Sequencial de foto-branqueamento de delinear células de Schwann individuais na junção neuromuscular

O objetivo geral do experimento a seguir é delinear células schwan únicas na junção neuromuscular usando microscopia confocal. Este protocolo usa camundongos transgênicos que expressam GFP em células schwan terminais e axonais. O primeiro passo é dissecar um explanação do músculo nervoso.

Em seguida, o branqueamento sequencial de todas as células de schwan, exceto uma, em uma determinada junção neuromuscular é realizado, revelando a morfologia de uma única célula. Finalmente, um mapa de baixo poder é criado. O tecido é fixado e usado para imuno-histoquímica para visualizar qualquer marcador desejado em relação à célula de schwan não branqueada restante.

Os resultados mostram morfologia de célula única e, se desejado, microscopia de lapso de tempo ou análise de colocalização imuno-histoquímica em tecido fixo com base em imagens confocais. Embora este método possa fornecer informações sobre a morfologia e o território de células de cisne individuais na junção neuromuscular. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como linhagens celulares, fatias de cérebro vivas ou até mesmo outras espécies como o peixe-zebra.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque é preciso alguma experiência para identificar uma junção neuromuscular suficientemente superficial e não perder tempo com estruturas que simplesmente não valem o esforço. Antes de iniciar a cirurgia, oxigene e resfrie a solução de ringer por pelo menos 15 minutos. Coloque uma placa de cultura de tecidos de 15 centímetros com gelo sob um microscópio. Cubra-o com uma placa de metal.

Coloque a placa de cultura de tecidos de 10 centímetros cheia de solução de ringer na placa de metal. Coloque a pedra de oxigenação na solução. O próximo passo é selecionar um mouse que tenha seus cisnes e axônios rotulados em cores diferentes.

Depois que o camundongo for sacrificado, borrife-o com etanol Para evitar a contaminação do pelo, use uma tesoura grande para fazer uma incisão na linha média sobre o esterno e duas incisões paralelas à borda inferior da caixa torácica. Remova a pele, abra o abdômen e disseque os músculos peitorais com incisões próximas à inserção muscular no esterno. Use uma pinça para segurar a cartilagem xifóide e corte o diafragma logo abaixo da cartilagem xifóide.

Disseque o diafragma ao longo de suas inserções costais. Ocasionalmente, molhe o tecido com solução de ringer para evitar o ressecamento usando uma pinça para segurar a caixa torácica pelo processo xifóide. Comece a cortar as costelas da coluna vertebral o mais próximo possível de suas inserções.

Os cortes esquerdo e direito devem convergir acima do coração em direção ao olho severo do manúbrio. Tente evitar cortar os principais vasos sanguíneos, especialmente as veias subclávias. Para melhor visibilidade.

Levante suavemente a preparação enquanto segura o processo xifóide com uma pinça. Agora faça um corte transversal logo abaixo do olho da popa do manúbrio para remover o tórax e transfira o X explan para o prato de 10 centímetros com a solução de campainha preparada. Coloque o prato na placa de metal e o prato cheio de gelo sob o microscópio sob o microscópio.

Usando uma pequena tesoura de mola, remova os restos do timo, pleura, diafragma e músculos peitorais. Usando uma tesoura de mola pequena, disseque todas as costelas que não se inserem no esterno. Corte o tecido entre as costelas.

Isso permite que o X explan caiba em um prato revestido com proteção SIL de 3,5 centímetros. Agora, usando oito a 10 pinos de minuchin encurtados, prenda o explane X, evitando o músculo triangular do olho da popa apontado aqui. Dois pinos devem passar pelas partes cartilaginosas do esterno e dois pinos devem passar pelas partes cartilaginosas mais macias entre as costelas.

Evite perfurar as costelas sob ou perto do músculo triangular. Continue prendendo até que as costelas estejam um pouco abertas. Fixando o músculo em uma posição ligeiramente alongada.

Transfira o prato revestido com proteção de peitoril de 3,5 centímetros para um microscópio confocal equipado com um laser Argonne e objetivas de imersão em água. Para uma microscopia de lapso de tempo, insira o prato revestido com proteção de soleira de 3.5 centímetros no anel de aquecimento. Instale um sistema de superfusão e instale uma sonda de temperatura.

Certifique-se de que nada toque na explicação, na borda do prato ou no revestimento do charuto. Para microscopia de lapso de tempo, aqueça o X explan, mas para o branqueamento de células de Schwan, a temperatura ambiente é melhor. Agora, com uma objetiva de ar Forex, observe o padrão de inervação do músculo triangular do olho da popa e encontre a banda triangular da placa final do olho da popa.

Mude para a objetiva de cone de imersão de 20 x e comece a procurar regiões superficiais dentro das áreas da banda nplate. Sobrepondo as costelas e perto dos nervos intercostais são boas regiões candidatas. Mude para a objetiva de cone de imersão de 100 x ou 60 x para verificar o indivíduo e os mjs.

Idealmente, localize uma NMJ coberta por várias células de schwan que está localizada muito superficialmente Crítico para o sucesso deste protocolo é encontrar sua junção neuromuscular superficial e plana. Como a junção neuromuscular está inovando as fibras musculares cilíndricas, ela tende a ser enrolada em torno da fibra e as mãos muitas vezes não têm o ângulo perfeito para a imagem. Selecione apenas as junções neuromusculares que são superficiais, planas e na superfície Agora usando uma objetiva de abertura numérica de 100 x 1,0.

Com um zoom de 2,5, adquira uma imagem confocal da JNM. Essas configurações fornecem um tamanho de pixel de cerca de 0,1 micrômetros, garantindo uma amostragem espacial adequada de acordo com o critério de nyquist. Agora fotobranqueie a célula de schwan estacionando o feixe de laser de 488 nanômetros centralmente no núcleo usando potência máxima por cinco segundos.

Em seguida, concentre-se novamente na célula e julgue o resultado do clareamento. Se necessário, repita a etapa de branqueamento novamente até que os níveis de GFP sejam reduzidos para níveis próximos aos níveis de fundo e, em seguida, adquira outra imagem. É fundamental certificar-se de que a região branqueada esteja fora de qualquer sobreposição entre duas células.

Se houver sobreposição, o branqueamento em uma segunda célula será óbvio. Quando feita corretamente, essa abordagem resulta em células finais claramente reveladas, muitas vezes com uma morfologia bastante surpreendente que não se poderia adivinhar antes de iniciar o procedimento. Repita o processo de branqueamento até que todas, exceto uma das células de schwan, estejam branqueadas.

A última célula de schwan não branqueada é adequada para microscopia de lapso de tempo confocal. Depois de concluir a imagem de lapso de tempo, faça um mapa desses njs tirando uma imagem a 100 x sem zoom, depois imagens da região usando a objetiva de 20 x e repita o processo usando a objetiva de quatro x. Este mapa é necessário para encontrar njs seguindo a química imunoquímica de um músculo fixo.

Após a imagem e o branqueamento, solte o explane e transfira-o para um tubo de 50 mililitros com pelo menos 15 mililitros de 4% de PFA. Em seguida, coloque o tubo no gelo por uma hora após resfriar o tecido por uma hora, enxágue com glicina 0,1 molar em PBS por pelo menos 10 minutos. Em seguida, transfira a explicação fixa para uma placa de cultura de tecidos revestida com protetor de seda de cinco centímetros preenchida com PBS de 0,01 molar e prepare-se para dissecar ainda mais a explicação.

Primeiro, corte uma forma trapezoidal com um lado paralelo ao esterno e o outro através das transições de osso para cartilagem. Este contém o músculo triangular em sua superfície. Em seguida, remova as costelas inferiores com um corte horizontal ou transesternal para que a extremidade do músculo triangular possa ser acessada livremente.

Agora insira uma agulha hipodérmica como um pino na parte superior do trapézio. Em seguida, remova o músculo triangular. Primeiro, use uma pinça para segurar suavemente o canto do músculo.

E segundo, use uma seringa e uma agulha como um microbisturi para cortar paralelamente ao plano da parede torácica. Uma vez que a parte do músculo é liberada, insira outra agulha abaixo do músculo através da parede torácica para imobilizar a preparação. Ao cortar as inserções do tecido conjuntivo, retire o músculo do tórax com um puxão suave da pinça.

Finalmente, remova os restos de gordura e vasos sanguíneos usando uma pinça. Tenha cuidado para não arrancar os nervos. O músculo triangular está agora pronto para imuno-histoquímica.

Um explanante triangular do olho da popa usando camundongos expressando GFP sob o promotor PLP foi preparado para visualização ex vivo de células schwan. Os axônios podem ser visualizados simultaneamente cruzando P-L-P-G-F-P com a coxa de um camundongo OFP três. Usando o protocolo descrito, a morfologia das células schwan terminais únicas foi revelada em detalhes surpreendentemente altos, branqueando as duas células schwan terminais vizinhas e as primeiras células schwan axonais vivas.

As junções neuromusculares imageadas foram rastreadas usando o mapa criado anteriormente e escaneadas em alta resolução no tecido fixo após microscopia confocal ao vivo, o explane triangular da popa foi fixado e corado. Aqui são mostrados os receptores de acetilcolina marcados com bangalô acoplado a Alexa 6 47 em vermelho e vesículas sinápticas marcadas com um anticorpo antis sinaptofisina em branco. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a morfologia de células individuais, que inicialmente foram todas marcadas pela mesma proteína fluorescente e compactadas muito densamente para serem resolvidas individualmente.

Nosso exemplo mostra a junção neuromuscular, mas existem muitas outras aplicações potenciais.