Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

O objetivo do experimento a seguir é ativar e estudar circuitos neuronais a longo prazo em camundongos acordados e comportados. Este método é adaptado do conceito originalmente descrito em Sparta etal. Isso é conseguido primeiro montando um cabo de acoplamento de fibra óptica, que conecta a junta rotativa óptica ao implante de fibra óptica.

Em seguida, a fibra óptica é implantada sobre o tecido cerebral de interesse para criar uma passagem para a luz viajar diretamente para o canal de neurônios que expressam redina. Finalmente, a fonte de luz é conectada à junta rotativa óptica para criar um caminho conectado em série da fonte de luz ao tecido cerebral. Em última análise, o disparo induzido por luz de neurônios que expressam redsina de canal pode ser avaliado com base em estudos in vivo, eletrofisiológicos e comportamentais.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como cânulas guia, é que ela minimiza os danos ao tecido cerebral causados pela inserção e remoção repetidas de uma fibra óptica. Embora esse método possa fornecer informações sobre a função do circuito neural, ele também pode ser aplicado a outros sistemas para entender melhor os mecanismos dependentes de sinapse e circuito subjacentes a certos tipos de distúrbios neurológicos. A demonstração visual desse método é crítica.

Como as etapas de implantação são difíceis de dominar, cada etapa aparentemente menor contribui muito para a estabilidade geral e confiabilidade do método. Comece cortando 35 milímetros de uma fibra óptica de 125 mícrons de diâmetro com um núcleo de 100 mícrons, posicionando um escriba de carboneto de ponta de cunha perpendicular à fibra óptica e marcando a fibra em um único movimento unidirecional seguido de puxar para fora. Agora, insira um feral cerâmico lc com um 127 mícrons em um diâmetro furo lado convexo apontado para baixo em um torno e, em seguida, insira a peça de fibra óptica no selvagem.

A fibra óptica deve deslizar suavemente e se projetar marginalmente além da extremidade convexa do selvagem. Em seguida, aplique uma gota de epóxi de fibra óptica curável por calor recém-preparado na extremidade plana do e, em seguida, aplique uma pistola de calor no epóxi. O epóxi deve preencher o selvagem à medida que é aquecido e é curado quando fica preto.

Após a cura, limpe qualquer epóxi das laterais do feral e, em seguida, usando um disco de polimento de fibra óptica lc, faça padrões de rotação circular para polir a extremidade convexa do feral em folhas de polimento de óxido de alumínio em uma almofada de polimento em quatro graus decrescentes. Em seguida, corte a fibra óptica na extremidade plana no comprimento apropriado para atingir a região de interesse. Para testar a fibra óptica polida, insira a extremidade polida do implante na manga do acoplador.

Até que o contato direto com o feral oposto seja sentido, um implante ruim terá um ponto focal fraco próximo à ponta da fibra óptica, enquanto um bom implante transmitirá um círculo concêntrico suave de luz sem saída. Potências de até 10 miliwatts armazenam os implantes acabados em espuma até o uso. Comece esta etapa medindo e, em seguida, marcando uma fibra óptica de 220 mícrons de diâmetro com um núcleo de 200 mícrons para permitir que um mouse se mova livremente, mas não permita que o mouse mastigue a fibra.

Em seguida, insira a fibra óptica em um pedaço de tubo de furação com um diâmetro interno ligeiramente maior e um comprimento ligeiramente menor que os da fibra óptica. Agora, retire cerca de 25 milímetros de uma extremidade da fibra óptica e insira-a na extremidade de metal de um conjunto feral multimodo FC MM. Com um furo de 230 mícrons em um diâmetro até parar, a fibra óptica deve se destacar através da extremidade selvagem.

Em seguida, prenda a conexão com cianoacrilato na extremidade de metal e cubra a conexão com um conector Bote polir a extremidade selvagem com um disco de polimento FC, conforme demonstrado. Depois de descascar a outra extremidade da fibra óptica, insira-a em um feral cerâmico lc com apenas a extremidade convexa distal. Em seguida, aplique uma gota de epóxi na extremidade plana e aqueça até a cura, como acabamos de demonstrar.

Depois de polir a extremidade convexa do feral como acabamos de demonstrar, deslize uma manga lc feral sobre a extremidade convexa do feral até que o feral atinja o ponto médio da manga. Em seguida, coloque um tubo termorretrátil sobre o tubo de ação e a luva e aqueça o tubo termorretrátil para proteger e proteger a conexão. Finalmente, conecte o feral à fonte de laser e teste-o medindo a saída de luz através do acoplador com um espectrofotômetro, a perda de luz entre a saída do laser e a saída medida do acoplador não deve exceder 30% antes de iniciar a cirurgia.

Desinfetar a área cirúrgica com álcool de perfil isop seguido de solução de clorexidina. Em seguida, coloque o mouse no equipamento estereotáxico e prenda a cabeça garantindo que o crânio esteja nivelado. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento e dor pós-operatória.

Agora faça uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio das órbitas oculares até a sutura lambda. Use grampos de serafin para segurar a pele e manter o acesso ao crânio. Em seguida, use um palito de dente para gravar um padrão quadriculado em toda a superfície do crânio.

Lave os detritos resultantes com solução salina estéril. Depois de secar completamente, use um cotonete para aplicar peróxido de hidrogênio a 3% no crânio exposto por cerca de dois a três segundos para criar microporos. Em seguida, lave o crânio várias vezes com solução salina mais estéril e seque-o completamente.

Depois de gravar, lavar e secar o padrão quadriculado no crânio, novamente, insira o implante de fibra óptica selvagem no suporte da sonda e, em seguida, conecte-o ao braço estereotáxico. Determine a localização do orifício da broca com um atlas estereotáxico calibrado para bgma e lambda. Em seguida, use uma broca odontológica rotativa para fazer uma pequena craniotomia com menos de um milímetro de diâmetro acima da região de interesse, tomando cuidado para não quebrar a dura-máter ou danificar qualquer tecido.

Usando a posição estereotáxica do braço o implante diretamente acima da região de interesse, o feral deve repousar sobre o tecido craniano circundante. Agora use um palito estéril para aplicar uma camada fina e uniforme de cimento dental recém-preparado no crânio e na parte inferior do implante. Tomando cuidado para não entrar em contato com a pele do animal, a camada de base do cimento dentário deve cobrir o máximo possível da área de superfície do crânio.

O aspecto mais difícil desse procedimento é aplicar o cimento dental sem que ele toque na massa da pele. Para garantir o sucesso, aplique pequenas quantidades de cimento de cada vez em camadas finas e espere que cada camada seque completamente antes de adicionar a próxima. Aplique camadas uniformes do cimento dentário para formar um pequeno monte no topo do crânio e ao redor do implante.

Deixe os três a cinco milímetros da extremidade convexa do cimento selvagem limpo para permitir uma conexão suave e desobstruída. Em seguida, suture o couro cabeludo sobre o monte de cimento dentário e ao redor do adesivo de ligação veterinária do implante pode ser usado para ligação adicional após a sutura. Finalmente, aplique analgésicos tópicos e antibióticos na pele da sutura e ao redor da base do implante e, em seguida, coloque o camundongo em uma gaiola para recuperação pós-operatória.

A montagem adequada do implante e acoplador de fibra óptica resulta em perda mínima de fótons entre a fonte de luz e a extremidade da fibra óptica na região de interesse. Embora a fibra óptica polida deva transmitir luz em um círculo concêntrico uniforme semelhante ao círculo mostrado aqui, como pode ser visto nesta imagem com implantação e sutura cuidadosas, o implante não causa irritação visível no camundongo e pode permanecer no local por estudos de longo prazo sem qualquer degradação significativa da fibra óptica ou da quantidade de luz transmitida Ensaios comportamentais funcionais em um camundongo acordado mostram uma resposta direta da estimulação através de uma fibra óptica implantada sobre o córtex motor, como evidenciado por este vídeo de eletrofisiologia in vivo mostra a ativação de neurônios direcionados através do implante e a resposta comportamental do animal durante a estimulação cerebral. Após este procedimento, outros métodos, como fotoestimulação de regiões cerebrais específicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são os padrões de conectividade do circuito associados às células-alvo?

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar implantes de fibra óptica e cabos acopladores e como implantá-los sobre o tecido cerebral expressando porters optogenéticos.