usando um conector de vidro y. Neste exemplo, o GC é usado para fornecer voláteis coletados por absorção dinâmica das flores oculares de Mimus Lewis, uma flor silvestre alpina nativa da Califórnia.

Alternativamente, em vez de usar o gc, compostos voláteis únicos ou misturas de compostos podem ser fornecidos por pulsos de ar. Disparado através de uma seringa de vidro separada contendo um pedaço de papel de filtro no qual os compostos foram depositados. Os pulsos de ar são desviados de uma corrente de ar constante usando uma válvula ativada por solenóide controlada por um computador.

Comece os preparativos cortando cerca de um centímetro da extremidade de uma ponta de pipeta de um mililitro. Coloque uma abelha na base da ponta da pipeta e empurre-a suavemente em direção à extremidade oposta da ponta até que apenas a cabeça fique exposta. Usando cera dental derretida, faça um molde ao redor da cabeça exposta.

A cera deve aderir aos olhos compostos para imobilizar completamente a cabeça, mas não deve entrar em contato com a antena, se necessário. Use pinos pequenos para imobilizar as antenas. Em seguida, faça uma janela quadrada como uma incisão na cápsula da cabeça usando uma lâmina afiada, como um micro bisturi.

Comece a cortar diretamente atrás da antena e adjacente a um dos olhos compostos. Corte uma linha reta entre os olhos. Em seguida, corte dorsalmente até que a cápsula da cabeça se curve para o tórax.

Continue o corte até a extremidade oposta da cápsula da cabeça. Por fim, volte ao início para completar o quadrado. Use uma pinça para remover a cutícula.

A cutícula adjacente à antena deve ser removida, ou impedirá o eletrodo assim que o cérebro for exposto. Imediatamente superfunda o tecido com solução salina de insetos. Certifique-se de que os lóbulos da antena estejam bem expostos.

Em seguida, use cuidadosamente uma pinça muito fina para remover a bainha perineural imediatamente acima dos lóbulos de uma antena. Tenha muito cuidado para não perfurar o cérebro da abelha com o fórceps. A preparação das abelhas está agora pronta para o registro eletrofisiológico.

Comece prendendo a abelha preparada a uma braçadeira fixada a uma base magnética. Mantenha-o super fundido com solução salina de insetos fornecida por um reservatório com um controlador de fluxo. Agora insira o eletrodo de referência no tecido cerebral contralateral.

Em seguida, insira o eletrodo multicanal nos lóbulos da antena da abelha. Quando os eletrodos estão no lugar. Aguarde de 30 a 60 minutos para que as gravações se estabilizem.

Durante esse tempo, prepare-se para os picos extracelulares dos neurônios, também limiando. Os canais de gravação individuais O limite manual pode ser necessário para alguns canais devido a um ruído nos canais de gravação. Em seguida, verifique se a rampa de temperatura da execução do GC está correta.

Neste exemplo, a temperatura começa em 50 graus Celsius por quatro minutos e depois aumenta 10 graus por minuto até uma temperatura final de 220 graus Celsius, ou é mantida por seis minutos. Quando as formas de onda das unidades nos canais de gravação se tornam consistentes, as gravações neurais são consideradas estáveis. Uma vez estabilizado, carregue a seringa com o odor floral do headspace e injete o odor na porta de injeção do cabeçote do gc.

Em seguida, comece imediatamente a gravar a partir dos eletrodos após o término da execução do GC. Deixe a preparação descansar por cinco a 15 minutos. Em seguida, injectar outra amostra no GC ou estimular a preparação utilizando compostos voláteis isolados ou misturas de compostos.

Se em algum momento a atividade espontânea parar ou mudar repentinamente, verifique o gotejamento de soro fisiológico e deixe a preparação descansar por 15 minutos. Então, se a atividade não recuperar seu nível anterior, descarte a preparação. Após o experimento, fixe o cérebro com as sondas ainda no tecido, depois excise o cérebro, limpe o fixador e desidrate o cérebro.

As localizações dos canais de gravação podem então ser identificadas por microscopia confocal do perfume floral mimus Luci. O número total de voláteis está saqueando. O GC é tipicamente entre 60 e 70 compostos.

O perfume de Mimus Luci é predominantemente composto de monoterpenóides, incluindo beta miosina e alfa pinino. O restante do perfume é composto por seis voláteis de carbono. Várias preparações foram estimuladas com três microlitros do extrato ocular de Mimus Lewis.

Esta gravação de uma das oito unidades neurais registradas pelo eletrodo multicanal mostra como um neurônio compete com voláteis específicos. Neste exemplo, dine é o composto mostrado. Aqui estão as respostas de oito unidades neurais.

Cerca de metade do conjunto não respondeu. Isso é surpreendente, dada a diversidade de compostos voláteis aludidos do headspace floral, mas isso é consistente entre as preparações e é relatado por outros estudos. A taxa de disparo normalizada das unidades responsivas mostra que há uma forte seletividade para um grupo de odores.

Os odores destacados pelas setas provocaram as respostas mais robustas. Estes são demine e trans beta osain. Portanto, depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar seu inseto para o experimento e, em seguida, conduzir o experimento usando cromatografia gasosa com gravação multicanal.

O objetivo, então, é identificar odores comportamentais supostamente eficazes em um buquê complexo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas se feita corretamente Seguindo este procedimento. Outros métodos, como testes comportamentais com os odores identificados, podem ser realizados para determinar totalmente a eficácia dos voláteis na mediação da resposta comportamental do inseto.