O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

O objetivo geral deste procedimento é isolar linfócitos do trato reprodutivo do camundongo. Isso é feito removendo primeiro todo o trato genital e picando o tecido em pequenos pedaços para liberar os linfócitos do tecido. O tecido finamente picado é digerido com colagenase oito e agitação vigorosa do tecido a 37 graus Celsius.

Com uma agitação magnética, os linfócitos são então isolados por gradiente de chamada. Em última análise, os linfócitos podem ser caracterizados por citometria de fluxo A implicação desta técnica se estendeu ao diagnóstico e à terapia de doenças reprodutivas. Como este método nos permite entender o comportamento dos linfócitos teciduais, que muitas vezes são diferentes dos linfócitos isolados do sistema circulante.

Embora esse método forneça informações sobre o sistema de mucosa reprodutiva, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os sistemas de mucosa intestinal e respiratória. Depois de sacrificar um camundongo fêmea, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na linha média baixa e, em seguida, abra a pele. Mova suavemente os intestinos para o lado, identifique o ucs e, em seguida, isole e remova todo o trato genital do ucs para a abertura vaginal.

Coloque o trato genital em uma placa de Petri. Use uma tesoura para abrir todo o trato longitudinalmente. Em seguida, transfira o tecido para uma placa de Petri com meio RPMI 10 completo.

Agora corte o trato genital em pedaços finos e, em seguida, transfira os pedaços para um frasco contendo RPMI 10 e EDTA completos. Colocar o balão numa agitação magnética e agitar o tecido duas vezes durante 15 minutos à temperatura ambiente de cada vez para eliminar as células epiteliais após o último período de agitação, rejeitar o sobrenadante e, em seguida, deitar os pedaços de tecido através de um filtro de células de 40 micrómetros num tubo cónico de 50 mililitros. Lave o resíduo de EDTA com meio completo.

Agora transfira os pedaços de tecido filtrado para um novo frasco com RPMI 10 fresco e colagenase e digere os pedaços a 37 graus Celsius na agitação magnética para agitar vigorosamente o tecido após uma hora, despeje o sobrenadante através de um filtro de células de 100 micrômetros em um tubo cônico fresco de 50 mililitros e mantenha a suspensão de células filtradas em gelo. Adicionar RPMI 10 fresco com colagenase ao balão original e agitar o tecido mais duas vezes utilizando RPMI 10 completo fresco e colagenase de cada vez. Após a terceira digestão, nenhum pedaço de tecido visível deve estar presente na solução.

Agora, junte os sobrenadantes das três digestões. Gire as células por cinco minutos a 410 Gs e quatro graus Celsius e, em seguida, descarte o sobrenadante. Comece suspendendo novamente o pellet celular em uma solução nova de 40% por chamada.

Adicione a suspensão celular com 40% por chamada em um tubo de gradiente e, em seguida, cuidadosamente underlay e igual volume de recém-preparado. 70% por chamada. Agora centrifugue as amostras de gradiente por 20 minutos em temperatura ambiente com a interrupção.

Após a centrifugação, colha cuidadosamente os linfócitos na camada de interface entre os gradientes de perol. Em seguida, lave as células recuperadas com RPMI um a três por 10 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, após descartar o suplante, suspender novamente os linfócitos na solução apropriada de acordo com o procedimento experimental desejado.

Este gráfico de pontos é um exemplo de uma população de linfócitos que foi isolada do trato genital de um camundongo infectado por via intravaginal de clamídia urederme. Sete dias após a infecção, a suspensão unicelular foi bloqueada em CD três linfócitos positivos e analisada para células que expressam CD quatro e CD oito após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para o pesquisador explorar a função reprodutiva dos linfócitos e as características celulares no modelo de doença de camundongo que imita doenças humanas.