Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

O objetivo geral deste procedimento é trazer o conjunto de programas 3D NA para cientistas de laboratório e outros para investigar a organização espacial de DNA e RNA com ferramentas computacionais de última geração. Isso é feito primeiro baixando o software do fórum 3D NA e instalando-o em um computador local. O segundo passo é analisar uma estrutura de DNA representativa no nível das etapas do par de bases constituintes.

Em seguida, a mesma estrutura de DNA é modificada no nível da etapa do par de bases e é reconstruída usando os parâmetros da etapa do par de bases recém-definidos. A etapa subsequente é a análise de um grande conjunto de estruturas relacionadas. A etapa final é o alinhamento de um conjunto de estruturas de DNA relacionadas em um quadro de referência comum, a fim de visualizar distorções globais das estruturas.

Em última análise, as ferramentas 3D NA são usadas para examinar como as etapas individuais do par de bases, incluindo aquelas ligadas a drogas e proteínas, contribuem para o dobramento geral do DNA e para identificar os locais e direções de distorções globais consideráveis. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que o software é robusto e amplamente aplicável a uma variedade de diferentes estruturas contendo ácidos nucléicos. O método pode ajudar a responder a questões-chave em bioquímica e biofísica, como a forma como os genomas são organizados em três dimensões e que tipo de deformação o DNA pode adotar.

Para iniciar a instalação do pacote de software, conecte-se aos três DA website@xthreed. org e clique no link para o fórum 3D NA dentro do fórum. Selecione o link de registro e siga as instruções para criar uma nova conta.

Depois que um nome de usuário e senha forem estabelecidos, faça login no fórum, selecione o link de downloads na seção de boas-vindas e, na nova página, escolha Download 3D NA. Clique duas vezes no arquivo tar gz para criar uma pasta chamada X 3D NA dash V 2.1, que contém o software 3D NA. Abra o aplicativo de terminal, normalmente encontrado em utilitários em um Macintosh, e mude para o diretório X 3D NA dash V 2.1.

Execute o script de configuração necessário para que o 3D NA funcione corretamente. Todos os comandos usados neste vídeo podem ser encontrados no protocolo de texto. Em seguida, copie as configurações de exportação de duas linhas que aparecem impressas na tela.

Se o usuário colocou o software no diretório de aplicativos, as duas linhas devem aparecer como mostrado aqui. Abra o aplicativo de edição de texto encontrado no diretório de aplicativos. No menu de formatação, selecione Criar texto sem formatação.

Se existir um arquivo BRC, abra o arquivo em texto, edite e cole as configurações de exportação no final do arquivo. Se não, o arquivo bash RC existe, cole as configurações de exportação em um arquivo em branco e salve com o nome de arquivo bash RC no diretório inicial. Para que as novas configurações estejam disponíveis, execute o arquivo Bash RC recém-salvo no programa de terminal.

Este vídeo demonstra a análise de uma estrutura representativa de ácido nucleico, o DNA ligado à proteína HBB do olho da bactéria Borrelia bergdorf. O primeiro passo na análise 3D NA é a criação de um arquivo que lista todas as bases emparelhadas. Isso é feito digitando um comando para aplicar o programa Find para à estrutura atômica armazenada no arquivo para NP dois, MP dois pdb.

O próximo passo na análise é determinar os parâmetros geométricos que caracterizam a estrutura. O comando analyze usa como entrada o arquivo de par base e cria vários arquivos de saída que aparecem no diretório de trabalho. Os valores geométricos podem então ser calculados digitando, analisar dois MP dois bps.

Os arquivos de saída gerados incluem dois MP two out, que contém uma visão geral dos parâmetros calculados e bpco step par, que contém uma lista dos parâmetros de corpo rígido, além da análise de uma estrutura de ácido nucleico, o software 3D NA fornece a capacidade de construir um modelo estrutural a partir de parâmetros de corpo rígido usando o comando reconstruir para criar um modelo atômico aproximado, que inclui coordenadas para átomos de base e espinha dorsal. Digite o comando listado no texto. Este comando instrui o 3D NA a introduzir uma confirmação de backbone BDNA padrão na construção de modelos a partir de parâmetros de corpo rígido.

Um modelo de dupla hélice com os parâmetros de corpo rígido encontrados na estrutura H-B-B-D-N-A pode então ser construído digitando o comando apropriado. O arquivo bpco step par pode ser editado para gerar uma estrutura modificada. Aqui, os ângulos extremos de rolagem formados nos dois locais de maior flexão são modificados.

A estrutura é então construída com o conjunto modificado de parâmetros de etapa como o arquivo de entrada. Os dois modelos podem ser visualizados com um visualizador molecular padrão, em contraste com a análise de uma única estrutura contendo ácido nucleico. Esta parte do vídeo mostrará como analisar um grande conjunto de estruturas em um conjunto de arquivos, começando com os nomes MD sublinhado definir um PDB e terminando com um número.

O primeiro passo na análise é a identificação das bases emparelhadas obtidas executando o programa find pair como antes, uma vez que todo o conjunto de estruturas compartilha o mesmo esquema de emparelhamento de bases, é necessário executar find pair uma vez em um arquivo representativo aqui, o arquivo terminando com 1001. Isso gera as informações de emparelhamento de base e as armazena no arquivo MD no conjunto um BPS PS. A próxima etapa encontra os parâmetros geométricos de todo o conjunto de estruturas usando o conjunto ncore Command X 3D. Analisar. Em seguida, os parâmetros de corpo rígido desejados podem ser extraídos do arquivo de saída de visão geral MD no primeiro conjunto.

Isso é feito usando o extrato de conjunto de três DCO do Comando X. Os ângulos de rolagem são extraídos e um arquivo de texto separado por vírgulas dos ângulos de rolagem é criado. Este arquivo pode ser lido em outros programas para análise e plotagem posteriores.

A versão mais recente do 3D NA tem um novo recurso que permite ao usuário olhar para várias estruturas de uma perspectiva comum. O comando de reorientação do conjunto X três DCO sobrepõe uma coleção de estruturas relacionadas em um par de bases comum ou etapa de par de bases, como nos protocolos anteriores. O primeiro passo é calcular o emparelhamento de bases do DNA com o programa de busca de pares.

Neste caso, o arquivo de entrada é dois KEK pdb o arquivo contendo as 10 estruturas do CIA coli, O operador 3D NA ligado ao capacete da proteína repressora LAC. A reorientação do conjunto de três DCOs do Command X alinhará os modelos individuais em uma estrutura de vários modelos em um quadro de referência comum. Esse comando requer o arquivo PDB e o arquivo de emparelhamento base da etapa anterior como entrada.

Também está incluída no comando a identidade da etapa do par base contra a qual todas as estruturas estão alinhadas. A interface web do W 3D NA inclui alguns recursos populares do pacote de software 3D NA. Esta parte do vídeo chama a atenção para a capacidade de construir modelos tridimensionais de DNA decorado com proteínas com o servidor web.

O primeiro passo na construção de um modelo de DNA decorado com proteínas é visitar o site da W 3D NA localizado na W três d.rutgers.edu. A seleção de reconstrução no menu no canto superior esquerdo da página ativa os recursos de criação de modelos online. O próximo passo é selecionar o link do modelo de DNA de proteína vinculado encontrado na caixa levemente sombreada no meio da nova página.

Esta seleção ativará um menu suspenso, que permite ao usuário especificar o número de proteínas ligadas. A seleção do número de proteínas ligadas leva a uma nova página de especificações. O usuário pode digitar ou colar na sequência desejada.

Na caixa de texto, no meio da nova página, há um menu suspenso abaixo da caixa de texto para selecionar a confirmação helicoidal das regiões não ligadas do DNA. Há uma caixa de texto perto da parte inferior da página de especificação para inserir as posições de ligação e os nomes dos arquivos das proteínas ligadas. A posição de ligação especifica a localização do centro do fragmento ligado à proteína na sequência de DNA.

Na parte inferior da página de especificações, há uma caixa que permite ao usuário gerar uma visualização do DNA ligado à proteína. Nesse caso, essa caixa é marcada e o botão continuar é clicado. Essa ação gera uma página de revisão listando os parâmetros selecionados, bem como quaisquer erros que possam ter surgido da sobreposição dos sites de vinculação selecionados.

O usuário pode selecionar o botão Voltar se alguma alteração precisar ser feita ou o botão de compilação para continuar. A próxima página exibe uma imagem estática do complexo de proteínas de DNA em seu arranjo mais extenso e permite a visualização interativa on-line via web. O usuário também pode baixar um arquivo contendo coordenadas atômicas.

As ferramentas de software 3D NA são usadas rotineiramente para analisar estruturas de ácidos nucleicos. Os valores dos parâmetros do corpo rígido revelam distorções na estrutura tridimensional, como os dois locais de flexão extrema do DNA no sulco principal com grandes ângulos de rolagem positivos encontrados nas etapas 13 e 22. No complexo cristalino do DNA com a proteína Borrelia Bergdorf, RHBB.

A capacidade do software de reconstruir estruturas a partir dessas quantidades torna possível determinar como as etapas individuais de base e par de bases contribuem para a dobra molecular geral. Conforme ilustrado aqui, a curvatura global do DNA induzida pelo HBB reflete mais do que as duas distorções extremas de papel observadas acima. O DNA permanece altamente curvo quando reconstruído com essas etapas do par de bases endireitadas.

É quando os dois maiores valores da função foram definidos como zero. A nova capacidade do 3D NA para examinar um grande número de estruturas relacionadas torna possível extrair padrões dependentes de sequência e tempo nos arranjos espaciais de moléculas de DNA e RNA simuladas. Por exemplo, o revestimento de cor amarela dos ângulos de rolagem entre pares de bases sucessivos em dois grandes conjuntos de estruturas de DNA simuladas revela a curvatura preferencial dessas moléculas nas etapas do par de bases de purina do Permiano.

Os valores mais altos de rolagem representados em vermelho que persistem por curtos períodos nas extremidades do DNA são sugestivos de fusão localizada e reajoelhar da estrutura de dupla hélice. Os padrões variacionais de outros parâmetros de corpo rígido, como os ângulos e distâncias entre bases complementares, podem ajudar a decifrar as distorções estruturais precisas. A capacidade do software 3D NA de reorientar moléculas relacionadas em um quadro de referência comum revela características da estrutura geral ocultas em muitos dos arquivos armazenados no banco de dados de proteínas.

Por exemplo, o alinhamento convencional de estruturas relacionadas com base em um ajuste quadrático médio dos átomos correspondentes produz uma série de vias espaciais semelhantes que se sobrepõem aproximadamente umas às outras aqui, os 10 modelos baseados em RMN da Esia coli, O operador 3D NA ligado às peças da cabeça da proteína repressora LAC, A superposição das mesmas estruturas em um quadro de coordenadas comum nos cinco pares de bases de terminais primos de cada duplex revela distorções consideráveis da estrutura global nas quais as moléculas se flexionam em direções consideravelmente diferentes. A variabilidade estrutural pode influenciar a facilidade com que a proteína repressora CIA coli LAC se liga a O três e induz uma alça entre O três e operadores sequencialmente distantes na operação LAC. Conforme ilustrado aqui, a colocação precisa de uma proteína arquitetônica como HBB de Borrelia burgdorferi pode ter um efeito dramático no dobramento geral do DNA.

Se duas cópias da estrutura de alta resolução conhecida são separadas por 43 pares de bases, um fragmento de DNA de 81 pares de bases se fecha em uma configuração quase circular. Se as duas proteínas forem separadas por cinco pares de bases adicionais, o DNA segue um caminho sinuoso aberto. Os arranjos muito diferentes da proteína decorada duplex mostram como o espaçamento das proteínas arquitetônicas pode afetar a ciclização ou looping do DNA após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia estrutural de ácidos nucleicos explorarem as interações de proteínas de DNA, RNA, dobramento e design de nanopartículas, a fim de obter uma melhor compreensão de defeitos de desenvolvimento e doenças como câncer e projetar novas terapêuticas.