Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão
October 30th, 2012
Um método de rastreio de alto conteúdo para a identificação de novos receptores de sinalização transmembrana competentes é descrito. Este método é passível de automatização em larga escala e permite previsões sobre In vivo Proteína de ligação e a localização sub-celular de complexos de proteínas em células de mamíferos.
O objetivo geral do experimento a seguir é identificar parceiros de interação de grab two por clonagem de expressão de CD NA e observação de mudanças na proteína fluorescente verde marcada como Grab two. Isso é conseguido preparando primeiro uma biblioteca CD NA a partir de lisados bacterianos como uma segunda etapa. Os CDNAs são transfectados em células renais embrionárias humanas, o que resultará na expressão da construção repórter junto com os genes de interesse.
Em seguida, as placas transfectadas são analisadas no microscópio de ópera para visualizar mudanças na localização do grab two ao longo das células, são obtidos resultados que mostram o recrutamento mediado pelo receptor do fator de crescimento epidérmico de GFP marcado. Pegue dois para endossomos com base em microscopia de fluorescência. A principal vantagem desta técnica em comparação com os métodos existentes, como esses dois híbridos, é que os parceiros de interação da garra dois podem ser identificados em uma situação fisiológica que leva em consideração a distribuição subcelular dos parceiros de interação.
Bem, embora este método possa ser usado para identificar a transdução de sinal pelo Grab dois. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras proteínas de interesse. A biblioteca de CDNA é fornecida com um único clone bacteriano em estoques de glicerol.
Em um formato de 96 poços usando o comando re ray no menu do seletor da luz de coleta Hudson Rapid. Escolha clones bacterianos da placa de origem e inocule em 1,5 mililitros lb amp em uma placa de 96 poços de profundidade. Sele tardiamente as placas de poços profundos com uma vedação permeável a gás e incube durante a noite a 37 graus Celsius em um agitador No dia seguinte, gire as placas de poços profundos contendo a bactéria A 2000 RPM por 20 minutos.
Usando adaptadores de placa em uma centrífuga de mesa, aspire o meio dos poços deixando o pellet bacteriano intacto. Em seguida, configure o deck da estação de trabalho Tecan Freedom Evo Automation conforme mostrado aqui. Distribua as soluções para preparação de plasmídeo em calhas de um a cinco e coloque uma placa de poço profundo no convés.
Coloque uma calha de vários poços com solução de alumínio adjacente às pontas de carga da placa de poço profundo nos racks de pontas. Monte o coletor de vácuo. A placa de ligação do plasmídeo é colocada dentro do coletor e a placa do filtro do plasmídeo é colocada no topo do coletor Resus suspender pellets com 250 microlitros de solução um.
O amortecedor de suspensão Resus pipetando para cima e para baixo. Certificar-se de que os pellets sejam completamente ressuspensos é fundamental para o sucesso deste procedimento. Um agitador pode ser usado se um acariciar para cima e para baixo não ressuspender completamente o pellet.
Uma vez que os pellets são completamente ressuspensos, as bactérias estão adicionando 250 microlitros de solução ao tampão de lise. Sele a placa e inverta para permitir a mistura completa. Defina um cronômetro para dois minutos.
Em seguida, adicione 350 microlitros da solução três. O tampão de neutralização. Feche a placa e inverta três vezes as linhas.
Transferir os lisados bacterianos para as placas filtrantes do plasmídeo. Aplique vácuo por cinco minutos. Remova a placa do filtro e coloque a placa de ligação em cima do coletor.
Aplique vácuo por um minuto. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem adicional e aplique vácuo por dois minutos. Adicione 900 microlitros de solução tampão de lavagem quatro e aplique vácuo por dois minutos.
Depois disso, adicione 900 microlitros de solução tampão de lavagem quatro novamente e aplique vácuo por 15 minutos. Coloque a placa de coleta de DNA dentro do coletor. Adicione 100 microlitros de tampão eluciano à placa de ligação e incube por dois minutos.
Aplique vácuo por 10 minutos. Por fim, remova a placa coletora e meça a concentração de DNA usando o NanoDrop 8.000. Normalmente, pode-se esperar um rendimento de cerca de 100 nanogramas por microlitro com este método para iniciar este procedimento.
Depois de hec 2 9 3 células são trips, inizadas e contadas. Use um dispensador automatizado para dispensar duas vezes 10 elevado às quatro células em cada poço de um Perkin Elmer. Visualize as células incubadas em placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para transfecção.
Use o manipulador de líquidos automatizado para preparar a seguinte mistura em cada poço de um fundo redondo 96, placa de poço 100 nanogramas de GFP. Pegue dois DNA de plasmídeo com 100 nanogramas de CD NA em 25 microlitros de meio livre de soro. Em seguida, adicione 25 microlitros de meio livre de soro contendo 0,5 microlitros de transfecto em uma mistura por poço e inicie o cronômetro por 30 minutos.
Após 30 minutos, transfira 50 microlitros no transfecto CDNA em mistura para as células. Usando um método de distribuição suave. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para iniciar a aquisição da imagem, inicie o software opera. Selecione a guia de configuração e selecione a objetiva de 20 vezes e o tipo de placa correto. Certifique-se de que o colar esteja definido com o valor correto na objetiva para permitir o foco com diferentes tipos de placa.
Em seguida, selecione a guia do microscópio. Defina a exposição um como laser fite 4 88 e a exposição dois como laser UV 365. Ative o filtro UV em ambas as exposições e atribua a exposição.
Um para a câmera um e exposição. Dois para a câmera dois. Defina os tempos de exposição para 800 milissegundos para exposição, um e 40 milissegundos para exposição.
Dois, selecione a exposição, um defina a altura do foco para zero mícrons. Selecione o foco depois de focado. Exponha a câmera um.
Ajuste a altura do foco para otimizar o plano de exposição e clique em pegar altura. Salve os parâmetros de exposição, repita para exposição. Dois, selecione a guia de definição do experimento, crie o layout e o sublayout.
Arraste e solte o layout relevante, a exposição, a imagem de referência, a inclinação, o arquivo de corte e o sublayout. Salve o experimento. Selecione a guia de experimento automático e adquira imagens em condições normais.
A garra dois está localizada em toda a célula. Após a estimulação de um receptor de fator de crescimento, ele se transloca para a membrana plasmática e é subsequentemente internalizado em endossomos. Nesta figura, o painel superior mostra seis células de CO M que foram transfectadas transitoriamente com GFP grab two e, como esperado, a fluorescência é distribuída por toda a célula.
No entanto, em células transitoriamente transfectadas com GFP, pegue dois mais o receptor de superfície celular IT, EGFR pegue dois, realoca-se para estruturas semelhantes a endossomos, conforme mostrado no painel inferior. Assim, ao aplicar uma biblioteca ampla do genoma, pode-se esperar que novas proteínas de superfície celular de ligação possam ser identificadas. Este método não se limita à detecção de proteínas da superfície celular.
Por exemplo, o DYNAMIN dois do GPA, que está envolvido na endocitose mediada pela garra dois, induz uma translocação da garra dois. Neste experimento, a garra GFP dois foi transfectada com DNM dois em células HEC 2 93 T. A realocação da garra GFP dois para estruturas semelhantes a endossomos é ilustrada pelas células dentro dos círculos vermelhos.
Após este procedimento, outros métodos, como imunoprecipitação ou ensaios bioquímicos, podem ser usados para responder a outras perguntas, como se a interação é direta ou indireta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a clonagem de expressão para identificar interações de proteínas subcelulares.
Visão geral
Este artigo descreve um método de triagem de alto conteúdo para identificar novos receptores transmembranares competentes em sinalização, adequado para automação em larga escala. O método permite previsões sobre a ligação de proteínas in vivo e a localização subcelular de complexos proteicos em células de mamíferos.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Neurociência
- Biologia celular
- Transdução de sinal
Fundamentos
- Entender as interações de proteínas é crucial para elucidar vias de sinalização celular.
- Métodos tradicionais podem não refletir com precisão condições fisiológicas.
- A triagem de alto conteúdo permite uma análise automatizada e eficiente.
- A marcação GFP fornece insights visuais sobre a localização das proteínas.
Objetivo do estudo
- Identificar parceiros de interação de Grab2 usando clonagem de expressão de CDNA.
- Observar mudanças na localização de Grab2 em resposta a estímulos.
- Melhorar os métodos existentes fornecendo um contexto fisiológico para as interações proteicas.
Métodos utilizados
- Preparação de uma biblioteca de CDNA a partir de lisados bacterianos.
- Transfecção de células renais embrionárias humanas com construtos repórter.
- Análise de células transfectadas usando microscopia de fluorescência.
- Automação dos processos de preparação de plasmídeo e transfecção celular.
Principais resultados
- Grab2 marcado com GFP está localizado em toda a célula e transloca para a membrana plasmática após estimulação.
- A interação com o receptor de fator de crescimento epidérmico leva à internalização em endossomos.
- O método identifica com sucesso interações proteicas em um contexto fisiológico.
- Os resultados indicam potenciais aplicações para outras proteínas de interesse.
Conclusões
- O método de triagem de alto conteúdo é eficaz para estudar interações proteicas.
- Esta abordagem pode ser aplicada a várias vias de sinalização além da Grab2.
- A automação aumenta a eficiência e a escalabilidade do processo de triagem.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping Grb2 interaction networks in a physiological context.
- Supports biological de-risking by visualizing subcellular localization and complex formation in live mammalian cells.
- Facilitates functional target validation through quantitative assessment of protein recruitment and relocalization.
- Improves predictive confidence for advancing signaling pathway targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for high-content screening of protein-protein interactions.
- Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative imaging outputs across cDNA libraries.
- Enables scalable, genome-wide identification of novel Grb2-binding proteins for downstream evaluation.
- Supports reliable compound or genetic perturbation screening by providing robust localization readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant signaling pathways by modeling Grb2 recruitment in mammalian cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling follow-up biochemical confirmation.
- De-risks mechanistic assumptions prior to in vivo model investment.
- Facilitates identification of translational biomarkers linked to Grb2 signaling dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing Grb2 complex formation in response to diverse stimuli.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for high-throughput identification of interaction partners.
- Analytics: Delivers quantitative localization and recruitment metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and mechanistic continuity into preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and expression cloning platform adaptable to other signaling proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales protein interaction screening in mammalian systems.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by prioritizing validated targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of signaling pathway assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content imaging, cell culture, and molecular cloning.
- Needs access to automated liquid handling, fluorescence microscopy, and image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data interpretation criteria.
- Adaptable to various mammalian cell lines and signaling proteins with appropriate construct design.
- Dependent on robust image acquisition and quantitative analysis pipelines for reliable outputs.
