Name: O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Aprenda a isolar linfócitos do trato genital de rato usando digestão enzimática e gradiente de Percoll. Este método eficiente permite caracterizar células por citometria de fluxo e estuda o comportamento de linfócitos teciduais em doenças reprodutivas.

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Gostaríamos de agradecer NIH para bolsas de financiamento R01-AI026328 (KAK) e R01-AI079004 (KAK).

1. A remoção do tracto genital <ol><li> Euthanize o mouse utilizando as diretrizes aprovadas. Fazer incisão na linha baixa e retrair a pele. </li><li> Isolar e remover trato genital todo, do oviduto da abertura vaginal. </li><li> Abrir todo o trato longitudinalmente com uma tesoura. </li><li> Cortar o tracto genital com finas tesouras cirúrgicas em pequenos pedaços (cerca de &lt;1 mm) numa placa de Petri com RPMI-10/EDTA completo (ver a fórmula seguinte) e agita-se o frasco de tecido em 125 ml à temperatura ambiente num agitador magnético definido para 15 min. Este procedimento é repetido duas vezes e, em seguida, o sobrenadante, que contém o epitélio e outros detritos, é descartada. </li><li> Despeje conteúdo do balão através de um filtro celular (40μm). Lavar resíduo EDTA com meio completo. RPMI/10 completo: RPMI 500 ml (Gibco), 10% de soro fetal bovino (FBS), inactivado pelo calor, 5 ml penicilina / estreptomicina, a 5 ml de HEPES 1M. RPMI-10/EDTA completo: RPMI a 10% (como acima) com E 5mMDTA </li></ol> 2. Digerir tecidos do trato genital <ol><li> Transferir pedaços de tecido para um frasco novo, com 20 ml RPMI-10/collagenase fresco (ver receita abaixo) e digerir o tecido, a 37 ° C durante 1 hora num agitador magnético definido para agitar vigorosamente o tecido. RPMI-10/collagenase completo: Pouco antes de utilização, reconstituir colagenase tipo VIII (Sigma; armazenar a -20 ° C, ou de acordo com as instruções do fabricante.), Adicionar em RPMI/10 completo até uma concentração final de 450-500U/ml. </li><li> Após a digestão em primeiro lugar, recolher os sobrenadantes através de 100 células coador um, manter as células em gelo. </li><li> Transferir o tecido não digerido para um novo frasco e repetir a etapa 2.1 por mais duas vezes, utilizando RPMI-10/collagenase completo fresco para um total de três digestões separadas. Neste ponto, há pedaços de tecido visível deve estar em solução. </li><li> Piscina os sobrenadantes todos juntos a partir de uma amostra e recolher a 100 filtro célula iM. Gire a cElls para baixo. Os sedimentos celulares irão ser separados usando gradientes de Percoll. </li></ol> 3. Separação de células do tracto genital, utilizando gradientes de Percoll <ol><li> Preparar cada concentração de Percoll antes do uso: <ul><li> 100% de Percoll isotônica: mix 09:01 estoque Percoll (Pharmacia Biotch) vs PBS 10x. pH a 7,4 com HCL. </li><li> Solução de Percoll a 40%: misturar 40 mL de Percoll isotónico 100% e 60 ml de meio RPMI completo. </li><li> Solução de Percoll a 70%: misturar 70 mL de Percoll isotónico 100%, com 30 ml de meio RPMI completo. </li></ul></li><li> Ressuspender cada pelete de células a partir do passo 6 em soluções de Percoll 40%. Um volume igual de Percoll a 70% irá ser utilizado para fazer os gradientes. Há duas maneiras de configurar tubos de gradiente: <ol><li> Sob-camada: adicionar a suspensão de células com 40% de Percoll em um tubo de gradiente em primeiro lugar, em seguida, cuidadosamente sob-camada de Percoll 70%. </li><li> Ao longo da camada de: adicionar Percoll a 70% num tubo de um lado, em seguida lenta e cuidadosamente carregar Percoll a 40%, contendo as células nasuperior. </li></ol></li><li> Amostras de gradiente vai ser centrifugadas a 900 xg à temperatura ambiente, durante 20 minutos com o freio. </li><li> Os linfócitos será na camada de interface entre 40% e 70% de camadas Percoll. Cuidadosamente colher a camada de interface, lave com RPMI 1:3 e girar a 740 xg. Os linfócitos será no sedimento de células e estão prontos para utilização posterior. </li></ol> 4. Resultados representativos Um exemplo de isolamento de linfócitos a partir do tracto genital rato e análise de citometria de fluxo (FACS) é mostrado na Figura 1. Tracto genital foi removido de Chlamydia muridarum intravaginalmente rato infectado 7 dias após a infecção. Duas vias genitais foram agrupados em conjunto de modo a ter um número suficiente de linfócitos exame funcional e fenotípica por FACS. Tecidos dissecados foram processados ​​pela digestão e passos de isolamento como descrito acima. A suspensão de células isoladas foram corados com vários conjugados com fluorocromosOs anticorpos monoclonais contra CD3 de ratinho, células T CD4 e CD8. A Figura 1 mostra uma apresentação dot-plot de CD4 células T positivas contra as células T CD8 positivas gated em linfócitos T CD3 positivas. Nosso procedimento pode examinar linfócitos isolados do trato genital de modelos de doenças diferentes para avaliar várias características de células imunes funcionais e fenotípica em diferentes doenças no modelo do rato. Estes incluem diversas células imunes, tais como células dendríticas, neutrófilos, macrófagos NK, NKT, células T (células T específicas Ag), células B, etc 3-10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" /> Linfócitos Figura 1. Foram isolados a partir de trato genital de camundongos infectados com Chlamydia muridarum, utilizando o método aqui apresentado. Após o processo de separação completa, os linfócitos foram coradas com fluorocromo-conjugados CD3, CD4 e CD8. Os dados foram quadrante fechado em linfócitos CD3 +,mostrando CD4 + versus CD8 + com e porcentagem de células fechadas.

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, é mostrado como preparar linfócitos no trato genital de mouse e é facilmente dominado. O ponto mais crítico deste processo é o de manter a viabilidade das células, mantendo as células em gelo. O rendimento de células a partir deste método depende da técnica, a manipulação de habilidade, o estado infeccioso do rato (ou ingénuo dia após a infecção), o agente patogénico (bacterianas, virais, fúngicas) e da secção do tracto reprodutivo murino examinados (oviduto, útero, segmento vaginal ou do trato genital ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma Ciências da Vida </td><td> C2139-1G </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences </td><td> 17-0891-01 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI1640 </td><td> Gibco pela Life Technologies </td><td> 11875 </td><td></td></tr></tbody></table>

o isolamento de linfócitos de rato genital tract mucosa

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Superfícies mucosas, inclusive no trato gastrointestinal, urogenital e respiratória, fornecer portas de entrada para patógenos, como vírus e bactérias 1. Mucosas são também locais indutivos no hospedeiro para gerar a imunidade contra os agentes patogénicos, tais como as manchas Peyers no tracto intestinal e do tecido nasal associada linforreticular no trato respiratório. Esta característica única traz a imunidade da mucosa como um jogador crucial do sistema de defesa do hospedeiro. Muitos estudos têm sido focados na gastrointestinais e respiratórias mucosas. No entanto, tem havido pouca investigação de reprodução mucosas. A mucosa do trato genital é o local da infecção primária de doenças sexualmente transmissíveis (DST), incluindo infecções bacterianas e virais. DSTs são um dos maiores desafios de saúde mais críticos que o mundo enfrenta hoje. Centros para Controle e Prevenção de Doenças estima que existem 19 milhões de novos a cada ano infecciosas nos Estados Unidos. STDs custar os EUA sistema de saúde 17000000000 dólares a cada ano 2, e indivíduos de custos ainda mais em conseqüências imediatas e de saúde ao longo da vida. Para enfrentar este desafio, uma maior compreensão da imunidade da mucosa reprodutiva é necessária e isolar linfócitos é um componente essencial destes estudos. Aqui, apresentamos um método para isolar reproduzível linfócitos de murinos trato genital feminino para estudos imunológicos que podem ser modificados para adaptação a outras espécies. O método descrito a seguir é baseado em um rato.

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de outros

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

As superfícies mucosas, inclusive nos tratos gastrointestinal, urogenital e respiratório, fornecem portais de entrada para patógenos, tais como vírus e ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar linfócitos do trato reprodutivo de camundongo. Isso é realizado primeiramente removendo todo o trato genital e picando o tecido em pequenos pedaços para liberar os linfócitos do tecido. O tecido finamente picado é digerido com colagenase oito e agitação vigorosa do tecido a 37 graus Celsius.Com agitação magnética, os linfócitos são então isolados por gradiente Percoll. Por fim, os linfócitos podem ser caracterizados por citometria de fluxo. A implicação desta técnica estende-se ao diagnóstico e à terapia de doenças reprodutivas. Como este método nos permite compreender o comportamento dos linfócitos teciduais, que frequentemente diferem dos linfócitos isolados do sistema circulante.Embora este método forneça informações sobre o sistema da mucosa reprodutiva, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os sistemas da mucosa intestinal e respiratória. Após eutanasiar um camundongo fêmea, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão mediana baixa e, em seguida, abra a pele. Desloque suavemente os intestinos para o lado, identifique o UCS e, então, isole e remova todo o trato genital do UCS até a abertura vaginal.Coloque o trato

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de linfócitos de um adesivo de Peyer de camundongo colhido. Os linfócitos isolados podem ser usados para análise posterior.

Isolamento de linfócitos de um adesivo de Peyer de camundongo

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

O isolamento de células estromais de linfonodos é um procedimento de várias etapas, incluindo digestão enzimática e desagregação mecânica para obter células reticulares fibroblásticas, células linfáticas e endoteliais sanguíneas. No procedimento descrito, uma digestão curta é combinada com desagregação mecânica automatizada para minimizar a degradação do marcador de superfície das células estromais viáveis dos linfonodos.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mieloides da pele de camundongos e drenar linfonodos após injeção intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. A citometria de fluxo das células coletadas fornece um ensaio confiável para caracterizar a resposta inflamatória da pele e dos linfonodos de drenagem ao parasita.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Há um interesse crescente na caracterização quantitativa de linfócitos intestinais devido ao crescente reconhecimento de que essas células desempenham um papel crítico em uma variedade de doenças intestinais e sistêmicas. Neste protocolo, descrevemos como isolar populações de células únicas de diferentes compartimentos do intestino delgado para posterior caracterização por citometria de fluxo.

Isolamento e Caracterização de citometria de fluxo de linfócitos de murino Intestino Delgado

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Neste estudo, apresentamos uma nova e eficaz protocolo para a isolação de linfócitos de remendos de Peyer (PPs), que podem ser usados posteriormente para ensaios funcionais in vivo e in vitro , bem como estudos de fluxo cytometric t folicular auxiliar e células B de centro germinativo.

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a isolar linfócitos do trato genital de rato usando digestão enzimática e gradiente de Percoll. Este método eficiente permite caracterizar células por citometria de fluxo e estuda o comportamento de linfócitos teciduais em doenças reprodutivas.

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

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