Name: Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Aprenda o transplante autólogo de condrócitos assistido por matriz para reparo de lesões condrais em joelho de coelho. Esta técnica demonstra resultados promissores na regeneração de cartilagem articular.

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Este projeto foi financiado pela Associação Alemã de Pesquisa (DFG, HE 4578/3-1).

A. Cartilagem Biópsia (Room Cirurgia; passos 1-5 na sala de preparação não-estéril) <ol><li> Realizar um controlo de peso final do coelho (coelho branco da Nova Zelândia, fêmea, 3,5-4,0 kg de peso corporal, 6 meses de idade) a fim de ser capaz de drogas de dose adequada e para monitorar o peso após a cirurgia. </li><li> Induzir a anestesia ao coelho por uma injecção intravenosa de 10 mg / kg de propofol. </li><li> Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg por via intravenosa de fentanil. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca. </li><li> Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele. </li><li> Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada. </li><li> Palpar a patela e realizar uma incisão medial da patela. </li><li> Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Tente evitar qualquer corte pequeno suvasos sanguíneos perficial. </li><li> Deslocar a patela lateralmente. </li><li> Inspecione a articulação do joelho para eventuais anomalias e lesões de cartilagem macroscópicos. </li><li> Retire cuidadosamente pequenos pedaços de cartilagem (2-3 mm) para fora da tróclea femoral ossis com um bisturi estéril (Figura 1). </li><li> Colocar imediatamente estas biópsias da cartilagem num tubo de 50 ml com meio completo (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para continuar com o direito em cultura in vitro, após a operação. </li><li> Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril. </li><li> Mude a posição da patela dentro do sulco da tróclea. </li><li> Fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl). Use material de sutura absorvível. </li><li> Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água. </li></ol> B. In vitro Cultura <ol><li> Processar a biópsia cpeças artilage o mais rapidamente possível após a operação em um fluxo laminar tecido capa de cultura estéril. </li><li> Lava-se a estéril colhida cartilagem 2x em PBS com subsequente centrifugação a 500 xg durante 3 minutos, à TA. </li><li> Cortar cartilagem em pedaços de 1 mm, 3, a transferência para um Falcon de 50 ml e digerem num agitador durante 30 min com 10 ml de tripsina-EDTA (0,25%) e 10 ml de PBS durante 30 min </li><li> Após 30 minutos, parar a tripsinização adicionando meio completo. Então, agite as peças de cartilagem para o outro para 12 horas com colagenase A (0,21 U / mg) em meio livre de soro (DMEM + 1% Pen / Strep). </li><li> Centrifugar a solução resultante a 170 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender sedimentos celulares em 5 ml de meio completo. </li><li> Semente os condrócitos isolados sobre a 25 cm 2 frascos de cultura de tecidos em 5 ml de meio completo e manter numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Cresça condrócitos a uma densidade de 80%. </li><li> Solte a células ffrascos rom por lavagem em PBS 2x antes de expor a 0,05% de tripsina-EDTA por 3 minutos. Uma vez que os condrócitos separar, parar de tripsinização pela adição de 10 mL médio completo. </li><li> Centrifugar a suspensão a 300 xg (3 minutos) e ressuspender o pellet em meio completo. </li><li> Células de sementes em frascos de cultura de tecidos (75 cm 2) e por partes a uma razão de 1:3 (~ 5.000 células / cm 2) a cada 5 ° dia ou ao 80% de confluência. </li><li> Determinar o número de células e viabilidade de tripan coloração azul. </li></ol> C. Cell-semeadura da Matriz <ol><li> Antes da implantação de lavagem e as células de libertação, tal como descrito acima. Efectuar a contagem de células e transferir 5 x 10 4 células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Depois centrifugar a 500 xg durante 5 min à TA. </li><li> Ressuspender o sedimento em 15 mL meio completo para uma completa saturação da matriz. </li><li> Corte a bicamada colágeno andaime para as dimensões exatas do defeito trochlear por uma biópsia estérilsoco. </li><li> Matriz lugar num prato de cultura de tecido de tamanho adequado (por exemplo, placas de 24 poços). </li><li> Células de semente para o lado poroso, por células da matriz adesiva. Isto impede a migração de células para longe da matriz. </li><li> Adicione matrizes de células semeadas, sem mais meio de cultura de células dentro de uma incubadora durante 1 hora para permitir a aderência completa dos condrócitos. </li><li> Em seguida, coloque célula-matriz-construções em recipientes de cultura (por exemplo, placas de 24 poços) com meio completo fresco. Tome cuidado para não lavar as células fora da matriz, mesmo que forte adesão é esperado. </li><li> Agora, célula-matriz-construções podem ser levados para a sala de cirurgia para re-implantação. </li></ol> D. Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos <ol><li> Realizar artrotomia parapatelar ao joelho contralateral como acima descrito (A. 1-8). </li><li> Criar dois defeitos condrais isoladas no sulco troclear com um operatin ar estérilg furadeira (3,6 mm de diâmetro). </li><li> Limpar o defeito e lavar com solução salina estéril. </li><li> Deve ser dada atenção para não abrir a cavidade da medula, a qualquer momento. Se necessário, vedar a parte inferior dos defeitos com cauterização eléctrica contra a hemorragia. </li><li> Implante as matrizes semeados com os condrócitos de cultura com o lado poroso virados para baixo (Figura 2). Em seguida, pressione-se encaixam nos furos e lave a superfície circundante. </li><li> Vedar as matrizes implantados com um pouco de cola de fibrina (Tissucol Duo S) para garantir a fixação segura. </li><li> Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e aplicar gama completa de movimento para a articulação do joelho algumas vezes. </li><li> Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verifique se há algum evento ou sinal de fixação instável. As matrizes devem ser realizadas ainda no local. </li><li> Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas e spray de vestir, como descrito acima. </li></ol>

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<li>Tay, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+outcomes+of+alginate-embedded+allogenic+mesenchymal+stem+cells+versus+autologous+chondrocytes+for+the+repair+of+focal+articular+cartilage+defects+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model.</a> The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado fornece uma técnica estabelecida 9,12,13 e facilmente reprodutível para isolar condrócitos autólogos para a proliferação e posterior re-implantação em defeitos da cartilagem criadas artificialmente em joelhos de coelho. A utilização de condrócitos autólogos para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular já está em uso clínico proporcionar resultados satisfatórios a longo prazo 6. Principais problemas como, por exemplo, a hipertr...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nome do reagente/equipamento&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Empresa&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Número do catálogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comentários&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>0,21 U/mg</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FCS)</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>3702-P103009</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2213</td><td>10.000 U/ml/10.000 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Merck KgaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25 %/0,02 %</td><td>Biochrom AG</td><td>L2163</td><td>em PBS sem Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>Delta Select GmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>Solução de NaCl (0,9%)</td><td>Bbraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>Área de crescimento 60,1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147,8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Frascos de cultura celular 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tubos cónicos (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Sterilizados por gama</td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano 0,4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8154</td><td></td></tr><tr><td>Curativo em spray (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>Permeável ao vapor de água</td></tr><tr><td>Chondro-Gide&amp;Ograve;</td><td>Geistlich Pharma AG</td><td>30915.5</td><td></td></tr><tr><td>Punção biópsia</td><td>pfm medical ag</td><td>48351</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S</td><td>Baxter</td><td>3419627</td><td>0,5 ml</td></tr></tbody></table>

matrix-assistida transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Defeitos da cartilagem articular são consideradas um importante problema de saúde porque a cartilagem articular tem uma capacidade limitada de auto-regeneração 1. Lesões de cartilagem não tratadas levar a dor contínua, afetam negativamente a qualidade de vida e predispõem para a osteoartrose. Durante as últimas décadas, várias técnicas cirúrgicas têm sido desenvolvidos para o tratamento de tais lesões. No entanto, até agora não foi possível conseguir uma reparação completa em termos de cobertura com o defeito da cartilagem articular ou hialina de proporcionar recuperação satisfatória a longo prazo 2-4. Portanto, as lesões da cartilagem articular continuam a ser um alvo privilegiado para técnicas regenerativas, como Engenharia de Tecidos. Em contraste com outras técnicas cirúrgicas, que muitas vezes conduzem à formação de tecido fibroso ou fibrocartilaginoso, Tissue Engineering visa restaurar completamente a complexa estrutura e as propriedades da cartilagem articular original usando o potencial condrogénico das células transplantadas. Rdesenvolvimentos ecent abriu possibilidades promissoras para terapias de regeneração da cartilagem. A primeira abordagem baseada em células para o tratamento de cartilagem em toda a espessura ou lesões osteocondrais foi realizada em 1994 por Lars Peterson e Pad Brittberg pioneiro condrócitos autólogos clínica (ACI) 5. Hoje em dia, a técnica está bem estabelecido clinicamente para o tratamento de grandes defeitos na cartilagem hialina do joelho, mantendo bons resultados clínicos até 10 a 20 anos após a implantação 6. Nos últimos anos, o implante de condrócitos autólogos foram submetidos a uma rápida progressão. O uso de um tridimensional colagénio matriz artificial no qual as células são replantadas subsequentemente transformou-se cada vez mais popular 7-9. MACT composto por dois procedimentos cirúrgicos: Em primeiro lugar, a fim de recolher os condrócitos, uma biópsia da cartilagem precisa ser realizada a partir de uma área de cartilagem não peso-rolamento de tjoint ele joelho. Em seguida, os condrócitos a ser extraídos, purificados e expandiu-se para um número suficiente de células in vitro. Os condrócitos são então semeadas em uma matriz tridimensional e pode ser subsequentemente re-implantado. Ao preparar um implante de tecido de engenharia, a taxa de proliferação e capacidade de diferenciação são fundamentais para a regeneração de tecidos bem sucedida 10. A utilização de uma matriz tridimensional, como uma célula transportadora é pensado para apoiar estas características celulares 11. O protocolo a seguir vai resumir e demonstrar uma técnica para o isolamento de condrócitos a partir de biópsias de cartilagem, a sua proliferação in vitro e a sua sementeira em um 3D-matriz (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suíça). Finalmente, a implantação das células-matriz-construções em defeitos condrais criadas artificialmente de articulação do joelho de um coelho vai ser descrito. Esta técnica pode ser usada como uma configuração experimentalpara novas experiências de reparação da cartilagem.

A técnica cirúrgica descrita permite uma implantação bem sucedida e isolamento de condrócitos autólogos para um defeito condral artificial. A configuração experimental resultou em uma integração bem sucedida do implante na cartilagem ao redor. Após 12 semanas in vivo, o defeito condral foi preenchido por tecido de reparação com uma superfície homogénea e intacta, o que reduziu tensão de cisalhamento e danos no implante (Figura 4). Além disso, nenhuma hipertrofia ou ...

Uma técnica experimental para o tratamento de lesões condrais no joelho do coelho é descrito. O implante de condrócitos autólogos semeadas numa matriz é um método bem aceite para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular que fornecem resultados satisfatórios a longo prazo. Matrix-assistida transplante de condrócitos autólogos (MACT) oferece um método padronizado e implante clinicamente estabelecida.

Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

Defeitos na cartilagem articular são considerados um grande problema de saúde, pois a cartilagem articular possui uma capacidade limitada de autorregeneração 1. Não tratados...

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma técnica experimental para o tratamento de defeitos condrais na articulação do joelho de coelho. Isso é realizado primeiramente mediante uma biópsia da cartilagem da articulação do joelho para coletar condrocitos autólogos. O segundo passo consiste em extrair, purificar e expandir os condrocitos biopsiados para um número suficiente de células in vitro.Em seguida, os condrócitos são acomodados em uma matriz tridimensional. Na etapa final, a matriz tridimensional é implantada em um defeito condral que foi perfurado no joelho contralateral do coelho. Após 12 semanas in vivo, os implantes podem ser avaliados macroscopicamente, apresentando tecido de reparo com superfície homogênea e íntegra de qualidade sólida.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da reparação da cartilagem articular e pode facilitar a análise experimental da terapia com fatores de crescimento, indução gênica e alterações nas propriedades métricas. Após anestesiar o coelho, depile o joelho a ser operado com um par de tesouras elétricas. Em seguida, aspire os pelos e desinfete completamente o joelho depilado, cobrindo o restante do animal co

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Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de...

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Modelos animais são ferramentas importantes para a avaliação de enxertos de engenharia tecidual. Este trabalho apresenta o protocolo de preparação de um enxerto de polímero biodegradável eletrofiado para uso na engenharia de tecidos do ligamento cruzado anterior, bem como um protocolo cirúrgico para implantação em modelo de rato.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

O objetivo deste estudo é relatar um protocolo para o tratamento artroscópico das lesões osteocondrais do tálus usando microfractured e células-tronco adiposo-derivado purificadas.

Microfractured autólogo e purificado tecido adiposo para gestão artroscópica das lesões osteocondrais do tálus

Apresentamos um método para avaliar a extensão espacial da lesão/morte celular na superfície articular das articulações murino intactas após a aplicação de cargas mecânicas controladas ou impactos. Esse método pode ser usado para investigar como osteoartrite, fatores genéticos e/ou regimes de carregamento diferentes afetam a vulnerabilidade dos condrócitos em situ .

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o isolamento e a culturing de explants de cartilagem de joelhos bovinos. Este método fornece uma ferramenta fácil e acessível para descrever mudanças de tecido em resposta a estímulos biológicos ou novas terapêuticas visando a articulação.

Um modelo ex vivo da cultura do tecido da cartilagem que remodela em explants bovinos do joelho

Aqui, apresentamos o modelo de lesão da cartilagem intra-articular induzida por carga cíclica do joelho de rato, gerado por 60 compressões cíclicas acima de 20 N, resultando em danos à cartilagem condilar femoral em ratos.

Um Método Não Invasivo para Gerar o Modelo de Lesão da Cartilagem Intra-Articular Induzida por Carga Cíclica do Joelho de Rato

O modelo aberto de impacto do côndilo femoral medial em coelhos é confiável para estudar a osteoartrite pós-traumática (PTOA) e novas estratégias terapêuticas para mitigar a progressão da PTOA. Este protocolo gera um defeito cartilaginoso isolado do côndilo femoral medial posterior em coelhos utilizando uma torre de queda baseada em carruagem com cabeça de impacto.

Modelo de impacto de cartilagem reprodutível para gerar osteoartrite pós-traumática em coelhos

Este protocolo estabelece um modelo de defeitos de cartilagem de espessura total (FTCD) através da perfuração de orifícios no sulco troclear femoral de ratos e mensuração do comportamento da dor e alterações histopatológicas subsequentes.

Desenvolvimento e Avaliação de um Modelo de Defeitos Cartilaginosos em Rato

Nesse protocolo, um modelo de osteoartrite de joelho foi elaborado pelo método de Videman modificado, e os procedimentos operatórios e precauções da acupotomia são detalhados. A eficácia da acupotomia tem sido demonstrada testando-se as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendíneo e as propriedades mecânicas e morfológicas da cartilagem.

Aplicação de Acupotomia em Modelo de Osteoartrite de Joelho em Coelhos

O protocolo descreve um método para intervenção de Tuina em um modelo de coelho de osteoartrite de joelho.

Intervenção Tuina em Modelo de Osteoartrite de Joelho em Coelhos

Aqui, apresentamos um protocolo integrado para gerar lesões osteocondrais controladas nos joelhos de ovelha, a fim de estabelecer um modelo experimental adequado para estudos de regeneração óssea e cartilaginosa. O protocolo descreve um método para induzir um defeito osteocondral de espessura total no côndilo femoral, utilizando técnicas que minimizam os impactos no bem-estar animal e a variabilidade nos resultados.

Estabelecimento e Avaliação de um Modelo Ovino de Defeito Osteocondral de Espessura Total

Aprenda o transplante autólogo de condrócitos assistido por matriz para reparo de lesões condrais em joelho de coelho. Esta técnica demonstra resultados promissores na regeneração de cartilagem articular.

Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

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