Name: MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a técnica de passagem de linhagens de células-tronco embrionárias humanas HuES usando tripsina. Este protocolo padronizado mantém culturas saudáveis, indiferenciadas e com cariótipo normal para pesquisa.

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Geral Recomendamos descongelamento não mais do que uma amostra em um determinado momento para garantir uma fácil manipulação. O manipulador deve tomar cuidado para não deixar culturas à temperatura ambiente e baixas emissões de CO2 por longos períodos de tempo. Todos os centrifugação de células vivas é feito em 500-600 xg por 5 min à temperatura ambiente. MEFs (células embrionárias de camundongos Feeder) <ol><li> Pré-aquecer media MEF a 37 ° C. Remover o frasco MEF de -80 ° C e imediatamente mergulhe a metade inferior do tubo em banho-maria a 37 ° C. Deve ter cerca de 30-45 segundos antes de as células são descongeladas 80% (porção pequena congelados esquerda). </li><li> Rapidamente trazer o tubo para a capela de fluxo laminar, lavar com álcool a 70%, e de transferência de células pré-aquecido mídia. </li><li> Aspirar a solução de gelatina a partir de chapas preparado anteriormente. </li><li> Alíquota de 2 ml de solução de MEF em uma queda de maneira sábia em cada um dos seis poços. Certifique-se de distribuir o MEFs uniformemente sobre o bem. Data da placa MEF, e coloque em uma incubadora de 37 ° C durante a noite para permitir MEFs para anexar ao prato. </li><li> Após 6 horas MEFs será anexado ao prato. É melhor usar placas MEF 24-48 horas após o plaqueamento. NÃO use uma placa MEF que tem mais de 4 dias de idade. </li><li> Pré-aquecer meios tons e 0,05% Tripsina / EDTA a 37 ° C Sob o capô, prelabel um tubo estéril 50 ml. </li><li> Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação tonalidades da cultura a ser dividida. Delicadamente, lave os poços com 2ml de solução de 1X tampão fosfato (PBS) por poço. Aspirar o PBS. Adicionar 0,75 ml 0,05% Tripsina / EDTA para o bem. </li><li> Substituir a tampa, e observar as células sob a ampliação de 4x. O MEFs redor das colônias MATIZ deve começar a retrair. Quando o MEFs são suficientemente arredondadas e as fronteiras das colônias tons são ásperas, devolver o prato para o capô. Este processo deve levar cerca de 5 minutos, absolutamente não mais que 10 minutos ou suas células não vai voltar a crescer. </li><li> Pipeta suavemente para cima e para baixo, lavando o fundo do poço, até que a monocamada MEF foi completamente isolada (monocamada é pegajoso e podem permanecer em uma única peça). </li><li> Transferir a suspensão celular a um tubo de 50 ml contendo mídia adicional matizes. Girar o tubo de células 500xg por 5 minutos, Aspirar fora da mídia, tenha cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> A placa em um novo prato de MEFs, adicionar o volume adequado de células para determinada mídia adicional matizes, e pipetar a solução 5-7 vezes com uma pipeta automática. </li><li> Remova a mídia MEF de uma placa fresca de MEFs. </li><li> Alíquota a queda solução MATIZ sábio para cada poço, certificando-se de distribuir as gotas uniformemente sobre o bem. Sem agitar o prato, cuidadosamente as células voltem ao a 37 ° C durante a noite para deixar incubadora MATIZ semente colônias. </li><li> MATIZ células saindo de uma separação deve se comportar de forma semelhante aos saindo de um degelo. </li></ol>

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Neste vídeo demonstramos como nós MATIZ rotineiramente passagem humana linhas de células-tronco embrionárias em nosso laboratório. Divisão eficiente e regular e passaging é essencial para manter uma saudável linha de células estaminais embrionárias humanas. Tripsina passagem mediada é uma vantagem significativa de linhas de células MATIZ, no entanto, é importante não para mais de trypsinize culturas ou ter uma grande proporção de células isoladas durante a re-tecendo.

MATIZ media 651,5 ml KO-DMEM 500 ml 6,5 ml PenStrep GlutaMAXTM 6,5 ml 6,5 ml NEAA 2-mercaptoetanol 0.5ul KO substituição Serum 65 ml 65 ml Plasmanate bFGF2 (10 ng / mL final) 0,65 ml

matiz passaging-tronco embrionárias humanas cell-linhas com tripsina

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina. Células estaminais embrionárias humanas são artefatos da cultura celular, e tendem a adquirir anormalidades cariotípicas com duplicações populacional. Passaging adequada é essencial para manter uma alimentação saudável, indiferenciado, tons karyotypically normais embrionárias humanas de cultura de células-tronco. Primeiro, uma cultura em expansão é lavado em PBS para remover a mídia residuais e restos celulares, em seguida, as células são cobertas com um volume mínimo de 0,05% quente Tripsina-EDTA. Tripsina é deixado sobre as células por até cinco minutos, e depois as células são delicadamente desalojado com uma pipeta 2 mL sorológicos. A suspensão de células é coletada e misturada com um grande volume de mídia matizes, em seguida, as células são coletadas por centrifugação suave. A mistura de tripsina inativada mídia é removido e as células ressuspendidas em meio pré-aquecido matizes. Uma razão de separação adequada é calculada (geralmente 1:10 - 1:20), e células re-banhado em uma placa 1-2 dia de idade contendo uma monocamada de células irradiadas do mouse alimentador embrionárias fibroblastos. A placa de cultura recém-semeado matizes é deixado em repouso por 48 horas, então a mídia é trocada a cada dia depois disso. É importante não trpsinize para baixo a uma suspensão de células individuais, pois isso aumenta o risco de introdução de anormalidades cariotípicas.

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Neste vídeo, demonstramos como o nosso laboratório realiza rotineiramente a passagem de linhagens de células-tronco embrionárias humanas HuES com tripsina. As células-tronco embrionárias humanas são artefatos...

Isto é, onde você executou as técnicas? Oh, onde eu te ensinei? A primeira vez que te ensinei Bel, passei o verão no meu T.Yeah.E isso foi como, nós gostamos de coisas de cartilagem lá. E então eu gostava da cultura social lá. E então, em Hopkins, no meu último ano, trabalhei com diferentes, então eu, como a coisa da engenharia, era muito mais sobre tentar, nós projetamos isso tridimensional.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

A diferenciação do ESC coincide com células tipo mudanças específicas na estrutura e composição da cromatina. A detecção dessas mudanças fornece informações valiosas sobre os mecanismos que definem stemcellness e diferenciação celular. Cromatina imunoprecipitação (CHIP) representa um método valioso para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes à diferenciação de células-tronco.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

Cariótipo é uma técnica simples e útil amplamente utilizado para detectar alterações genéticas. Descrevemos aqui um passo a passo protocolo para a preparação cromossomo disseminação de células estaminais embrionárias humanas para monitorar o estado cromossômica dessas células mantidas em cultura.

Preparação Spread cromossômica de células estaminais embrionárias humanas para Cariotipagem

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar...

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

O micro-dissecados técnica de explantes é um método robusto e confiável para isolar proliferativa das células do músculo esquelético juvenil, adulto ou músculos embrionárias como fonte de células-tronco do músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células têm sido clonal para produzir derivados do músculo esquelético linhas de células-tronco usado para in vivo o transplante.

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Este método pode ser usado para examinar o encurtamento do sarcomere usando cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco com proteínas de sarcomere marcadas por fluorescentes.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

Este protocolo apresenta a diferenciação de osteoclastos humanos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e descreve métodos para a caracterização de osteoclastos e precursores de osteoclastos.

Diferenciação e Caracterização de Osteoclastos de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas

Aprenda a técnica de passagem de linhagens de células-tronco embrionárias humanas HuES usando tripsina. Este protocolo padronizado mantém culturas saudáveis, indiferenciadas e com cariótipo normal para pesquisa.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

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