Name: Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente Em situ Hibridização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: Aprenda a analisar o tempo de replicação cromossômica em células mamíferas usando incorporação de BrdU e hibridização in situ fluorescente (FISH). Este método permite comparações diretas entre cromossomos rearranjados e normais.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional do Câncer, CA131967.

1. BrdU Incorporação (Rotulagem Terminal) <ol><li> Células da placa para cerca de 70% de confluência, em cultura de tecido 150 milímetro hr prato 24 antes da adição de BrdU. </li><li> Substitua com meios frescos meio completo contendo 20 ng / ml de BrdU (Sigma) em pontos de tempo apropriados antes da colheita. A duração do tempo de células são cultivadas em meios com BrdU irá variar com o tipo de células e espécies, normalmente a fase G2 dura entre 2 e 5 horas (Figura 1). </li></ol> 2. Colheita cromossomo das Culturas monocamada de células <ol><li> Remover os meios de cultura a partir da placa e recolher 10 ml num tubo de centrífuga de 15 ml. Descarte de mídia restantes. </li><li> Enxaguar as células uma vez com 10 ml Versine [ou HBSS (Sigma)]. </li><li> Adicionar 5 ml de tripsina a 0,25% em Versine (ou HBSS) para o prato. Incubar à temperatura ambiente até que as células são separadas da placa. </li><li> Adicionar a suspensão de células tripsinizadas para o tubo contendo os 10 ml de meios de comunicação a partir do passo 2.1. &lt;/ Li&gt; <li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min para sedimentar as células. Aspirar o sobrenadante, deixando 0,5 ml de meio mais o sedimento de células. </li><li> Ressuspender as células pipetando cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur. </li><li> Adicionar 3 gotas de uma solução hipotónica de KCl (0,075 M (Sigma), aquecido a 37 ° C); misturar a suspensão de células com uma pipeta de Pasteur. Adicionar 0,5 ml de solução hipotónica e misturar novamente com uma pipeta de Pasteur. Levar o volume de solução hipotónica de 5 ml e misturar novamente. Incubar a 37 ° C durante 20-45 min, dependendo do tipo de célula. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante, deixando 0,5 ml de meio mais o sedimento de células. </li><li> Ressuspender o sedimento de células suavemente sacudindo o tubo. As células osmoticamente inchados será frágil neste momento, por isso o cuidado deve ser tomado para não atrapalhar as membranas citoplasmáticas. </li><li> Adicione 3 gotas de fixador Carnoy (ácido acético glacial 01:03: O metanol) e misturar delicadamente com uma pipeta pipeta Pasteure. Adicionar 0,5 ml de fixador e misture com cuidado pipetando com uma pipeta Pasteur. Levar o volume de fixador para 5 ml e misturar outra vez suavemente por pipetagem com pipeta de Pasteur. As células fixadas podem ser armazenadas no escuro a -20 ° C durante vários meses. </li><li> Centrifugar e aspirar como no passo 2.8. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em fixador fresco; estimar o volume do sedimento e add ~ 10x o volume de fixador de Carnoy. </li><li> Adicionar a suspensão de células gota a gota, no molhado, as lâminas de microscópio geladas; segurar a corrediça a um ângulo de ~ 45 ° e permite que a suspensão de células a fluir sobre a superfície da lâmina. Coloque a lâmina plana sobre toalhas de papel e inundar o slide com fixador e deixar secar ao ar. Verificar as lâminas para a presença de mitose espalha utilizando um microscópio invertido. </li></ol> 3. RNase tratamento e desidratação do etanol <ol><li> Ul local 200, de 10 ug / ml RNase A (Sigma) em 2x SSC para cada lâmina, e incubar a 37 deg; C durante 1 h. </li><li> Lavar as lâminas três vezes com 2x SSC, pH 7,0 à temperatura ambiente durante 3 min cada. </li><li> Desidratar as lâminas por meio de uma série de EtOH (Sigma) (70%, 90% e 100%) à temperatura ambiente durante 3 min cada. </li><li> Secar as lâminas de ar, à temperatura ambiente. </li></ol> 4. Preparação de coquetéis Sonda para BAC Além disso cromossomo específico centrómero Enumeração Probe (CEP) ou para Tintas cromossoma inteiro de hibridização in situ <ol><li> Para a hibridização BAC / CEP simultânea, preparar dois coquetéis sonda separados para pré-hibridização. Nós descobrimos que a pré-hibridação das sondas BAC e CEP separadamente com resultados diferentes stringencies em menos fundo e intensidades mais elevadas de sinal. Verificámos também que Fosmids individuais também pode ser usado no lugar de clones BAC. A formulação cocktail descrito abaixo representa os volumes para um único slide. Se o processamento vários slides usando as mesmas sondas simplesmente aumentar o volume adequado do<html> iately. * BAC DNA cocktail sonda: 11,5 ul de tampão de hibridação (formamida a 50% (Sigma) / 2x SSC Sulfate / dextrano (Sigma)) 2 uL de dH2O 2,5 DNA BAC/Cot1 ul em dH2O (veja abaixo a rotulagem protocolo) 15 do volume total de ul * CEP cocktail sonda: 7 ul de tampão de hibridação CEP (65% Sulfato Formamide/2x SSC / Dextran) 2 uL de dH2O 1 uL de ADN CEP/Cot1 (adquirido prelabeled com Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 ul de volume total de * Depois de desnaturação e hibridização pré-(passo 5.1) mix BAC sonda com CEP sonda em uma relação de 25 03:02 cocktails sonda uL / ​​slide e misture. OU </li><li> Aliquota de 20 ul / lâmina de sonda Whole Chromosome Paint (Cy3/Texas vermelho) em um tubo. Proceder à desnaturação e hibridação pré-passo. </li></ol>&quot;Slide&gt; 5. Desnaturação e sonda e hibridação in situ <ol><li> Desnaturar cocktail sonda (s) a 75 ° C durante 10 min. Pré-hibridação a 37 ° C durante 30 minutos para permitir que o DNA Cot1 para hibridar com sequências repetitivas e para evitar a hibridação subsequente à metafase cromossomas. </li><li> Lâminas desnaturam em frascos Coplin em 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 a 72 ° C durante 3 min. </li><li> Imediatamente desidratar as lâminas por meio de uma série de EtOH (70%, 90% e 100%), em frascos Coplin a 4 ° C durante 3 min cada. </li><li> Permitir que as lâminas para o ar seco à temperatura ambiente. </li><li> Pré-aquecer as lâminas a 45 ° C mais quente na corrediça para a última 10 min da sonda de pré-hibridação (passo 5.1). Misture cocktails pré-hibridizados sonda se necessário e adicionar 25 ul a cada slide, coloque delicadamente uma lamela em cada slide e vedação ao longo de todas as bordas com cimento de borracha. Incubar durante a noite a 37 ° C numa câmara húmida para evitar a evaporação. </li></ol><ol><li> Lavagem das lâminas em frascos Coplin 3 vezes em 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 a 38-40 ° C durante 3 min cada. A temperatura das lavagens pode variar entre as sondas. Se houver a hibridação de fundo elevado é possível aumentar a temperatura das lavagens. Por outro lado, se o sinal for fraco e não há nenhum fundo em seguida, é possível diminuir a temperatura dessas lavagens. </li><li> Wash desliza uma vez em tampão PN à temperatura ambiente por 3 min, e avançar para a etapa de detecção BrdU. </li></ol> 7. BrdU Detecção <ol><li> Bloco desliza com tampão PNM durante 10 minutos (200 ^ l / lâmina), à temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Escorra lâminas girando na borda em uma toalha de papel. Adicionar 100 ul de anti-BrdU-FITC (50 ug / ml ou Millipore Roche) em tampão PNM durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Lavar as lâminas três vezes em tampão PN à temperatura ambiente durante 3 min cada. </li><li> Drenartampão PN em excesso desliza um de cada vez, ligando aresta sobre uma toalha de papel. Adicionar 20 ul de DAPI / Antifade solução de montagem (Invitrogen). Cobrir a lâmina com uma toalha de papel e pressione a lamela para forçar a saída de bolhas de ar e solução de montagem em excesso. Proceder à análise de imagem. </li></ol> 8. Captura de Imagens e quantificar incorporação de BrdU <ol><li> As imagens são capturadas com uma Olympus BX61 microscópio de fluorescência e CCD da câmera Olympus, 100x objetivo, roda de filtros-automática e software Cytovision (Applied Imaging). BrdU é capturado utilizando um filtro FITC; tintas cromossômicas (Texas Red, MetaSystems ou Cytocell), BAC (Cy3) e CEP (Vysis Spectrum Orange) sondas são captadas com uma Red Texas ou Cy3 filtro; DAPI é capturado com um filtro de DAPI (ver As Figuras 2 e 3). </li><li> Cromossomas individuais de interesse são identificadas com BAC / CEP ou sondas específicas para o cromossoma de pintura (Figuras 2B e 3B). Utilizandoo software Cytovision, cada cromossoma de interesse é &quot;cut-out&quot; a partir da propagação da metafase, como um todo, uma linha é desenhada através do ao longo do comprimento do cromossoma do braço curto a longo braço (Figuras 2C e 3C). O software Cytovision é usado para quantificar o perfil de intensidade de pixel ao longo do comprimento de cada cromossoma. O software Cytovision calcula a área ocupada pelos pixels e quantifica a intensidade dos pixels representados pelos sinais de BrdU ou DAPI em cada cromossoma isolado. A intensidade de pixel média representada por cada cromossoma é então multiplicado por a área ocupada pelos pixels para se obter o número total de pixels (Tabela 1 e Figura 4). Além disso, este protocolo permite a visualização das últimas regiões replicação dos cromossomas. Por conseguinte, o padrão de bandas de incorporação de BrdU permite a detecção das regiões activamente replicantes de cromossomas, e as diferenças em temporização entre a replicação cromospares ome são vistas como diferenças neste padrão de bandas (Figuras 2 e 3). Finalmente, estas diferenças nos padrões de ligação podem ser comparados com os mapas de replicação conhecidos de tempo para cada cromossoma 6,7, o que permite uma estimativa da diferença de tempo entre a replicação cromossomas homólogos ou braços cromossoma 4. Por exemplo, o cromossoma dois 6 está na Figura 3A exibir uma diferença no padrão de bandas de&gt; 2 horas quando comparado com o tempo normal de replicação do cromossoma 6 4. Além disso, um procedimento semelhante ao descrito aqui foi usada com sucesso para o estudo do tempo de replicação assíncrona entre os cromossomas X e inactivos activo 8,9. Os cromossomos X ativos e inativos foram identificados utilizando tintas cromossomo X. As imagens foram adquiridas utilizando Quips mFISH software (Vysis) e o número de pixels ocupados pelos cromossomas X e o número de pixels ocupados por fluorescência laBeled BrdU foram então calculados utilizando NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. Nick Tradução de alcoolemia de DNA para marcação fluorescente (Vysis) <ol><li> Adicionar a mistura de sonda que se segue para um tubo de microcentrífuga refrigerada: 70 ul (4 ug de ADN) em dH2O 10 jul 0,2 mM dUTP-laranja ou verde 20 ul 0,1 mM dTTP 20 Buffer de Tradução ul 10x Nick 40 ul NT dNTP (menos dTTP) 40 enzima Tradução ul nick Volume de 200 ul totais Incubar @ 16 ° CO / N. Pare reacção por aquecimento a 70 ° C durante 10 min. Refrigerar em gelo durante 5 min. </li><li> Precipitar o ADN com etanol, adicionando a seguir para a mistura de sonda: 200 ul de solução de sonda 48 ul de NaOAc 3 M 160 Cot1DNA ul (0,25 ug / ul) 1200 uL de EtOH a 100% </li><li> Armazenar a -80 ° C durante 10 min a O / N. </li><li> Gire in frio a 12000 xg durante 20 min. Decantar EtOH. Lavar uma vez com EtOH a 70%. Girar como antes. Decantar EtOH. Ar seco apenas até evapora EtOH. Ressuspender em 40 uL de dH2O para a concentração final de 100 ng / ul de DNA de BAC. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li>
<li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li>
<li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+translocations+with+delayed+replication%3A+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li>
<li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li>
<li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li>
<li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+element%28s%29+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li>
<li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
<li>Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman">http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman</a> (2006).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A preparação dos spreads cromossoma é um passo crítico para o ensaio de replicação de temporização-sucedido descrito aqui. A inclusão de um passo de pré-tratamento antes da colcemida tratamento hipotónico pode auxiliar na frequência e propagação de células em mitose. Nós normalmente expor as células a colcemdi durante 1-3 horas antes da colheita, e usar colcemida, a uma concentração final de 10 ug / ml. No entanto, a inclusão de um passo de pré-tratamento colcemida podem alterar o comprimento de G2 e consequentemente, p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ug / ul </td></tr><tr><td> Nick Tradução Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Espectro laranja dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varia </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP tampão de hibridação </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP tampão de hibridação </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Cromossomo paints </td><td> MetaSystems Grupo </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Olympus BX61 Fluorescente </td><td> Olimpo </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio sistema de software de imagem </td><td> Aplicada imagem </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera Digital </td><td> Olimpo </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Em receitas de hibridação in situ Soluções formamida 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamida * (Sigma) 10 ml SSC 10x 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 com HCl (Sigma) * É importante a utilização de formamida que foi armazenado a -20 ° C. Temperatura de armazenamento prolongado sala vai gerar ácido fórmico e do pH wmal estar muito baixa. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamida (Sigma) 10 ml SSC 10x 15 ml de dH2O pH a 7,0 com HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g Citrato de sódio (Sigma) dH 2 O para o volume PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Fazer uma solução 0,1 M de cada de fosfato de sódio (Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 500 ml). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O para o volume 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O para volume. PN: Ajustar o pH de 0,1 M de Na 2 HP0 4 a pH 8,0 com 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtrar esterilizar e adicionar 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g de leite seco não gordo (Sigma) 25 ml de tampão PN (receita acima) Mistura-se durante 15-20 minutos com agitação constante. 2 vezes girar a 400 xg durante 10 min. Use sobrenadante, e certifique-se de não perturbar as proteínas do leite precipitados. </td></tr></tbody></table>

tempo cromossomo replicando combinado com fluorescente<em&gt; em situ</em&gt; hibridização

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A replicação do ADN de mamíferos inicia em múltiplos locais ao longo de cromossomas, em momentos diferentes durante a fase S, na sequência de um programa de replicação temporal. A especificação do tempo de replicação é pensado para ser um processo dinâmico, regulado por sinais específicos de tecido e de desenvolvimento, que são sensíveis às modificações epigenéticas. No entanto, os mecanismos de regulação, onde e quando inicia a replicação de ADN ao longo de cromossomas permanece pouco compreendido. Cromossomos homólogos geralmente replicar de forma síncrona, no entanto, existem notáveis ​​exceções a esta regra. Por exemplo, em células de mamíferos do sexo feminino de um dos dois cromossomas X torna-se tarde replicação através de um processo conhecido como X inactivação 1. Juntamente com este atraso no tempo de replicação, estimada em 2-3 horas, a maioria dos genes silenciados transcricionalmente em tornar-se um cromossoma X. Além disso, um locus de cis-acting discreta, conhecida como o centro de inactivação X, regula este processo de inactivação X, incluindo thindução e do tempo de replicação atraso no cromossomo X inteiro inativo. Além disso, os rearranjos certas encontrados em células cancerosas e em células expostas à radiação ionizante exibir um atraso significativo no tempo de replicação de&gt; 3 horas que afeta o cromossoma inteiro 2,3. Um trabalho recente de nosso laboratório indicam que a ruptura do discreto cis-acting resultado loci autossômica em um fenótipo extremamente tarde replicante que afeta o cromossomo 4 inteiro. Estudos adicionais &quot;engenharia cromossomo &#39;indicam que os rearranjos cromossômicos determinados que afetam muitos cromossomos resultado diferente neste fenótipo replicação timing anormal, sugerindo que todos os cromossomos de mamíferos contêm discretos cis-agindo loci que controlam a replicação de tempo adequado de cromossomos individuais 5. Aqui, nós apresentamos um método para a análise quantitativa de temporização replicação cromossoma combinada com hibridação in situ fluorescente. Estemétodo permite uma comparação directa de temporização replicação entre cromossomas homólogos dentro da mesma célula, e foi adaptada a partir de 6. Além disso, este método permite a identificação inequívoca dos rearranjos cromossómicos que se correlacionam com alterações no tempo que afectam a replicação do cromossoma inteiro. Este método apresenta vantagens em relação recentemente desenvolvido elevado rendimento matriz de micro-sequenciação ou os protocolos que não pode distinguir entre homólogos alelos presentes no rearranjados e un-rearranjado cromossomas. Além disso, porque o método descrito aqui, avalia células individuais, que podem detectar alterações na temporização cromossoma replicação em rearranjos cromossómicos que estão presentes em apenas uma fracção das células de uma população.

Um exemplo da análise de tempo de replicação para cromossoma 6 humano é mostrada na Figura 2. As células que contêm uma deleção do gene ASAR6 4, localizada em 6q16.1, foram expostas a BrdU durante 5 horas, colhidas para células mitóticas e processados ​​por FISH com sonda de tinta cromossoma 6 (Vysis) e para a incorporação de BrdU. Note-se que há uma diferença significativa no padrão de BrdU bandas entre os dois 6, o que é consistente com um atraso no tempo de replicação de&gt; 2 horas para u...

Um método quantitativo para a análise da replicação do cromossoma de temporização é descrito. O método utiliza a incorporação de BrdU, em combinação com fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridização (FISH) para avaliar a temporização da replicação dos cromossomas de mamíferos. Esta técnica permite a comparação direta dos cromossomos reorganizados e não-reorganizadas dentro da mesma célula.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Esta abordagem experimental combina a incorporação de BRDU com hibridização fluorescente in situ. Para analisar quantitativamente o cronograma de replicação dos cromossomos de mamíferos. Primeiro, incorpore BRDU em células vivas e colete os cromossomos em metáfase.Em seguida, realize hibridação in situ com DNA combinada à coloração sequencial com anticorpo contra BRDU para identificar os cromossomos replicantes individuais. A seguir, utilize microscopia fotônica para capturar imagens dos sinais de hibridação e da incorporação de BRDU em figuras mitóticas individuais. Utilizando o software Cyto Visions, calcule a área e a intensidade dos pixels representados pelos sinais de BRDU ou DPI em cada cromossomo isolado.Os resultados podem quantificar e comparar a incorporação de BRDU em cromossomos rearranjados individuais e seus hólos. Como o método descrito aqui avalia células individuais, ele tem a capacidade de detectar alterações na replicação e no tempo de rearranjos cromossômicos que estão presentes em apenas uma fração das células em uma população, em comparação com os protocolos recentemente desenvolvidos de microarranjo e sequenciamento de DNA de alto rendimento. Este método permite uma comparação direta de cromossomos homólogos localizados na mesma célula.Ele também possui a capacidade de identificar de forma inequívoca rearranjos cromossômicos que afetam a replicação cromossômica. O cronograma de todo o cromossomo demonstrando o procedimento será de Leslie Smith. Uma pesquisadora associada no meu laboratório semeie as células em uma densidade de aproximadamente 70% de confluência em uma placa de cultura de tecidos de 150 milímetros e coloque no incubador de células por 24 horas no momento apropriado.Pontos anteriores à colheita. Reponha o meio com meio completo fresco contendo 10 microgramas por mililitro de BRDU. O tempo de cultivo das células em meio com BRDU varia conforme o tipo celular e a espécie.Normalmente, a fase G2 dura entre duas e cinco horas. Remova o meio de cultura da placa, reservando 10 mililitros em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Enxágue as células com 10 mililitros de sinalização e remova a sinalização remanescente por aspiração a vácuo.Em seguida, adicione cinco mililitros de tripsina 0,25% e incube à temperatura ambiente até que as células se desprendam da placa. Recolha as células e transfira a suspensão para os 10 mililitros de meio reservado. Peline as células por centrifugação e aspire todo o meio, exceto 0,5 mililitros.Agora, ressuspenda completamente as células usando uma pipetagem para promover o inchaço osmótico das células; adicione três gotas de cloreto de potássio 75 milimolar aquecido a 37 graus Celsius e misture a suspensão celular com uma pipetagem. Em seguida, incorpore um volume adicional de 0,5 mililitros de solução hipotônica. Agora, complete o volume total da solução hipotônica até cinco mililitros e misture por meio de pipetagem.Incube a suspensão celular a 37 graus Celsius por 20 a 45 minutos, dependendo do tipo celular. Incube os tubos em posição inclinada para manter as células em suspensão. Em seguida, centrifugue a 400 vezes G por 10 minutos.Aspire todo o sobrenadante, exceto 0,5 milímetros, e use uma pipeta de vidro para ressuspender suavemente o pellet celular. Neste ponto, as células osmoticamente inchadas serão frágeis, portanto deve-se ter cuidado para não romper as membranas citoplasmáticas. Em seguida, adicione três gotas de carnoy, fixador, e misture suavemente.Após adicionar mais 0,5 mililitros de fixador, complete o volume de fixador até cinco mililitros e pipete para obter uma suspensão celular homogênea. Essas células fixadas podem ser armazenadas no escuro a menos 20 graus Celsius por vários meses. Recolha as células fixadas por centrifugação, aspire o fixador e ressuspenda o pellet em 10 volumes de fixador mantido em gelo, frio para microscopia.Deslize em um ângulo aproximado de 45 graus. Adicione a suspensão celular gota a gota para espalhar a suspensão. Cubra completamente a lâmina com fixador e remova o excesso.Em seguida, coloque a lâmina plana sobre toalhas de papel para secar ao ar. Avalie as amostras quanto à presença de espalhamentos mitóticos utilizando um microscópio invertido. Adicione dois microlitros de 10 microgramas por mililitro de RNAsa A em dois XSSC a cada lâmina e incube a 37 graus Celsius por uma hora.Realize três lavagens de três minutos com XSSC 2x pH 7,0 em temperatura ambiente. Em seguida, desidrate as amostras por meio de uma série de etanol em temperatura ambiente por três minutos. Após isso, seque ao ar cada amostra em temperatura ambiente em um tubo microcêntrifuga refrigerado.Adicione quatro microgramas de substrato de DNA com nucleotídeo marcado, tampão de tradução NIC 10 X, mistura de dNTPs e enzima de tradução NIC. Incube a reação a 16 graus Celsius durante a noite e aqueça a 70 graus Celsius por 10 minutos para interromper a reação. Em seguida, resfrie em gelo por cinco minutos.Agora, para precipitar o DNA com etanol, adicione 48 microlitros de acetato de sódio 3 M, 160 microlitros de 0,25 microgramas por microlitro de DNA cot-1 e 1,2 mililitro de etanol a 100%. Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativos por 10 minutos até precipitação noturna do DNA por centrifugação e lave o pellet com etanol a 70%. Re-suspenda a sonda de DNA seca ao ar em 40 microlitros de água bidestilada para uma concentração final de 100 nanogramas por microlitro de DNA marcado para hibridização simultânea back-SEP. Prepare dois coquetéis de sonda separados contendo cot-1 DNA conforme detalhado no manuscrito acompanhante.Denaature os coquetéis de sonda a 75 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para hibridar o DNA cot 1 com sequências repetitivas. Agora, combine a sonda de bloqueio com a sonda S numa proporção de três para dois, utilizando 25 microlitros por amostra.Deslize ao lado para desnaturar as amostras. Mergulhe as lâminas em 70% formamida duas vezes SSC a 72 graus Celsius e incube por três minutos. Desidrate imediatamente as amostras por meio de uma série de etanol a quatro graus Celsius durante três minutos.Deixe cada amostra secar ao ar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos antes da conclusão da preparação da sonda. Equilibre as lâminas em um aquecedor de lâminas a 45 graus Celsius. Em seguida, adicione 25 microlitros da mistura da sonda back S.Posicione suavemente uma lamínula sobre cada lâmina e feche todas as bordas com cola de borracha para a etapa de hibridização. Incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada. Realize três lavagens pós-hibridização de três minutos cada em 50%IDE dois XSSC pH 7,0 a 38-40 graus Celsius.A temperatura ideal das lavagens depende da sonda. Se houver hibridização com fundo elevado, aumente a temperatura das lavagens. Inversamente, se o sinal da sonda for fraco e não houver fundo, diminua a temperatura das lavagens.Realize uma lavagem no tampão PN, à temperatura ambiente, durante três minutos. Para a detecção de BRDU, adicione 200 microlitros de tampão bloqueador PNM a cada lâmina. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente, no escuro, e depois drenar as lâminas sobre uma toalha de papel.Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo conjugado anti-B-R-D-U-F-E a 50 microgramas por mililitro e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Realize três lavagens de três minutos em tampão PN à temperatura ambiente. Remova o excesso de tampão PN de cada lâmina.Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de montagem dappy Antifa. Cubra a lâmina com uma toalha de papel e pressione a lamínula para expulsar bolhas de ar e o excesso de solução de montagem. Capture as imagens com um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera CCD.Utilizando o objetivo de 100x, a roda automática de filtros e o software Cyto Vision, capture o BrdU com um filtro fitzy e as pinturas cromossômicas e as sondas de centrômero com um filtro side three ou Texas red. Utilize também um filtro dappy para coloração dos núcleos. Identifique os cromossomos individuais de interesse com sondas de pintura EP ou sondas específicas para cromossomos no software Cyto Vision.Recorte cada cromossomo de interesse da extensão metafásica como um todo. Copie e cole as imagens dos cromossomos DPI e FITZY em uma nova janela. Selecione o ícone de gráfico no menu de ferramentas, que permite a geração de um gráfico representando a área e a intensidade das marcações Fitz e dappy ao longo de cada cromossomo individual.Isso é feito traçando uma linha ao longo do comprimento do cromossomo, do braço curto ao braço longo. No menu de ferramentas, selecione o ícone de dados e gere uma tabela exibindo a área calculada e a intensidade para ZI e dpi. Em seguida, selecione os sinais de ZI e DPI para os cromossomos de interesse.Em seguida, clique nos botões intensidade e área no ícone de tabela. O software gera uma medida numérica de pixels por polegada quadrada para cada sinal. Depois, a intensidade média dos pixels de cada cromossomo é multiplicada pela área ocupada por esses pixels.Para obter o número total de pixels para a visualização das regiões cromossômicas mais recentemente replicadas, avalie o padrão de incorporação de BRDU nas regiões cromossômicas em replicação ativa. Em seguida, calcule as diferenças no tempo de replicação entre pares de cromossomos com base nas diferenças no padrão de bandamento de BRDU. Os cromossomos em células de mamíferos replicam-se de acordo com um programa temporal, no qual a replicação precoce e tardia ocorre respectivamente no início e no final da fase S.Uma fase S típica em células de mamíferos dura de oito a 10 horas, e a fase G2 geralmente dura de duas a cinco horas. Neste sistema experimental, o BRDU é adicionado por períodos crescentes de tempo para marcar as últimas porções dos cromossomos que se replicam; essas células contêm uma deleção do gene humano ASAR6 localizado em 6q16.1. Após um tratamento de cinco horas com BRDU, células em mitose foram coletadas e processadas para detecção da incorporação de BRDU e hibridização fluorescente in situ utilizando uma sonda de pintura para o cromossomo 6; os dois cromossomos 6 exibem três marcas fluorescentes.A diferença significativa no padrão de bandamento de BRDU é consistente com o atraso no tempo de replicação de mais de duas horas para um dos cromossomos seis. O software Cyto vision mostra os perfis de intensidade de sinal diferentes para DPI e BRDU nos dois cromossomos seis, indicativos de replicação assíncrona. Além disso, há uma diferença significativa na quantidade total de incorporação de BRDU quando comparada a uma análise semelhante da coloração com DPI.A inclusão de uma sonda traseira contendo o gene AR humano seis destaca o único cromossomo seis que possui uma deleção em seu braço longo nesta célula. Curiosamente, há uma incorporação mais intensa de BRDU e um padrão de bandamento mais estendido da incorporação de BRDU em comparação com o cromossomo seis não-ED. Quando espalhamentos mitóticos de sete células diferentes foram processados para quantificação da diferença no tempo de replicação entre os cromossomos seis.Os níveis de BRDU mostram uma diferença superior a duas vezes entre os valores totais de pixels para os cromossomos seis deletados e não-ED. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada corretamente em três dias. Esperamos que você agora tenha uma boa compreensão de como medir a replicação, o tempo de replicação de cromossomos homólogos localizados na mesma célula e identificar de forma inequívoca rearranjos cromossômicos que se correlacionam com alterações na replicação.Temporização de cromossomos inteiros.

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Schumacher, D., e Sogaard-Andersen, L. Imagem de Células Vivas por Fluorescência do Ciclo Celular Vegetativo Completo da Bactéria Social de Crescimento Lento Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o uso de imagens de células vivas para rastrear as origens dos cromossomos marcados com fluorescência durante a divisão celular bacteriana. Ela captura a dinâmica da segregação cromossômica usando microscopia de contraste de fase em time-lapse e fluorescência.

Imagem em lapso de tempo da segregação cromossômica em bactérias marcadas fluorescentemente

Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite a detecção de ácidos nucleicos no seu ambiente nativo dentro das células. Nós aqui descrever um protocolo para o combinado, a detecção simultânea de RNA e DNA, por meio de FISH, que pode ser usado para estudar inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Desenvolvemos um protocolo de hibridização in situ fluorescente (FISH) específico para fitas facilmente personalizado combinado com imunofluorescência. Isso permite um exame detalhado da dinâmica do RNA com visão simultânea da estrutura da cromatina, organização nuclear e regulação transcricional no nível de célula única.

Fluorescent Rápida In Situ Protocolo de hibridação para Xist RNA combinado com imunofluorescência de Histone Modificação na inativação do cromossomo X

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

Descrevemos aqui um sistema que utiliza um bloco de proteína in vivo reversível e específico do local para parar e colapsar garfos de replicação em Escherichia coli. O estabelecimento do bloco de replicação é avaliado por microscopia de fluorescência e eletroforese em gel de agarose bidimensional neutro-neutro é usada para visualizar intermediários de replicação.

Induzir um bloqueio de replicação de site específico no<i&gt; E. coli</i&gt; Usando um sistema fluorescente repressor de operador

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi  Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.

Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I

Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Este protocolo descreve uma aplicação de fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) para medir a cinética in vivo da síntese e degradação do mRNA.

Sondando cinética mRNA no espaço e no tempo em Escherichia coli usando fluorescência de molécula única de duas cores na hibridização situ

Este protocolo ilustra um sistema de dimerização de proteínas quimicamente induzido para criar condensados na cromatina.  Demonstra-se a formação de corpo nuclear de leucemia promielolítica (PML) em telômeros com dimerizadores químicos. O crescimento, a dissolução, a localização e a composição são monitoradas com imagem de células vivas, imunofluorescência (IF) e fluorescência na hibridização situ (FISH).

Condensados de proteína induzidas por dimerização química em telômeros

Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.

Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica

Aprenda a analisar o tempo de replicação cromossômica em células mamíferas usando incorporação de BrdU e hibridização in situ fluorescente (FISH). Este método permite comparações diretas entre cromossomos rearranjados e normais.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente

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