Name: Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a implantar células-tronco mesenquimais alogênicas em coágulos de fibrina para reparo de defeitos osteocondrais no joelho de coelhos. Este método padronizado demonstra regeneração tecidual eficaz após 12 semanas.

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Este projeto foi financiado pela Associação Alemã de Pesquisa (concessão HE 4578/3-1) e parcialmente pelo FP7 UE-Project &quot;GAMBA&quot; NMP3-SL-2010-245993.

A. Preparação de um coelho de Doadores para o isolamento de células tronco mesenquimais (Room Cirurgia) <ol><li> As células são isoladas Nova Zelândia Branco (NZW) coelhos machos em idade de 4 meses e cerca de 3 kg de peso corporal. </li><li> Induzir a anestesia de propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) e sacrificam com pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal iv). </li><li> Barbear pele de membros posteriores, costas e barriga com um cortador elétrico e aspirar o pêlo. </li><li> Desinfectar a área raspada cuidadosamente com etanol a 70%. </li><li> Use uma pinça sem corte, tesouras afiadas (ou bisturi) e cortadores de ossos para o tecido e ligamentos. </li><li> Faça uma incisão ao longo da superfície craniana da perna e panturrilha. </li><li> Refletir pele e tecido subcutâneo por qualquer dissecção cortante ou contundente. </li><li> Músculos separados e ligamentos de tíbia e fêmur. Mantenha cortes tão perto do osso possível para fazer uma dissecação limpa. Não separe fêmur da tíbia neste momento. </li><li> Corte through da articulação do quadril para separar a cabeça do fêmur do acetábulo. </li><li> Eleve o complexo tíbio-femoral. </li><li> Use a lâmina de bisturi para raspar qualquer tecido mole restante dos ossos ou esfregar os ossos com tecidos de pano estéreis. Neste ponto, do fémur e da tíbia ainda estão ligados. </li><li> Remover patela por corte, em seguida, corte os ligamentos da articulação do joelho para ossos separados, finalmente. </li><li> Spray de ossos separados com etanol a 70%, deixar secar ao ar e colocar cada osso para um tubo de centrífuga de 50 ml com meio de cultura celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para mantê-los húmidos. </li><li> Agora mude em uma cultura de células capela de fluxo laminar estéril. </li></ol> B. Flushing de Coelho MSC a partir de ossos e Expansão (Cultura capa de celular) <ol><li> Recolher os ossos a partir de tubos e colocá-los em 150 pratos mm usando uma pinça estéril. </li><li> Retire duas extremidades ósseas com uma serra estéril e peças mudar para Nova milímetros pratos 150. </li><li> Encha uma seringa de 10 ml com medium (DMEM), coloque uma agulha de calibre 18 e inserir na abertura da medula óssea. </li><li> Em seguida, enxágüe cavidade medular com meio para liberar a medula óssea para o prato. Depois, enxaguar partir da outra extremidade, se possível. Se necessário, viu fora mais das extremidades. Se o osso deve quebrar, basta lavar o interior do osso. </li><li> Aspirar o meio de suspensão de células para dentro da seringa e enxaguar a medula óssea repetidamente até que a suspensão é de flutuação livre, através da cavidade da medula óssea e não mais de medula óssea coágulos aparecer. </li><li> Uma vez que a medula óssea foi coletada a partir de todos os ossos, romper os aglomerados de medula, passando por uma agulha de calibre 18: encher a seringa com agulha acoplada e forçar a saída em média. </li><li> Em seguida, filtrar a suspensão através de um filtro de células num tubo de 50 ml. A fim de evitar a perda de células, lava prato de cultura 2x com 10 ml de meio e filtrar bem. </li><li> Centrifugar a suspensão a 500 xg durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender célula pellet em 10 ml de meio (DMEM + 1% de Pen / Strep). </li><li> Células do sangue em separado do sangue células mononucleares periféricas (PBMC) e células-tronco mesenquimais (MSC) usando uma solução de separação Biocoll. </li><li> Encha 5 ml de solução de separação Biocoll num tubo de 15 ml e adiciona cuidadosamente 5 ml de suspensão de células no topo e centrifugar a 800 xg durante 20 min à temperatura ambiente (sem travagem). </li><li> Resultados possíveis veja a Figura 1: Sendo mais denso que Biocoll, as células vermelhas do sangue de sedimentos para o fundo, enquanto as células-tronco mesenquimais de PBMC e permanecer na interface. </li><li> Retire cuidadosamente da interface em um tubo de 15 ml e lavar com 5 ml PBS. </li><li> Centrifugar como descrito no passo 22, ressuspender em 5 ml de PBS e repetir 2-3x. </li><li> Depois, centrifugar novamente a 350 xg durante 10 min à temperatura ambiente (com travão). </li><li> Ressuspender em 10 ml de meio e contagem de células num hemocitómetro. </li><li> As células em placas a uma densidade de sementeira inicial de aproximadamente 5 x 10 6 em 150 milímetros pratos. </li><li> Depois de 2-3 dias, remover as células não aderentes. Pode ser necessário enxaguar com PBS primeiro, a fim de remover os detritos celulares. Adicionar meio completo fresco (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de Pen / Strep) depois. </li><li> Alimentar as células a cada 3-4 dias (Figura 2). </li><li> Depois de 5-10 dias, as células de passagem para a primeira vez. </li></ol> C. Preparação de coágulos de fibrina in vitro <ol><li> No dia da implantação, as células aderentes libertar a partir de frascos / pratos por 3 minutos de exposição a 0,25% de tripsina-EDTA. Parar a tripsinização adicionando meio completo. </li><li> Distribua as células em um tubo de 50 ml falcon e lavá-los duas vezes com PBS. </li><li> Determinar a viabilidade celular e os números de tripan coloração azul. </li><li> Adicionar 50.000 células / tubo de microcentrífuga e recolher pelotas por centrifugação a 500 xg durante 5 min à TA. Prepare um mastermix para pelo menos mais um coágulo, conforme necessário. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 17 ul de PBS e 25 ul de misturar o componente de fibrinogénio TISSUCOL-17 Kit com esta suspensão MSC mL. </li><li> Aqui uma placa estéril com orifícios pré-perfurados (3x3.6 mm) de acordo com os furos in vivo (Figura 3). </li><li> Primeiro, inocular 4 ul solução de trombina (500 UI / ml) para um orifício, seguida pela adição imediata de 42 ul de fibrinogénio à suspensão de células e novamente 4 ul de solução de trombina de topo. Não misturar a suspensão para evitar a coagulação na ponta da pipeta. Em primeiro lugar, o volume de 50 ul da pipetado fibrinogénio células suspensão irá sobressair o aro dos orifícios pré-perfurados, sem fusão, devido à tensão superficial. No entanto, depois de concluída a coagulação (após 60 min), o coágulo é contrair e se encaixa no furo pré-furado. </li><li> Remover o coágulo com cuidado usando uma pinça sem corte e coloque em um tubo de microcentrífuga com PBS. Preparar dois coágulos / animal. </li><li> Pegue os coágulos para a sala de cirurgia. </li></ol> D. Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina<ol><li> Para induzir a anestesia de coelho (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de idade) por injecção intravenosa de propofol (10 mg / kg de peso corporal). </li><li> Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele. Todos os procedimentos nomeados antes são realizados em uma sala de preparação de uma cirurgia para evitar a contaminação do ambiente estéril da sala de cirurgia. </li><li> Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg / min de fentanil intravenosamente. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca. </li><li> Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada. </li><li> Palpar a patela e realizar uma incisão medial à patela. </li><li> Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Evite cortar qualquer pequenos vasos sanguíneos superficiais. </li><li> Deslocar lateralmente a patela (Figura 4). </li><li> Depois de inspecção da articulação do joelho por quaisquer lesões de cartilagem concomitantes ou anomalias articulares, criar dois defeitos osteocondrais (3 mm de profundidade, figura em forma de oito), no sulco troclear com um ar furadeira operacional estéril (3,6 milímetros de diâmetro) com um dispositivo de paragem (Figura 5). </li><li> Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril. </li><li> Antes da implantação, encher 20 ul de cola de fibrina para os defeitos e distribuí-las uniformemente sobre o fundo do defeito. </li><li> Em seguida, implantar os coágulos press-montado na figura defeito em forma de oito. </li><li> Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e dobrar e esticar o joelho algumas vezes. </li><li> Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verificar se células-coágulos de fibrinogênio ainda estão no local. </li><li> Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl) (ambos com fio absorvívelde material). </li><li> Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água. </li><li> Para os cuidados pós-operatórios, a ferida é verificada por dia durante 7 dias. Os coelhos recebem por analgesia pós-operatória Carprofeno 4 mg / kg sc a cada 24 h (durante 4 dias) e buprenorfina 0,03 mg / kg sc a cada 12 h (durante 2,5 dias). A estabilização do joelho (por exemplo, limpeza) não é necessária. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nos últimos anos, a possibilidade de tratar complexos articulares defeitos osteocondrais - tais como os resultantes de osteocondrite dissecante, osteonecrose e trauma - com abordagens de engenharia de tecidos tornou-se mais e mais atraente. Nas entidades patológicas mencionadas anteriormente, danos no tecido se estende para o osso subcondral e envolve dois tecidos caracterizados por diferentes capacidades intrínsecas de cura 1. Há um interesse crescente no papel do osso subcondral para os processos patogénico...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>SFC</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>0401</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2210</td><td>1.000 unidades/10 &amp;mu;g/&amp;mu;l em NaCl 0,9%</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Merck KGaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Azul de Tripano (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Separação Biocoll</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td>Solução isotônica Densidade: 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fentanil</td><td>DeltaSelectGmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>Solução de NaCl (0,9%)</td><td>BBraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>Seringas (Injekt)</td><td>BBraun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas (Sterican)</td><td>BBraun</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>Pincetas (romba/afiada)</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesouras</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturis</td><td>Feather Safety Razor Co</td><td>02.001.30.022</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de pesquisa</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cortador de osso</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura celular 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>Área de crescimento 60,1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147,8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Frascos de cultura celular 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tubos cónicos (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Sterilizados por gama</td></tr><tr><td>Incubadora de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Forma Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmara de fluxo laminar para cultura celular Hera Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serra estéril</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>Broca pneumática</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit TISSUCOL-1,0 ml Immuno</td><td>Baxter</td><td>2546648</td><td></td></tr><tr><td>Fios (Monocryl 4-0, Vicryl 4-0)</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Curativo em spray (OpSite)</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>Permeável ao vapor de água</td></tr></tbody></table>

tratamento de defeitos osteocondrais no joelho do coelho por implantação de alogênico células-tronco mesenquimais em coágulos de fibrina

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

O tratamento de defeitos articulares osteocondrais tem desafiado os médicos há muitos anos. A melhor compreensão das interações entre a cartilagem articular e o osso subcondral nos últimos anos levou a uma atenção crescente para a restauração de toda a unidade osteocondral. Em comparação com lesões condrais, a regeneração de defeitos osteocondrais é muito mais complexa e representa um desafio cirúrgico e terapêutico muito maior. O tecido danificado não inclui apenas a camada superficial de cartilagem, mas também o osso subcondral. Para danos profundos, de caráter osteocondral, como ocorre, por exemplo, na osteocondrose dissecante, toda a espessura do defeito precisa ser substituída para restaurar a superfície articular 1. Os procedimentos terapêuticos adequados devem levar em conta esses dois tecidos diferentes e seus distintos potenciais de cicatrização intrínsecos 2. Nas últimas décadas, surgiram diversas opções de tratamento cirúrgico, já estabelecidas clinicamente 3-6.
Transplantes osteocondrais autólogos ou alogênicos consistem em cartilagem articular e osso subcondral e permitem a substituição de toda a unidade osteocondral. Os defeitos são preenchidos com enxertos osteocondrais cilíndricos que visam proporcionar uma superfície contínua revestida por cartilagem hialina 3,7,8. As desvantagens incluem a quantidade limitada de enxertos disponíveis, a morbidade no local doador (para transplantes autólogos) e a incongruência da superfície; assim, a aplicação deste método é especialmente limitada em defeitos extensos.
Novas abordagens na área da engenharia de tecidos abriram possibilidades promissoras para a terapia regenerativa osteocondral. A implantação de condrócitos autólogos marcou o primeiro enfoque biológico baseado em células para o tratamento de lesões cartilaginosas em espessura total e está agora estabelecida mundialmente, com bons resultados clínicos mesmo 10 a 20 anos após a implantação 9,10. No entanto, até o momento, esta técnica não é adequada para o tratamento de todos os tipos de lesões, como defeitos profundos que envolvem o osso subcondral 11.
A técnica do sanduíche combina enxertia óssea com abordagens atuais em Engenharia de Tecidos 5,6. Essa combinação parece ser capaz de superar as limitações observadas apenas nos enxertos osteocondrais. Após a enxertia óssea autóloga na área do defeito subcondral, uma membrana semeadas com condrocitos autólogos é suturada acima, facilitando o ajuste da topologia do enxerto ao local lesionado. É claro que a reconstrução óssea prévia exige tempo cirúrgico adicional e, muitas vezes, até mesmo uma cirurgia adicional. Além disso, até o momento, faltam dados de longo prazo 12.
A engenharia de tecidos sem enxerto ósseo adicional tem como objetivo restaurar a estrutura complexa e as propriedades da cartilagem articular nativa por meio do potencial condrogênico e osteogênico das células transplantadas. No entanto, mais uma vez, geralmente é apenas o tecido cartilaginoso que é mais ou menos regenerado. Danos osteocondrais adicionais exigem um tratamento específico adicional. Para alcançar a regeneração da estrutura multilamelar de defeitos osteocondrais, produtos tridimensionais de engenharia de tecidos semeados com células autólogas/alogênicas podem proporcionar uma boa capacidade regenerativa 11.
Além dos condrócitos autólogos, as células-tronco mesenquimais (MSC) parecem ser uma alternativa atraente para o desenvolvimento de um tecido cartilaginoso de espessura total. Em inúmeros estudos pré-clínicos in vitro e in vivo, as células-tronco mesenquimais demonstraram excelente potencial de regeneração tecidual 13,14. A vantagem importante das células-tronco mesenquimais, especialmente para o tratamento de defeitos osteocondrais, é que elas têm a capacidade de se diferenciar em osteócitos, bem como em condrócitos. Portanto, elas permitem potencialmente uma regeneração multilamelar do defeito.
Nos últimos anos, diversos scaffolds com potencial regenerativo osteocondral foram desenvolvidos e avaliados, apresentando resultados preliminares promissores 1,15-18. Além disso, a cola de fibrina como veículo para células tornou-se uma das técnicas preferidas na reparação experimental da cartilagem e já foi utilizada com sucesso em diversos estudos em animais 19-21 e até em primeiros ensaios em humanos 22.
O protocolo a seguir demonstrará uma técnica experimental para o isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea de um coelho, para subsequente proliferação em cultura celular e para a preparação de um modelo padronizado in vitro de coágulos de fibrina e células. Por fim, será descrita uma técnica para a implantação de coágulos de fibrina e células previamente estabelecidos em defeitos osteocondrais artificiais da articulação do joelho do coelho.

A técnica cirúrgica descrita permite o isolamento e implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para um defeito osteocondral artificial. A configuração experimental resultou em uma integração bem sucedida do implante na cartilagem ao redor. O defeito foi cheio com tecido de reparação com propriedades biomecânicas semelhantes e durabilidade semelhantes em comparação com a cartilagem circundante. A fibrina dos coágulos de células foi preparado in vitro sobre uma placa es...

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de célula-coágulos<em&gt; In vitro</em&gt; Oferece um método padronizado para a implantação.

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

O tratamento de defeitos articulares osteocondrais tem sido um desafio para os médicos há muitos anos. A melhor compreensão das interações da articulação...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um método padronizado para a pesquisa experimental com células-tronco no campo da reparação osteocondral. Isso é realizado primeiramente isolando células-tronco mesenquimais da medula óssea de coelho. Na segunda etapa, as células-tronco isoladas são cultivadas para facilitar a proliferação.Em seguida, os coágulos celulares de fibrina são fabricados in vitro. Por fim, os coágulos celulares de fibrina previamente estabelecidos são implantados em defeitos osteocondrais artificiais na articulação do joelho de coelho. Em última instância, após 12 semanas in vivo, pode-se realizar uma análise macroscópica do joelho, sendo o tecido reparado caracterizado por uma superfície homogênea e intacta com textura firme.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia de lesões da cartilagem em um ambiente experimental com animais, pois permitem a análise in vivo da integração e da capacidade de regeneração de células-tronco mesenquimais alogênicas para o tratamento de danos na cartilagem. Na sala cirúrgica, utilize um par de tesouras elétricas para raspar os pelos das patas traseiras, região dorsal e abdômen de um coelho eutanasiado, e simultaneamente aspire os pelos após desinfetar completamente a área raspada com etanol 70%. Faça uma incisão ao longo da superfície cranial da perna e da panturrilha, e em seguida, reflete a pele e o tecido subcutâneo mediante dissecação afiada.Em seguida, separe os músculos e ligamentos da tíbia e do fêmur, fazendo os cortes o mais próximo possível do osso para uma dissecação limpa. Depois, corte a articulação do quadril para separar a cabeça do fêmur do acetábulo e eleve o complexo tibiofemoral. Agora, use a lâmina do bisturi para remover qualquer tecido mole remanescente dos ossos.Em seguida, remova a patela e os ligamentos da articulação do joelho para finalmente separar os ossos da perna. Pulverize os ossos separados com etanol a 70% após eles terem secado ao ar. Coloque cada osso em tubos cónicos separados de 50 mililitros contendo meio de cultura celular para mantê-los úmidos em uma cultura celular estéril.Câmara de fluxo laminar. Use pinças estéreis para transferir os ossos colhidos dos tubos de centrífuga para placas de 150 milímetros. Em seguida, use uma serra estéril para remover ambas as extremidades dos ossos e transfira os pedaços para novas placas de 150 milímetros.Em seguida, encha uma seringa de 10 mililitros com meio. Afixe uma agulha de calibre 18 e insira a ponta da agulha em uma das extremidades do osso, atingindo a medula. Agora, lave a cavidade medular com meio para expelir a medula óssea para a placa.Em seguida, aspire a suspensão celular para dentro da seringa e lave a medula óssea repetidamente até que a suspensão esteja livre, fluindo pela cavidade da medula óssea, e não apareçam mais coágulos de medula óssea. Uma vez que a medula óssea tenha sido coletada de todos os ossos, encha a seringa com a suspensão de medula óssea através da agulha e force a suspensão de medula para fora no meio, a fim de dispersar os agregados de medula. Posteriormente, passe a suspensão através de um filtro celular para um tubo de 50 mililitros para evitar perda celular.Lave a placa de cultura duas vezes com 10 mililitros de meio, passando a lavagem através do filtro a cada vez. Centrifugue a suspensão por cinco minutos a 500 vezes GE e temperatura ambiente. Em seguida, remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio.Em seguida, adicione cinco mililitros da solução de separação de bio células a um tubo de 15 mililitros e, cuidadosamente, sobreponha cinco mililitros da suspensão celular. Após a centrifugação da solução em camadas, os glóbulos vermelhos sedimentarão no fundo, enquanto os PBMC e as células-tronco mesenquimais permanecerão na interface. Transfira as células da interface para um tubo cônico de 15 mililitros e utilize cinco mililitros de PBS para lavar os PBMC e as células-tronco mesenquimais coletados duas a três vezes.Em seguida, centrifugue as células mais uma vez e re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio. Por fim, conte as células com um hemocitômetro e plaque-as com uma densidade inicial de semeadura de aproximadamente cinco vezes 10 à sexta em placas de 150 milímetros. Após dois a três dias, mantenha as culturas removendo as células não aderentes.Enxágue a placa com PBS para remover os detritos celulares e alimente as células com meio completo fresco no dia da implantação. Comece expondo as células aderentes à tripsina 0,25% EDTA por três minutos. Interrompa a tripsinização adicionando meio completo.Em seguida, transfira as células-tronco mesenquimais destacadas para um tubo cônico de 50 mililitros e lave-as duas vezes com PBS. Após determinar a contagem celular e a viabilidade por coloração com azul de trian, prepare uma mistura mestra de pelo menos um coágulo adicional conforme necessário para n igual a quatro. Centrifugue 200.000 células em um tubo de microcentrífuga e, em seguida, reconstitua o pellet em 68 microlitros de PBS e 100 microlitros do componente fibrinogênio de um kit de coágulo tecidual.Em seguida, inocular quatro microlitros de solução de trombina em um orifício de uma placa estéril pré-perfurada. Adicione imediatamente todos os 42 microlitros de uma suspensão celular de fibrinogênio e, em seguida, cubra a suspensão celular com mais quatro microlitros de solução de trombina. Inicialmente, o volume de 50 microlitros da suspensão celular de fibrinogênio pipetado irá protrudir acima da borda do orifício pré-perfurado devido à tensão superficial.No entanto, após uma hora, a mistura estará completamente coagulada e terá contraído de modo a se ajustar ao orifício pré-perfurado. Agora, utilize pin&ccedil;as rombas para remover cuidadosamente o co&aacute;gulo e, em seguida, coloque-o em um tubo de microcentrifuga&ccedil;&atilde;o contendo PBS. Ap&oacute;s desinfetar o joelho depilado, palpe cuidadosamente a patela e fa&ccedil;a uma incis&atilde;o na pele medial &agrave; patela.Em seguida, abra a articulação do joelho por meio de uma artrotomia medial para-patelar em condições estéreis e, então, desloque a patela lateralmente. Agora, utilize uma furadeira cirúrgica a ar estéril com uma broca de 3,6 milímetros de diâmetro e um dispositivo de parada para criar dois defeitos osteocondrais em formato de oito, com três milímetros de profundidade, no sulco troclear. Após lavar os defeitos com soro fisiológico estéril, aplique rapidamente 20 microlitros de cola de fibrina uniformemente no fundo dos defeitos, antes que a cola seque.Implante os coágulos pressionados no defeito em formato de oito. Após a coagulação, reposicione a patela dentro do sulco troclear e dobre e estique o joelho algumas vezes. Em seguida, desloque novamente a patela lateralmente e verifique se os coágulos de células com fibrinogênio ainda estão no lugar.Após reposicionar a patela novamente, feche a ferida em camadas com pontos simples separados de Vicryl 4-0 e uma sutura contínua cutânea de Monocryl 4-0. Por fim, feche a ferida com um curativo em spray permeável ao vapor d'água. Neste experimento, o defeito foi preenchido por tecido de reparo com propriedades biomecânicas e durabilidade semelhantes às da cartilagem circundante.Este coágulo celular de fibrina foi preparado in vitro em uma placa estéril com orifícios pré-perfurados, que tinham o mesmo tamanho do defeito osteocondral. Como resultado, não houve falhas entre o coágulo de fibrina implantado e a cartilagem circundante, o que seria um fator de risco para degeneração prematura ou deslaminação. Uma ancoragem basal do tecido reparado foi garantida porque o osso subcondral foi penetrado e, assim, atuou contra o cisalhamento.Outro aspecto importante foi a rigidez do tecido reparado, que deveria corresponder à do tecido cartilaginoso saudável circundante para evitar um aumento da carga na articulação e uma possível degeneração prematura. Além disso, observou-se uma superfície íntegra e homogênea do transplante, o que reduziu as tensões cisalhantes e os possíveis danos ao implante após o seu desenvolvimento. Essa técnica poderá abrir caminho para pesquisadores na área de pesquisa de células-tronco ortopédicas explorarem opções de tratamento para defeitos osteocondrais e um modelo animal experimental.Para uma demonstração mais explícita de algumas das técnicas de preparo animal e cirurgia de joelho, consulte o nosso artigo complementar na Jovi sobre transplante autólogo de condrocitos assistido por matriz para remodelação e reparo de defeitos condrais. Em um modelo de coelho.

treatment-osteochondral-defects-rabbit-s-knee-joint-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Objetivo da apresentação é mostrar um método altamente reprodutível para gerar matriz associada implantes de células-tronco em defeitos da cartilagem, que pode ser visualizado com ressonância magnética. As células estaminais são rotulados com FDA-approved Ferumoxides, misturado com agarose, implantado em defeitos da cartilagem e fotografada com um scanner MR 7T.

Implantação de Ferumoxides identificadas células-tronco mesenquimais em defeitos da cartilagem

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de...

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

Uma técnica experimental para o tratamento de lesões condrais no joelho do coelho é descrito. O implante de condrócitos autólogos semeadas numa matriz é um método bem aceite para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular que fornecem resultados satisfatórios a longo prazo. Matrix-assistida transplante de condrócitos autólogos (MACT) oferece um método padronizado e implante clinicamente estabelecida.

Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

Modelos animais são ferramentas importantes para a avaliação de enxertos de engenharia tecidual. Este trabalho apresenta o protocolo de preparação de um enxerto de polímero biodegradável eletrofiado para uso na engenharia de tecidos do ligamento cruzado anterior, bem como um protocolo cirúrgico para implantação em modelo de rato.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

O objetivo deste estudo é relatar um protocolo para o tratamento artroscópico das lesões osteocondrais do tálus usando microfractured e células-tronco adiposo-derivado purificadas.

Microfractured autólogo e purificado tecido adiposo para gestão artroscópica das lesões osteocondrais do tálus

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

Este artigo apresenta um protocolo simples e económico para o simples isolamento e purificação de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial do coelho branco Nova Zelândia.

Magnético-ativado da pilha classificação estratégias para isolar e purificar sinovial fluidos derivados mesenquimais células-tronco de um modelo de coelho

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir uma tecido adiposo-derivado do estroma vascular fração e sua aplicação para melhorar as funções de joelho Regenerando o tecido da cartilagem, como em pacientes humanos com osteoartrite.

Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

O protocolo proposto envolve uma abordagem global para avaliar a formação óssea no contexto da regeneração óssea usando análises multimodais. Tem como objetivo fornecer informações qualitativas e quantitativas sobre a nova formação óssea, aumentando o rigor e a validade das investigações básicas e pré-clínicas.

Caracterização abrangente da mineralização tecidual em um modelo ex vivo

Aqui, apresentamos um protocolo integrado para gerar lesões osteocondrais controladas nos joelhos de ovelha, a fim de estabelecer um modelo experimental adequado para estudos de regeneração óssea e cartilaginosa. O protocolo descreve um método para induzir um defeito osteocondral de espessura total no côndilo femoral, utilizando técnicas que minimizam os impactos no bem-estar animal e a variabilidade nos resultados.

Estabelecimento e Avaliação de um Modelo Ovino de Defeito Osteocondral de Espessura Total

Aprenda a implantar células-tronco mesenquimais alogênicas em coágulos de fibrina para reparo de defeitos osteocondrais no joelho de coelhos. Este método padronizado demonstra regeneração tecidual eficaz após 12 semanas.

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina (Vídeo) | JoVE Journal

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

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