Microinjeção insulina hipocampal e

O objetivo geral deste procedimento é medir o metabolismo do hipocampo durante testes comportamentais. Isso é realizado preparando cirurgicamente um animal bem manipulado com uma cânula-guia para microdiálise. No dia do teste, uma sonda de microdiálise é inserida na cânula e o fluxo PERFUSE eight é confirmado.

Em seguida, permite-se que a sonda equilibre enquanto o animal permanece em uma câmara de controle. Por fim, métodos analíticos apropriados, por exemplo, uma reação de glicose oxidase, NADP, N-A-D-P-H e análise fluorométrica. Se a medição da glicose for utilizada para demonstrar o nível de metabolismo e/ou liberação neuroquímica ao longo do período de teste, um dos aspectos mais difíceis dessa técnica é o cuidado necessário no manuseio dos tubos de microdiálise e também o fato de os animais frequentemente roerem ou embaraçarem os tubos caso não se tome cuidado.

Então, a primeira vez que utilizei microdiálise hipocampal durante testes comportamentais foi durante meu trabalho de pós-graduação, e queríamos verificar se os modelos existentes sobre o fornecimento de glicose eram, de fato, compatíveis com os dados psicológicos conhecidos sobre a melhoria da memória pela glicose. Essa metodologia nos permitiu demonstrar que, na realidade, os modelos existentes de glicose aplicados ao cérebro estavam completamente errados.

Após seguir os procedimentos cirúrgicos padrão, prepare o animal, exponha o crânio e faça furos para a colocação da cânula. Insira uma cânula nas coordenadas predeterminadas e, em seguida, abaixe-a lentamente até a profundidade alvo. Uma vez corretamente posicionada, fixe a cânula no lugar com cimento dental.

Utilize um fio cirúrgico estéril para fechar a ferida, se necessário. Por fim, utiliza-se um estilo para manter a perviedade da cânula. Em seguida, prepare o PERFUSE oito para ser usado na microdiálise.

Deve-se observar que a composição exata do fluido é essencial para resultados ideais. No dia do teste, a albumina sérica bovina BSA deve ser adicionada e completamente dissolvida. Após o preparo, o PERFUSE eight deve ser filtrado através de um filtro de 0,2 mícron.

Em seguida, prepare o tratamento que será administrado ao cérebro, se houver, utilizando uma alíquota do ECF-A preparado. Aqui, a insulina é preparada para entrega no hipocampo. Uma sonda de microdiálise nova e sua linha devem ser preparadas no dia anterior ao teste.

Crie duas linhas separadas para entrada e saída. Use tubo PE 50 para conectar duas peças de tubo FEP com um metro de comprimento e certifique-se de que haja um espaço morto mínimo entre as linhas. Os tubos devem ser cortados conforme mostrado, criando extremidades inclinadas para facilitar a inserção nos conectores PE 50.

Conecte a tubulação de entrada a uma seringa Hamilton de um mililitro cheia com água desionizada estéril filtrada e fixe a sonda na outra extremidade, permitindo que o animal se mova livremente durante as medições. Conecte as linhas de entrada e saída a um comutador de dois canais. Em seguida, conecte a tubulação de saída à bomba e execute-a a 1,5 microlitros por minuto até observar água desionizada saindo pelo tubo de saída na sonda.

Desligue a bomba e conecte a outra linha entre o tubo de saída e um tubo de coleta de amostra. Passe cinco mililitros através do tubo e coloque a sonda em um frasco contendo água desionizada estéril durante a noite, garantindo que a ponta da sonda permaneça sempre úmida. 24 horas antes do teste, prepare o sujeito de teste removendo o estilo falso e inserindo uma sonda de microdiálise que é usada exclusivamente para essa finalidade.

Durante 10 minutos após, substitua o estilo fictício e coloque o rato de volta em sua gaiola. Alternativamente, use uma sonda nova nesta etapa e deixe-a no lugar sem remoção até realizar as medições. No dia seguinte.

No dia da microdiálise, preencha a seringa Hamilton e o frasco de cintilação com A ECF filtrado e deixe a bomba equilibrar por uma hora. Se necessário, preencha uma segunda seringa Hamilton com o tratamento preparado e coloque-a na bomba de seringa. A chave para o sucesso neste procedimento é permanecer calmo e manipular o animal de forma muito cuidadosa.

Portanto, mantenha-se calmo, mova-se lentamente e com precisão e, acima de tudo, pratique. Quando a equilibração estiver completa, remova o estilote simulado e insira suavemente a sonda de microdiálise equilibrada no cérebro do rato através da cânula. Coloque o rato em uma caixa de plástico transparente que contenha um pouco da cama usada na sua gaiola de origem.

Certifique-se de contrabalançar o tubo. Prenda um tubo de microcentrífuga de 1,6 mililitro cheio de água ao tubo do lado de fora da gaiola de forma que a gravidade mantenha as linhas de microdiálise sem dobrar, mas sem ficar esticado. Deixe a sonda e o rato se equilibrarem por duas horas.

No início deste período, confirme que o fluxo do Perfuse oito está desobstruído. Para isso, colete o efluente do PERFUSE oito durante um período definido e pese a amostra para confirmar que o volume esperado está saindo do sistema antes de coletar as amostras. Certifique-se de que a correlação entre a diálise da amostra e a coleta seja calculada com precisão.

Aqui temos um volume de 30 microlitros entre a sonda e o ponto de coleta, a uma taxa de 1,5 microlitro por minuto. Há um atraso de 20 minutos entre a saída da amostra do cérebro e sua coleta. Após o período de equilíbrio, colete pelo menos três amostras enquanto o rato está em repouso na câmara de alojamento.

Para estabelecer uma linha de base estável de medições antes dos testes comportamentais, planeje cuidadosamente o cronograma de administração do seu tratamento ao cérebro. Assim, nesta configuração, em que temos um volume de 30 microlitros entre a ponta da seringa e a sonda que entra no cérebro do animal, trocamos a seringa do tratamento pela solução de tratamento profusa oito 20 minutos antes de o momento em que desejamos que o tratamento chegue ao hipocampo. Para trocar as seringas.

Basta desconectar a linha de entrada da seringa de controle do PERFUSE eight e conectar rapidamente à seringa de tratamento do PERFUSE eight. Isso deve levar não mais do que cinco segundos para evitar interrupção no fluxo do PERFUSE eight. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar, que podem reduzir a eficiência no período apropriado.

Após a administração do tratamento, mova suavemente o rato para o aparelho escolhido para testes comportamentais. Aqui, a alternância espontânea é medida em um labirinto em forma de cruz. Permita que o animal explore livremente o labirinto por 20 minutos.

Registre a sequência e o cronograma dos braços de áries, utilizando uma gravação em vídeo ou manualmente, para coletar amostras. Durante este período, transfira o tubo de saída para um novo tubo de coleta. A cada cinco minutos, segure o tubo de modo que ele se mova livremente.

Não deve restringir o movimento da rata nem se mover à frente do animal e distraí-lo; permaneça imóvel para que seus movimentos não afetem o comportamento da rata. Após o teste, retire cuidadosamente a rata do labirinto e devolva-a à câmara de controle. Continue a coleta de amostras de microdiálise por pelo menos quatro amostras para cobrir o período de recuperação após a realização da tarefa.

Após coletar as amostras desejadas, remova suavemente a sonda da cabeça do animal e coloque-a em um frasco de armazenamento. Devolva o animal à sua gaiola de origem e observe atentamente qualquer alteração na saúde ou no comportamento após o experimento. Por fim, lave o tubo trocando para uma seringa contendo uma solução de catho para prevenir o crescimento de micróbios.

Este exemplo mostra uma diminuição da glicose no LEC hipocampal associada a uma tarefa. A caixa cinza representa o tempo que o animal passou no labirinto. A linha roxa mostra a glicose hipocampal em animais sem teste no labirinto, enquanto a linha vermelha representa animais realizando a tarefa de alternância espontânea do antebraço.

A linha laranja mostra as medições em animais realizando a versão mais fácil desta tarefa, com três braços. As alterações no hipocampo, glicose e lactato após a administração de insulina são observadas aqui. Observe que essas alterações são vistas sem qualquer teste comportamental e, portanto, refletem o impacto da insulina isoladamente sob condições basais.

Ao realizar este procedimento, é realmente importante permanecer calmo. Os ratos podem perceber o estresse do experimentador e ficarão agitados, o que pode dificultar muito o procedimento e provavelmente confundir os seus resultados. Esta combinação de técnicas permitiu a investigação neuroquímica precisa de processos comportamentais.

Técnicas semelhantes são agora também utilizadas em pacientes humanos. Por exemplo, pacientes com epilepsia que possuem eletrodos implantados para localizar o foco da crise podem também ter cânulas de microdiálise implantadas para permitir medições metabólicas.