Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de Cotilédone Arabidopsis Epiderme durante a germinação

O objetivo do presente experimento é visualizar os eventos iniciais do desenvolvimento epidérmico após a germinação das sementes no nível celular. Isso é conseguido removendo primeiro o tegumento da semente para permitir uma visão clara do kosin como uma segunda etapa. Os kosina são montados sob uma camada de meio de ágar que os imobiliza e apóia seu desenvolvimento no próximo tempo - A imagem de lapso é realizada durante vários dias para observar o crescimento e a divisão das células epidérmicas in vivo.

Foram obtidos resultados que mostram expressão gênica dinâmica e localização de proteínas com base na fluorescência visível. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como imagens estáticas da coloração de Gus ou fusões de GFP, é que ela mostra o movimento dinâmico das proteínas durante a divisão e diferenciação celular. As sementes de Arabidopsis para este experimento são esterilizadas em uma solução de esterilização de sementes feita de 33% de alvejante doméstico e 0,1% Triton X 100 colocam sementes carregando as construções e genótipos fluorescentes desejados em um tubo de 1,7 mililitro e aplicam um mililitro de solução de esterilização, incubam em um mutador por 15 minutos.

Em uma capa estéril, use uma pipeta para remover a solução de esterilização do tubo deixando as sementes para trás. Enxágüe com um mililitro de água estéril. Repita quatro vezes após o quarto enxágue.

Incubar a quatro graus Celsius por dois ou mais dias. Para preparar a câmara deslize a mistura de mídia 20 mililitros de 0,5% de solução de bact para ágar em água em um frasco de 200 mililitros e microondas até dissolver. Seja cauteloso ao ferver a solução.

Chame a solução para cerca de 60 graus Celsius. Uma solução muito quente ou aplicada muito rapidamente pode derreter a cola ou rachar o vidro da lâmina da câmara. Quando a solução de ágar-ágar estiver suficientemente fria, recolha um mililitro com uma pipeta e aplique-o lentamente na lamínula dentro da lâmina da câmara imediatamente.

Adicione um segundo mililitro de solução de ágar. A Agar Media agora deve cobrir completamente a parte inferior da lâmina da câmara. Este meio mínimo é suficiente para apoiar o desenvolvimento em uma oleína vegetal, que contém nutrientes armazenados por quatro a cinco dias, mantendo a umidade e permitindo a difusão do gás.

Chame o slide com a câmara coberta na bancada. Para iniciar este procedimento, remova o tubo de sementes estéreis do armazenamento de quatro graus Celsius. Coloque um lenço de papel no palco de um microscópio de dissecação, umedeça-o com água e ajuste para criar uma superfície lisa.

O tecido é usado para estabilizar as sementes durante a dissecação. Pipetar 20 a 30 sementes do tubo para o tecido, tendo o cuidado de colocá-las no campo de visão do escopo de dissecação. Dissecar a co-leadina é o aspecto mais desafiador deste procedimento.

Usar uma pinça de baixa ampliação e uma pinça afiada e ter muito cuidado ajudará a garantir uma dissecção bem-sucedida Usando uma pinça afiada. Remova cuidadosamente o tegumento da muda por dentro, os tegumentos externos e internos devem ser removidos. Em seguida, use um bisturi para cortar o berço sem chumbo do hipercote e do radical.

É benéfico remover o hiper cot e radical para imagens porque, se intacto, o hiper cott se endireitará e alongará drasticamente. Movendo o Koss Leadin para fora do campo de visão de lapso de tempo, mantenha o chumbo dissecado imerso em água. Repita a dissecação da semente até atingir o número desejado de Olean.

Recomenda-se 15 a 20 dissecções bem-sucedidas antes da montagem do oleano na lâmina da câmara. Para preparar a corrediça da câmara para a montagem do cotan, use uma pequena lamínula para cortar o meio de ágar e levante toda a camada da base de vidro da câmara. Deslize a pipeta dissecada cotan com uma quantidade mínima de água do tubo de retenção para a câmara.

Deslize sob a camada de ágar levantada. Abaixe suavemente o ágar-ágar sobre os sedins. Se houver excesso de água, molhe-a com um lenço de papel.

Tomando cuidado para não perturbar os sedins quando a montagem estiver concluída. As amostras não devem mais se mover facilmente. Coloque a tampa na lâmina da câmara e transfira a lâmina para o microscópio stage.

Antes da imagem, configure o microscópio confocal invertido para obter a imagem do Fluor desejado. Os parâmetros LSM 700 são para excitação GFP de 488 nanômetros e coleta. Com um filtro passa-banda de 440 a 530 nanômetros e para excitação RFP de 555 nanômetros e coleta.

Com um filtro passa-banda de 570 a 610 nanômetros com uma objetiva de 20 vezes. Concentre-se na entrada do ACO e mova a objetiva para o centro da câmara. Deslize no modo de aquisição, altere o zoom para 0,5 e o tamanho do quadro para 48 por 48 pixels.

Marque a caixa de seleção de posições e digitalize a imagem de visão geral e, em seguida, aumente os números de blocos horizontais e verticais para 30 a 35. Clique no botão de digitalização para iniciar a digitalização. Quando a verificação estiver concluída, clique no botão de posições na guia de dimensões e coloque a mira em cada guia de berço para observar.

Inspecione as amostras montadas quanto a danos. Exclua as posições correspondentes à chumbo coss danificada para deixar apenas amostras adequadas para geração de imagens. Em seguida, configure uma série Z abrangendo a epiderme de chumbo coss de todas as amostras.

Clique na caixa de seleção Zack. Selecione cada posição na lista de posições e clique no botão mover para. Concentre-se no plano superior do chumbo cos na epiderme e clique no primeiro botão definido em Zack.

Concentre-se na posição mais baixa em que a epiderme é visível de forma útil. E clique no último botão definir. Clique no botão ao lado de ótimo, que mostra a melhor espessura de fatia Z a ser definida.

Verifique cada entrada de kos para confirmar se essas configurações abrangem todas as amostras. Os parâmetros Z não podem ser definidos para posições individuais. No software Zen 2009 usado aqui, configurar séries temporais com a resolução desejada e intervalos de duração de 15 a 30 minutos por três dias são eficazes para a dinâmica de proteínas na divisão celular epidérmica, mas os intervalos podem ser alterados conforme necessário.

Clique na caixa de seleção de séries temporais em séries temporais definir ciclos para o número de imagens desejadas digitando no campo de texto, defina o intervalo como 30 e use o menu suspenso para selecionar MIN para iniciar a varredura de várias posições XY, ZT, altere o tamanho do quadro para a resolução desejada e colete iniciar experimento. Observe que o número de posições deve ser limitado pelas especificações de varredura. Se o tempo total de varredura for maior que o intervalo desejado, os pontos de tempo não estarão corretos.

Usando este sistema, um máximo de seis posições simultâneas são possíveis ao criar imagens GFP e RFP em 59 fatias Z em um intervalo de 30 minutos. Um exemplo de um conjunto de pontos de tempo informativos coletados com esse método é mostrado aqui. As membranas celulares são marcadas com RFP e GFP fundiu uma proteína polar sob seu promotor nativo.

As imagens da série A mostram que a GFP polar aparece inicialmente distribuída uniformemente, em seguida, aproximadamente duas horas antes das divisões assimétricas indicadas por pontas de seta. A GFP polar segrega longe do local do OID meister incipiente na série B após a divisão assimétrica inicial indicada pela ponta da seta em 47 horas. A GFP polar desaparece em ambas as células.

Implicando uma transição rápida para o estado da célula-mãe de guarda pelo merisóide, a célula-mãe de guarda indicada pelo asterisco se divide simetricamente e se diferencia para formar células-guarda estomáticas, enquanto a célula cistológica recupera a expressão de GFP polar, presumivelmente precedendo uma divisão assimétrica posterior. Aqui é mostrado um vídeo registrado simplificado da localização de GFP polar durante a amplificação e espaçamento de uma célula precursora estomática. Inicialmente, a GFP polar aparece uniformemente na célula 39 horas após a germinação.

Ele polariza fortemente pouco antes de uma divisão às 40 horas, colocando uma empregada menor na extremidade oposta da cela. A célula maior à direita também recupera a identidade da linhagem estomática e, em 45 horas, a localização da GFP polar se move adjacente ao precursor estomático. A divisão em 47 horas produz um novo esteróide à direita orientado para longe do estamóide existente à esquerda do primeiro estamoide.

O resultado final é que dois estomões são separados por uma célula. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o lapso de tempo de longo prazo de uma co-leadina em germinação para avaliar a expressão gênica e a localização de proteínas na epiderme durante o desenvolvimento.