Análise de imagens de Neuron Glia para Interação em Plataforma Cultura microfluídicos (MCP) baseado Axon Neuronal e Sistema Glia co-cultura

Este protocolo estabelece uma nova plataforma de co-cultivo de axônios neuronais e astróglia para analisar as interações entre neurônios e glia utilizando imagem de alta resolução. Primeiro, monte a câmara de cultivo microfluídica, prepare os cultivos neuronais e induza os axônios neuronais a penetrarem no outro lado da MCP. Em seguida, adicione astrócitos cultivados para estabelecer um sistema de co-cultivo compartimentalizado; os resultados, incluindo imagens de lapso de tempo com microscopia de imunofluorescência confocal, podem ajudar a compreender as interações entre axônios, astróglia e axônios neuronais.

Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao tentar separar o efeito do processo neuronal versus a secreção neuronal na regulação do GT. Normalmente, indivíduos novos no método enfrentam dificuldades para induzir o axônio a penetrar em outra parte do compartimento celular. Isso exige uma alta densidade de neurônios saudáveis cultivados no lado neuronal, com os neurônios posicionados próximos aos canais centrais.

As câmaras abertas de MCP são projetadas para culturas compartimentalizadas de diferentes tipos de células, sendo necessárias camadas de poliuretano e laminina para o plaqueamento de neurônios e astrócitos na co-cultura. Primeiramente, aplique uma solução de poliuretano a um miligrama por mililitro em placas com fundo de vidro estéreis e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Lave as placas com fundo revestido três vezes com água bidestilada e, em seguida, coloque-as sob uma capela estéril para secar.

Em seguida, recubra a placa com laminina a um miligrama por mililitro e seque sob luz UV por uma hora. A montagem do MCP na placa de fundo de vidro deve ser preparada recentemente antes do uso. Posicione a plataforma de cultura microfluídica com os canais de conexão centrais em sua face inferior e forme um selo hermético com o vidro recoberto.

Placas inferiores. Adicione meio de cultura padrão de neurônios ou de astrócitos em ambos os lados do MCP montado. Incube a câmara por duas a quatro horas a 37 graus Celsius e verifique se há vazamento entre o MCP e o vidro.

Prato inferior. Culturas de células neuronais corticais são preparadas recentemente a partir de cérebros de camundongos com 14 a 16 dias de idade embrionária. Após a dissecação do cérebro do camundongo, remova as meninges do córtex sob o microscópio estereoscópico.

Use uma lâmina de barbear para picar o tecido em blocos pequenos e coloque os blocos picados em um tubo após a centrifugação. Descarte o meio acima do pellet e adicione 0,05% Try por 10 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Dissocie as células por meio de pipetagem suave com uma pipeta de vidro polida ao fogo.

Passe a amostra através de um filtro de 70 mícrons para coletar uma suspensão clara de células neuronais utilizando o plaqueamento de neurônios. Semeie em meio suplementado com 5% de FBS. Adicione 150 microlitros de neurônios no lado direito da placa MCP montada.

Uma alta densidade de neurônios, pois somente os neurônios que se fixam na área de retenção celular são capazes de desenvolver axônios através dos canais centrais até o outro lado do MCP montado. No dia seguinte, aspire cuidadosamente o meio da área de semeadura celular da câmara e substitua o meio de semeadura de neurônios por meio de cultura neuronal regular.

Medo, adicione 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado de gliócitos ou GDNF ao lado dos astrócitos da câmara. Isso cria um gradiente químico que ajudará a induzir o crescimento de axônios a partir do lado neuronal, atravessando os canais centrais do MCP montado. Dois dias depois, monitore a entrada de axônios nos canais centrais.

Uma vez que os axônios entram no canal central, normalmente atravessam para o outro lado em até um dia. Os axônios permanecem intactos por pelo menos uma semana após atravessarem para o outro lado. Dissocio o cérebro de P1 a P3 para semear astrócitos em placas de 10 centímetros revestidas com poliuretano.

Cultive as células, repondo diariamente o meio de cultura de astrócitos durante os dois dias seguintes e, depois, a cada três dias após sete dias, quando os astrócitos tiverem formado uma monocamada com cerca de 90% de confluência; nesse momento, recolha as células utilizando tripsina. Cerca de cinco dias após o plaqueamento dos neurônios, aspire o GDNF. Em seguida, semeie 150 microlitros dos astrócitos re-suspensos no lado esquerdo do MCP montado. Quando os axônios estiverem prestes a entrar ou tiverem acabado de entrar no lado esquerdo do MCP montado, após o replaqueamento dos astrócitos, eles interagem diretamente com os astrócitos, seja por contato axonal direto ou pela liberação de fatores solúveis.

Monitore os astrócitos quanto à adesão à área de retenção celular. Imunomarque as células no sistema de co-cultivo compartimentalizado para visualizar proteínas específicas, como aquelas envolvidas na interação entre os axônios e os astrócitos. O sistema de co-cultivo compartimentalizado de neurônios e astrócitos permite que apenas os processos neuronais, especialmente os axônios, interajam seletivamente com os astrócitos.

Aqui descrevemos a ativação transcricional induzida por axônios do transportador de glutamato em astrócitos. Esses estudos utilizam camundongos transgênicos, que possuem a expressão de um repórter fluorescente de EGF sob o controle do promotor genômico GT1. Uma alta densidade de neurônios é cultivada na área de retenção celular do MCPA montado; a vista ampliada mostra os axônios cruzando os canais centrais e entrando no outro lado, com coloração para tubulina beta 3 revelando o cone de crescimento axonal.

O sistema MCP permite o monitoramento dos feixes de axônios enquanto eles crescem através do canal central e entram no outro lado. A imunomarcação para GT um identifica astrócitos no lado glial do sistema MCP. A imagem mostra o contato entre axônios e astrócitos positivos para GLT um aqui.

A expressão do repórter EGFP correlaciona-se com a ativação do promotor endógeno GT um, expressão proteica e atividade funcional. A avaliação da atividade do promotor GT um em astrócitos individuais em C dois mostra uma imunorreatividade GLT um significativamente aumentada no sistema de co-cultura compartimentalizado. Importante, o sistema MCP permite imagens em intervalos para monitorar alterações dinâmicas.

Por exemplo, esses dados mostram a ativação do promotor GT um induzida por axônios com astrócitos GT um EGFP e neurônios selvagens um dia após o plaqueamento dos astrócitos. Mínima fluorescência EGFP é observada. A intensidade EGFP aumenta significativamente 48 horas após o co-cultivo, quando os axônios já estão bem na região dos astrócitos e interagem entrando em contato direto com os astrócitos aqui.

O tratamento com quinina no lado neuronal do MCP montado induziu a morte celular neuronal. Curiosamente, também estimulou a retração e degeneração axonal, bem como a diminuição da fluorescência axonal de EGFP. Essas mudanças dinâmicas na intensidade da fluorescência de EGFP em resposta aos axônios demonstraram claramente que a atividade do promotor Astroglia GT um é modulada pela interação com os axônios.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estabelecer o sistema de cultura de núcleo utilizando a plataforma de cultura microfluídica; uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada corretamente em alguns dias.