Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar parceiros de interação da proteína Grab dois por meio do clonagem de expressão de CD NA e da observação de alterações na proteína fluorescente verde marcada com Grab dois. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de uma biblioteca de CD NA a partir de lisados bacterianos como segundo passo. Os CDNAs são transfectados em células de rim embrionário humano, o que resultará na expressão do construto repórter juntamente com os genes de interesse.

Em seguida, as placas transfectadas são analisadas no microscópio opera para visualizar alterações na localização do grab dois ao longo das células, obtendo-se resultados que mostram o recrutamento mediado pelo receptor do fator de crescimento epidérmico do grab dois marcado com GFP para endossomos com base na microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como o teste de duplo híbrido, é que os parceiros de interação do grab dois podem ser identificados em uma situação fisiológica que leve em conta a distribuição subcelular dos parceiros de interação.

Embora este método possa ser usado para identificar a transdução de sinal por Grab dois, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras proteínas de interesse. A biblioteca de cDNA é fornecida como clones bacterianos individuais em estoques de glicerol.

Em formato de placa de 96 poços, utilizando o comando re ray no menu do picker do Hudson Rapid Pick Light. Selecionar clones bacterianos a partir da placa fonte e inocular em 1,5 mililitros de LB com amp em uma placa de fundo profundo de 96 poços. Sobre-selar as placas de fundo profundo com um selo permeável a gases e incubar durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador. No dia seguinte, centrifugar as placas de fundo profundo contendo as bactérias a 2000 RPM por 20 minutos.

Usando adaptadores de placa em uma centrífuga de bancada, aspire o meio dos poços deixando o pellet bacteriano intacto. Em seguida, configure a bancada da estação de trabalho automatizada Tecan Freedom Evo conforme mostrado aqui. Distribua as soluções para preparação de plasmídeo nos canais de um a cinco e coloque uma placa de poços profundos sobre a bancada.

Coloque um reservatório de múltiplos poços com solução de alucina ao lado da placa de poços profundos; carregue as ponteiras nos suportes. Monte o manifold a vácuo. A placa de ligação de plasmídeo é colocada dentro do manifold e a placa de filtro de plasmídeo é colocada sobre o manifold. Re-suspenda os pellets com 250 microlitros da solução um.

O tampão de suspensão Resus, pipetando para cima e para baixo. É fundamental garantir que os pellets sejam completamente ressuspendidos para o sucesso deste procedimento. Um agitador pode ser usado caso a pipetagem para cima e para baixo não consiga ressuspender completamente o pellet.

Uma vez que os pellets estejam completamente ressuspendidos, coloque as bactérias adicionando 250 microlitros de solução ao tampão de lise. Selle a placa e inverta-a para permitir uma mistura completa. Ajuste um cronômetro para dois minutos.

Em seguida, adicione 350 microlitros da solução três, o tampão de neutralização. Selle a placa e inverta três vezes.

Transfira os lisados bacterianos para as placas de filtro de plasmídeo. Aplique vácuo durante cinco minutos. Remova a placa de filtro e coloque a placa de ligação sobre o manifold.

Aplique vácuo por um minuto. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem adicional e aplique vácuo por dois minutos. Adicione 900 microlitros da solução de tampão de lavagem quatro e aplique vácuo por dois minutos.

Em seguida, adicione 900 microlitros da solução de lavagem quatro novamente e aplique vácuo por 15 minutos. Coloque a placa de coleta de DNA dentro do manifold. Adicione 100 microlitros do tampão Elucian à placa de ligação e incube por dois minutos.

Aplicar vácuo durante 10 minutos. Por fim, remover a placa de coleta e medir a concentração de DNA utilizando o NanoDrop 8.000. Normalmente, espera-se um rendimento de cerca de 100 nanogramas por microlitro com este método para iniciar este procedimento.

Após as células HEK 293 serem tripsinizadas e contadas, use um dispensador automático para dispensar duas vezes 10 à quarta potência de células em cada poço de uma placa Perkin Elmer. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para transfeção.

Use o manipulador automático de líquidos para preparar a seguinte mistura em cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços: 100 nanogramas de GFP. Adicione dois plasmídeos de DNA com 100 nanogramas de CD NA em 25 microlitros de meio sem soro. Em seguida, adicione 25 microlitros de meio sem soro contendo 0,5 microlitro de transfect em cada poço e inicie o cronômetro por 30 minutos.

Após 30 minutos, transfira 50 microlitros da mistura de transfeção de cDNA para as células. Utilize um método de dispensação suave. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Para iniciar a aquisição de imagens, abra o software Opera. Selecione a guia de configuração e escolha a objetiva de 20 vezes e o tipo correto de placa. Certifique-se de que o colar esteja ajustado no valor correto na objetiva para permitir o foco com diferentes tipos de placa.

Em seguida, selecione a guia do microscópio. Defina a exposição um como laser fite 4 88 e a exposição dois como laser UV 365. Ative o filtro UV em ambas as exposições e atribua a exposição.

Um para a câmera um e exposição. Dois para a câmera dois. Defina os tempos de exposição em 800 milissegundos para a exposição um e 40 milissegundos para a exposição.

Dois, selecione a exposição, defina a altura de foco como zero micrômetros. Selecione foco após focar. Exponha a câmera um.

Ajuste a altura do foco para otimizar o plano de exposição e clique em capturar altura. Salve os parâmetros de exposição, repita para a exposição. Dois, selecione a guia de definição do experimento, crie o layout e o sublayout.

Arraste e solte o layout relevante, exposição, imagem de referência, correção de inclinação, arquivo de recorte e sublayout. Salve o experimento. Selecione a guia de experimento automático e adquira imagens em condições normais.

Grab dois está localizado em toda a célula. Após a estimulação de um receptor de fator de crescimento, ele se transloca para a membrana plasmática e é subsequentemente internalizado em endossomos. Nesta figura, o painel superior mostra células CO M seis que foram transfectadas temporariamente com GFP grab dois, e, como esperado, a fluorescência está distribuída por toda a célula.

No entanto, em células transfectadas temporariamente com GFP grab dois mais o receptor de superfície celular IT EGFR grab dois, este último se realoca para estruturas semelhantes a endossomos, conforme mostrado no painel inferior. Assim, ao aplicar uma biblioteca de genoma inteiro, pode-se esperar que novas proteínas de superfície celular ligantes de grab dois possam ser identificadas. Este método não se limita à detecção de proteínas de superfície celular.

Por exemplo, a DYNAMIN dois da GPA, que participa da endocitose mediada por grab dois, induz uma translocação do grab dois. Neste experimento, o grab dois GFP foi cotransfectado com DNM dois em células HEC 2 93 T. A realocação do grab dois GFP para estruturas semelhantes a endossomos é ilustrada pelas células dentro dos círculos vermelhos.

Após este procedimento, outros métodos como imunoprecipitação ou ensaios bioquímicos podem ser utilizados para responder perguntas adicionais, como se a interação é direta ou indireta. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a clonagem de expressão para identificar interações proteicas subcelulares.