Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando

O objetivo geral deste procedimento é investigar o ponto de verificação de danos ao DNA utilizando extratos de ovos de xip como sistema modelo. Primeiro, prepare um extrato de baixa velocidade a partir de ovos de xip. Em seguida, prepare cromatina de espermatozoides danificada com abordagens que induzem danos ao DNA, como MMS e luz UV.

Prepare também a estrutura que imita dano ao DNA. Um T 70 prossegue para ativar o ponto de verificação de dano ao DNA na LSE com a cromatina espermática danificada ou com o a T 70. Em última análise, os resultados obtidos em blots podem fornecer informações sobre o ponto de verificação de dano ao DNA mediado pelo a TR no extrato de ovo de xenopus.

Olá. Aqui é CH Y do departamento de biologia da UNC Charlotte. Hoje vamos mostrar como o extrato de pus é usado como sistema modelo para investigar a sinalização do ponto de controle de dano.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de instabilidade dinâmica, como a forma como o ponto de verificação de dano D é ativado. Este protocolo destina-se à preparação de extrato de óvulo opus e reagentes indutores do ponto de verificação de dano no DNA, bem como à análise do ponto de verificação de dano no DNA e do xap. Essas técnicas são adaptáveis a diversas abordagens de dano ao DNA, incluindo NQO quatro e etoposídeo.

Para estudar o ponto de verificação do dano no DNA, vamos começar. Para primar as fêmeas adultas de Xenopus subcutaneamente, injete os sacos linfáticos dorsais com 100 unidades de PMSG. Após aguardar no mínimo dois dias, induza a postura dos ovos injetando em cada rã previamente primada 500 unidades de gonadotrofina coriônica humana subcutaneamente no saco linfático dorsal. Incube as rãs injetadas por 14 a 20 horas em baldes separados contendo dois litros de solução de Ringer modificada de Marc.

Retire os sapos dos baldes e despeje a solução MMR até que cerca de 100 mililitros permaneçam. Em seguida, transfira os ovos dos baldes para um béquer de 250 mililitros e remova o gel ao adicionar 100 mililitros de cisteína a 2% pH 7,8 aproximadamente a cada 30 segundos. Agite suavemente os ovos com uma pipeta de Pasteur de vidro invertida com diâmetro de 0,7 centímetros, decante e substitua por cisteína fresca duas vezes.

O processo de remoção da camada exterior será concluído em cerca de cinco a quinze minutos. Quando os ovos formarem uma camada mais condensada no fundo do béquer, após descartar a solução de cisteína, lave os ovos três vezes com solução 0,25 XMMR. Agite os ovos com uma pipeta de vidro e examine a presença de ovos ruins inchados e brancos, que tendem a se acumular no centro do béquer.

Remova os ovos estragados com uma pipeta de Pasteur. Em seguida, lave os ovos três vezes com tampão de lise de ovos. Remova quaisquer ovos estragados adicionais e, então, despeje os ovos em um tubo cônico de 14 mililitros.

Compacte os ovos por centrifugação durante 55 segundos a 188 vezes G. Usando uma centrífuga clínica de bancada com rotor de cesto oscilante, remova o excesso de puffer acima da camada de ovos. Agora, para cada mililitro de ovos compactados, adicione 0,5 microlitros de 10 miligramas por mililitro de aprotinina, leptina ou AL e 0,5 microlitros de cinco miligramas por mililitro de citocina B ou cyto B, e centrifugue os ovos a 16.500 vezes G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Usando a centrífuga superveloz Sarva RC seis plus com rotor HB seis de cesto oscilante, após a centrifugação, as frações se separam em três camadas no tubo: extrato lipídico e pigmento de gema, de cima para baixo, respetivamente. Fure a lateral do tubo falcon na porção inferior da camada do extrato intermediário com uma agulha de 21 gauge.

Remova cuidadosamente a agulha, pois a agulha de punção pode estar obstruída por plástico. Insira uma nova agulha de 21 gauge conectada a uma seringa de um mililitro no local da punção. Para coletar o extrato.

Aspire lentamente o extrato, evitando bolhas de ar e contaminação com as camadas de lipídios e pigmento de gema. Transfira os extratos para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro resfriado. Para cada mililitro de extrato de ovo, adicione 10 microlitros de 10 miligramas por mililitro.

Cicloeximida: um microlitro de 10 miligramas por mililitro. A pronina leptina, um microlitro de cinco miligramas por mililitro de citocina B, um microlitro de DTT um molar e 0,33 microlitros de 10 miligramas por mililitro. Ole misturado invertendo suavemente o extrato de ovo pelo menos 10 vezes, mas o extrato de baixa velocidade deve ser usado dentro de quatro horas, pois a qualidade do LSE é comprometida.

Após quatro horas ou um descongelamento livre, dissolva os dois oligonucleotídeos sintéticos em água na concentração de dois microgramas por microlitro. Adicione 100 microlitros de cada oligo a um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e incube por cinco minutos em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius. Retire o bloco de banho seco com o tubo contendo a mistura de oligos e deixe esfriar até a temperatura ambiente; separe alíquotas de 10 microlitros para armazenar a menos 20 graus Celsius.

A amostra de AL agora é um duplex A T 70 numa concentração final de dois microgramas por microlitro. Prepare a cromatina de espermatozoide normal conforme descrito por Tudor e Walter até obter 0,5 mililitros de cromatina. Adicione 5,5 microlitros de MMS 9,1 molar.

Coloque o tubo com a amostra em um rotador à temperatura ambiente por 30 minutos, utilizando a centrífuga clínica IE CCL dois com rotor de cestos oscilantes e adaptadores de tubos. Centrifugue a amostra a 686 vezes G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e lave o pellet em 0,5 mililitros de tampão X contendo B-S-A-D-T-T-A proin e leptina.

Repita este processo três vezes e ressuspenda o pellet em 0,5 mililitros. Tampão x. Determine a concentração de cromatina espermática com um hemocitômetro.

Em seguida, dilua a amostra para 100.000 espermatozoides por microlitro e armazene alíquotas de cinco microlitros a menos 80 graus Celsius. Adicione a quantidade desejada de cromatina espermática normal na superfície de um pedaço de parafina e coloque a amostra em um crosslinker de UV. Ajuste o parâmetro de energia desejado e inicie a danificação da cromatina espermática por meio de luz UV.

Utilize imediatamente a cromatina espermática tratada com UV para induzir o ponto de verificação de dano ao DNA no extrato preparado de baixa velocidade. Combine 50 microlitros de LSE, um microlitro da mistura de energia e dois microlitros de cromatina espermática danificada. Incube a reação à temperatura ambiente por 90 minutos, certificando-se de agitar suavemente o tubo a cada 10 minutos após pelo menos 30 minutos.

Após a incubação, dispense um microlitro da mistura de reação sobre uma lâmina de microscopia e adicione um microlitro da solução de corte nuclear. Coloque uma lamínula e verifique a formação de núcleos por microscopia de fluorescência. Normalmente, núcleos esféricos se formarão após 30 minutos de incubação, indicando que a replicação do DNA foi iniciada.

Também avalie 10 microlitros da mistura de reação por imunoblotagem utilizando anticorpos anti-check one. Combine 50 microlitros de LSE, um microlitro da mistura de energia e 1,6 microlitros do estoque de toto micina em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione 1,25 microlitros de um duplex de DNA T70 a duas microgramas por microlitro ou água para o controle negativo.

Incube as reações à temperatura ambiente por 90 minutos e agite suavemente os tubos de reação a cada 10 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura de reação em 90 microlitros de tampão amostral para análise ocidental de sangue para verificar uma proteína. A cromatina espermática danificada ou a estrutura que imita dano ao DNA efetivamente dispara uma verificação de um ponto de controle de dano ao DNA mediado por TR no sistema de extrato de óvulo xop, em comparação com o controle induzido por MMS.

Verifique uma fosforilação na serina 344, que é um indicador da ativação da cinase TR. De maneira semelhante, uma T 70 em uma estrutura que imita dano ao DNA também induz a fosforilação da verificação um. Após dominar o preparo do LSE, o procedimento pode ser concluído em cerca de uma hora.

Como a qualidade do extrato diminui após aproximadamente quatro horas, velocidade e eficiência são essenciais. Esses métodos podem ser combinados com outras abordagens para responder perguntas fundamentais sobre sinalização do ponto de verificação de danos ao DNA. Por exemplo, pode-se realizar um imunodepleção para testar se uma proteína-alvo é necessária no ponto de verificação de danos ao DNA.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar o ponto de verificação de danos no DNA utilizando extrato de ovo de rã como sistema modelo. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.