Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente

Esta abordagem experimental combina a incorporação de BRDU com hibridização fluorescente in situ. Para analisar quantitativamente o cronograma de replicação dos cromossomos de mamíferos. Primeiro, incorpore BRDU em células vivas e colete os cromossomos em metáfase.

Em seguida, realize hibridação in situ com DNA combinada à coloração sequencial com anticorpo contra BRDU para identificar os cromossomos replicantes individuais. A seguir, utilize microscopia fotônica para capturar imagens dos sinais de hibridação e da incorporação de BRDU em figuras mitóticas individuais. Utilizando o software Cyto Visions, calcule a área e a intensidade dos pixels representados pelos sinais de BRDU ou DPI em cada cromossomo isolado.

Os resultados podem quantificar e comparar a incorporação de BRDU em cromossomos rearranjados individuais e seus hólos. Como o método descrito aqui avalia células individuais, ele tem a capacidade de detectar alterações na replicação e no tempo de rearranjos cromossômicos que estão presentes em apenas uma fração das células em uma população, em comparação com os protocolos recentemente desenvolvidos de microarranjo e sequenciamento de DNA de alto rendimento. Este método permite uma comparação direta de cromossomos homólogos localizados na mesma célula.

Ele também possui a capacidade de identificar de forma inequívoca rearranjos cromossômicos que afetam a replicação cromossômica. O cronograma de todo o cromossomo demonstrando o procedimento será de Leslie Smith. Uma pesquisadora associada no meu laboratório semeie as células em uma densidade de aproximadamente 70% de confluência em uma placa de cultura de tecidos de 150 milímetros e coloque no incubador de células por 24 horas no momento apropriado.

Pontos anteriores à colheita. Reponha o meio com meio completo fresco contendo 10 microgramas por mililitro de BRDU. O tempo de cultivo das células em meio com BRDU varia conforme o tipo celular e a espécie.

Normalmente, a fase G2 dura entre duas e cinco horas. Remova o meio de cultura da placa, reservando 10 mililitros em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Enxágue as células com 10 mililitros de sinalização e remova a sinalização remanescente por aspiração a vácuo.

Em seguida, adicione cinco mililitros de tripsina 0,25% e incube à temperatura ambiente até que as células se desprendam da placa. Recolha as células e transfira a suspensão para os 10 mililitros de meio reservado. Peline as células por centrifugação e aspire todo o meio, exceto 0,5 mililitros.

Agora, ressuspenda completamente as células usando uma pipetagem para promover o inchaço osmótico das células; adicione três gotas de cloreto de potássio 75 milimolar aquecido a 37 graus Celsius e misture a suspensão celular com uma pipetagem. Em seguida, incorpore um volume adicional de 0,5 mililitros de solução hipotônica. Agora, complete o volume total da solução hipotônica até cinco mililitros e misture por meio de pipetagem.

Incube a suspensão celular a 37 graus Celsius por 20 a 45 minutos, dependendo do tipo celular. Incube os tubos em posição inclinada para manter as células em suspensão. Em seguida, centrifugue a 400 vezes G por 10 minutos.

Aspire todo o sobrenadante, exceto 0,5 milímetros, e use uma pipeta de vidro para ressuspender suavemente o pellet celular. Neste ponto, as células osmoticamente inchadas serão frágeis, portanto deve-se ter cuidado para não romper as membranas citoplasmáticas. Em seguida, adicione três gotas de carnoy, fixador, e misture suavemente.

Após adicionar mais 0,5 mililitros de fixador, complete o volume de fixador até cinco mililitros e pipete para obter uma suspensão celular homogênea. Essas células fixadas podem ser armazenadas no escuro a menos 20 graus Celsius por vários meses. Recolha as células fixadas por centrifugação, aspire o fixador e ressuspenda o pellet em 10 volumes de fixador mantido em gelo, frio para microscopia.

Deslize em um ângulo aproximado de 45 graus. Adicione a suspensão celular gota a gota para espalhar a suspensão. Cubra completamente a lâmina com fixador e remova o excesso.

Em seguida, coloque a lâmina plana sobre toalhas de papel para secar ao ar. Avalie as amostras quanto à presença de espalhamentos mitóticos utilizando um microscópio invertido. Adicione dois microlitros de 10 microgramas por mililitro de RNAsa A em dois XSSC a cada lâmina e incube a 37 graus Celsius por uma hora.

Realize três lavagens de três minutos com XSSC 2x pH 7,0 em temperatura ambiente. Em seguida, desidrate as amostras por meio de uma série de etanol em temperatura ambiente por três minutos. Após isso, seque ao ar cada amostra em temperatura ambiente em um tubo microcêntrifuga refrigerado.

Adicione quatro microgramas de substrato de DNA com nucleotídeo marcado, tampão de tradução NIC 10 X, mistura de dNTPs e enzima de tradução NIC. Incube a reação a 16 graus Celsius durante a noite e aqueça a 70 graus Celsius por 10 minutos para interromper a reação. Em seguida, resfrie em gelo por cinco minutos.

Agora, para precipitar o DNA com etanol, adicione 48 microlitros de acetato de sódio 3 M, 160 microlitros de 0,25 microgramas por microlitro de DNA cot-1 e 1,2 mililitro de etanol a 100%. Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativos por 10 minutos até precipitação noturna do DNA por centrifugação e lave o pellet com etanol a 70%. Re-suspenda a sonda de DNA seca ao ar em 40 microlitros de água bidestilada para uma concentração final de 100 nanogramas por microlitro de DNA marcado para hibridização simultânea back-SEP. Prepare dois coquetéis de sonda separados contendo cot-1 DNA conforme detalhado no manuscrito acompanhante.

Denaature os coquetéis de sonda a 75 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 30 minutos para hibridar o DNA cot 1 com sequências repetitivas. Agora, combine a sonda de bloqueio com a sonda S numa proporção de três para dois, utilizando 25 microlitros por amostra.

Deslize ao lado para desnaturar as amostras. Mergulhe as lâminas em 70% formamida duas vezes SSC a 72 graus Celsius e incube por três minutos. Desidrate imediatamente as amostras por meio de uma série de etanol a quatro graus Celsius durante três minutos.

Deixe cada amostra secar ao ar à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos antes da conclusão da preparação da sonda. Equilibre as lâminas em um aquecedor de lâminas a 45 graus Celsius. Em seguida, adicione 25 microlitros da mistura da sonda back S.

Posicione suavemente uma lamínula sobre cada lâmina e feche todas as bordas com cola de borracha para a etapa de hibridização. Incube as amostras durante a noite a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada. Realize três lavagens pós-hibridização de três minutos cada em 50%IDE dois XSSC pH 7,0 a 38-40 graus Celsius.

A temperatura ideal das lavagens depende da sonda. Se houver hibridização com fundo elevado, aumente a temperatura das lavagens. Inversamente, se o sinal da sonda for fraco e não houver fundo, diminua a temperatura das lavagens.

Realize uma lavagem no tampão PN, à temperatura ambiente, durante três minutos. Para a detecção de BRDU, adicione 200 microlitros de tampão bloqueador PNM a cada lâmina. Incube por 10 minutos à temperatura ambiente, no escuro, e depois drenar as lâminas sobre uma toalha de papel.

Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo conjugado anti-B-R-D-U-F-E a 50 microgramas por mililitro e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Realize três lavagens de três minutos em tampão PN à temperatura ambiente. Remova o excesso de tampão PN de cada lâmina.

Em seguida, adicione 20 microlitros de solução de montagem dappy Antifa. Cubra a lâmina com uma toalha de papel e pressione a lamínula para expulsar bolhas de ar e o excesso de solução de montagem. Capture as imagens com um microscópio de fluorescência acoplado a uma câmera CCD.

Utilizando o objetivo de 100x, a roda automática de filtros e o software Cyto Vision, capture o BrdU com um filtro fitzy e as pinturas cromossômicas e as sondas de centrômero com um filtro side three ou Texas red. Utilize também um filtro dappy para coloração dos núcleos. Identifique os cromossomos individuais de interesse com sondas de pintura EP ou sondas específicas para cromossomos no software Cyto Vision.

Recorte cada cromossomo de interesse da extensão metafásica como um todo. Copie e cole as imagens dos cromossomos DPI e FITZY em uma nova janela. Selecione o ícone de gráfico no menu de ferramentas, que permite a geração de um gráfico representando a área e a intensidade das marcações Fitz e dappy ao longo de cada cromossomo individual.

Isso é feito traçando uma linha ao longo do comprimento do cromossomo, do braço curto ao braço longo. No menu de ferramentas, selecione o ícone de dados e gere uma tabela exibindo a área calculada e a intensidade para ZI e dpi. Em seguida, selecione os sinais de ZI e DPI para os cromossomos de interesse.

Em seguida, clique nos botões intensidade e área no ícone de tabela. O software gera uma medida numérica de pixels por polegada quadrada para cada sinal. Depois, a intensidade média dos pixels de cada cromossomo é multiplicada pela área ocupada por esses pixels.

Para obter o número total de pixels para a visualização das regiões cromossômicas mais recentemente replicadas, avalie o padrão de incorporação de BRDU nas regiões cromossômicas em replicação ativa. Em seguida, calcule as diferenças no tempo de replicação entre pares de cromossomos com base nas diferenças no padrão de bandamento de BRDU. Os cromossomos em células de mamíferos replicam-se de acordo com um programa temporal, no qual a replicação precoce e tardia ocorre respectivamente no início e no final da fase S.

Uma fase S típica em células de mamíferos dura de oito a 10 horas, e a fase G2 geralmente dura de duas a cinco horas. Neste sistema experimental, o BRDU é adicionado por períodos crescentes de tempo para marcar as últimas porções dos cromossomos que se replicam; essas células contêm uma deleção do gene humano ASAR6 localizado em 6q16.1. Após um tratamento de cinco horas com BRDU, células em mitose foram coletadas e processadas para detecção da incorporação de BRDU e hibridização fluorescente in situ utilizando uma sonda de pintura para o cromossomo 6; os dois cromossomos 6 exibem três marcas fluorescentes.

A diferença significativa no padrão de bandamento de BRDU é consistente com o atraso no tempo de replicação de mais de duas horas para um dos cromossomos seis. O software Cyto vision mostra os perfis de intensidade de sinal diferentes para DPI e BRDU nos dois cromossomos seis, indicativos de replicação assíncrona. Além disso, há uma diferença significativa na quantidade total de incorporação de BRDU quando comparada a uma análise semelhante da coloração com DPI.

A inclusão de uma sonda traseira contendo o gene AR humano seis destaca o único cromossomo seis que possui uma deleção em seu braço longo nesta célula. Curiosamente, há uma incorporação mais intensa de BRDU e um padrão de bandamento mais estendido da incorporação de BRDU em comparação com o cromossomo seis não-ED. Quando espalhamentos mitóticos de sete células diferentes foram processados para quantificação da diferença no tempo de replicação entre os cromossomos seis.

Os níveis de BRDU mostram uma diferença superior a duas vezes entre os valores totais de pixels para os cromossomos seis deletados e não-ED. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada corretamente em três dias. Esperamos que você agora tenha uma boa compreensão de como medir a replicação, o tempo de replicação de cromossomos homólogos localizados na mesma célula e identificar de forma inequívoca rearranjos cromossômicos que se correlacionam com alterações na replicação.

Temporização de cromossomos inteiros.