Name: Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a implantar fibra óptica para estimulação optogenética crônica em camundongos acordados. Esta técnica minimiza danos teciduais cerebrais e permite estudar circuitos neurais em tempo real.

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Gostaríamos de reconhecer que esta técnica foi descrita originalmente por Sparta et al., 2012 e foi facilmente adaptado para uso em nosso laboratório.

* Todos os materiais, juntamente com respectivos fabricantes e / ou fornecedores estão listados a seguir o protocolo. 1. Assembleia de Implante <ol><li> Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica através da adição de 100 mg de endurecedor a 1 g de resina. </li><li> Medir e cortar aproximadamente 35 mm de 125 fibra óptica com 100 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto cunha ponta. Posicione o escriba perpendicular à fibra óptica e pontuação em um movimento único unidirecional. Cortando a fibra completamente irá danificar o núcleo da fibra. </li><li> Insira uma cerâmica LC ponteira com um 127 mM levavam para o vice, lado convexo apontou para baixo. </li><li> Insira o de fibra óptica no ponteira. A fibra óptica deve deslizar suavemente e marginalmente se projetam além do final convexa da ponteira (Figura 1a). </li><li> Aplique uma gota de calor curável epóxi fibra óptica para a extremidade plana e calor com a arma de fogo até epóxi fica preta. O epóxi deveencher a virola como ele é aquecido e antes da cura. O epóxi deve curar dentro de ~ 1 min de aplicação de calor constante. </li><li> Limpar qualquer epoxi ao longo dos lados da manga, uma vez que irá dificultar a interface com o acoplador. </li><li> Polir a extremidade convexa da virola com um disco de polimento LC fibra óptica (FOPD) em folhas de alumínio óxido de polimento sobre a almofada de polimento (Figura 1b). Fazer padrões circulares de rotação e polonês em quatro graus, na seguinte ordem: 5, 3, 1 grão mM 0,3. </li><li> Cortar a fibra óptica na extremidade plana com o comprimento adequado de tal forma que tem como alvo a região de interesse. O comprimento pode ser determinado utilizando o atlas estereotáxico. </li><li> Testar o implante, ligando-a a laser, através do cabo de acoplamento descrito abaixo. A extremidade polida do implante é inserido na manga do dispositivo de acoplamento e deve entrar directamente em contacto com a virola de oposição. O implante deve ser capaz de manter a 10 mW de saída de luz, medida na extremidade do thfibra implante e. Um implante mau terá um ponto fraco focal próximo da ponta da fibra óptica. </li><li> Armazenar os implantes acabados (Figura 1c) de espuma, até utilização. </li></ol> 2. Assembleia de Cabo Acoplador de fibra óptica <ol><li> Prepara-se uma mistura de calor epoxi curável de fibra óptica como descrito acima. </li><li> Meça e corte um comprimento adequado de 220 fibra óptica com 200 mM mM núcleo marcando-lo com um escriba carboneto de cunha ponta. O comprimento da fibra deve permitir que o rato se mover livremente em torno da caixa, mas não permitem que o rato para mastigar através da fibra. </li><li> Inserir a fibra óptica para um comprimento de tubagem de furca ligeiramente mais longo do que o comprimento da fibra óptica. O tubo deve ter um diâmetro interior ligeiramente maior do que a da fibra óptica. </li><li> Faixa ~ 25mm em uma das extremidades da fibra óptica e inseri-la na extremidade de metal de um MM FC Multimode virola Assembly com 230 uM furo até que pare. A fibra óptica deve ficar fora através da ferrule final (Figura 2a). </li><li> Assegurar a ligação com o cianoacrilato (super-cola) na extremidade de metal. Cubra a conexão com um conector de inicialização e polir a final com uma ponteira FOPD FC. Fazer padrões circulares de rotação e polimento em quatro graus na seguinte ordem: 5, 3, 1, 0,3 mM grão (Figura 2b). </li><li> Tira e insira a outra extremidade da fibra óptica para uma cerâmica LC virola (230 uM ID furo) com a extremidade distal convexa. Aplicar uma gota de epóxido para a extremidade plana e calor até a cura. </li><li> Polir a extremidade convexa da virola com um FOPD FC em folhas de alumínio óxido de polimento como descrito acima. </li><li> Deslizar a manga LC virola sobre a extremidade convexa do casquilho até ao ponto médio da manga. </li><li> Lugar tubo termorretráctil sobre o tubo de bifurcação e manga e calor para fixar e proteger a ligação (Figura 2c). </li><li> Testar o acoplador, ligando-a à fonte de laser e de medição da luz output através do acoplador com um espectrofotómetro. A perda de luz entre a saída do laser e o acoplador de saída medido não deve exceder 30%. </li></ol> 3. Implantação cirúrgica * Este é um procedimento pontas apenas. Instrumentos são estéreis mas as luvas não precisam ser devido a manipulação constante entre os instrumentos e equipamentos. <ol><li> Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal mistura ketamina / xilazina 100 e 10 mg / kg, respectivamente, utilizando uma agulha de calibre 30. </li><li> Raspar o couro cabeludo com clippers. Limpar o couro cabeludo, com 70% de álcool isopropílico seguida de Betasept limpar (solução de clorexidina a 4%) durante dois minutos, repetindo-se uma vez. </li><li> Posicione o mouse na plataforma sterotaxic e proteger a cabeça, garantindo que o crânio é de nível. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura e dor pós-operatória. Manter a anestesia usando% isoflurano (1-3 volatilizados diluído com o oxigênio, dependendo do estado fisiológico do mouse, o qual deve ser continuamente monitorizado por resposta a uma pitada de cauda). </li><li> Fazer uma incisão pela linha média do couro cabeludo, expondo o crânio das órbitas oculares de lambda. Afastar do tecido conjuntivo, como necessário. </li><li> Use grampos Serafin para segurar a pele e manter um acesso ao crânio (Figura 3a). </li><li> Um padrão quadriculado Etch toda a superfície do crânio com uma palheta dental. Lave os detritos com uma solução salina estéril. Seque bem. </li><li> Aplicar o peróxido de hidrogénio (3%) ao crânio exposta com uma mecha de algodão para ~ 2-3 segundos para criar microporos. Lave várias vezes e seque bem. Alternativamente, as âncoras pode ser aparafusado na cavidade craniana, como descrito em Sparta et al. (2012). </li><li> Novamente, um padrão xadrez etch todo o crânio com uma picareta dental e lavar os detritos com solução salina. Seque bem. </li><li> Usando uma ferramenta rotativa, fazer um pequeno orifício de trepanação craniotomia (&lt;1 mm de diâmetro) com uma broca estéril(Autoclavado) acima da região de interesse, determinada pelo atlas estereotáxico calibrado para bregma e lambda. Tenha cuidado para não quebrar a dura ou danificar qualquer tecido. Lave e seque bem os detritos. </li><li> Insira a ponteira de fibra óptica (implante) para o suporte da sonda e ligar para o braço estereotáxico. </li><li> Posicionar o implante no local directamente acima da região de interesse, utilizando o braço estereotáxico (Figura 3b). Se a inserção da fibra óptica no tecido cerebral, a fibra deve ser avançada lentamente, a uma taxa de ~ 2 mm / min. A ponteira deve descansar no crânio restante. </li><li> Prepara-se uma mistura de cimento dentário. A mistura deve ter uma viscosidade suficientemente baixa para aplicar facilmente através do crânio. Mistura será utilizável para 2-4 min. </li><li> Utilizando um palito estéril, aplicar uma camada fina e uniforme de cimento dentário através do crânio e para a porção inferior do implante. A camada de base de cimento dental deve cobrir área de superfície, tanto no crânio comopossível. Não deixe que o cimento dental entrar em contacto com a pele do rato. Isto levará a dificuldade acrescida de sutura, bem como irritação para o rato. Se o cimento dental não entrar em contacto com a pele, permitir a secar parcialmente de tal forma que toda a camada de cimento pode ser retirada antes do ajuste. </li><li> Deixe-a secar completamente. </li><li> Aplicar até mesmo camadas de cimento dentário para formar um pequeno monte por cima do crânio e em torno do implante, permitindo que cada camada secar completamente (Figura 3c). Deixar ~ 3-5 mm da extremidade convexa da ponteira limpa de cimento para permitir uma ligação suave e desobstruído. </li><li> Suturar o couro cabeludo sobre o monte de cimento dentário e em torno do implante usando suturas estéreis, de uso único de seda entrançada (6-0) com uma agulha de C22. Remover após 7 dias. Opcional: Bond Vet Uso para ligação adicional após a sutura. Certifique-se de usar de Bond Vet mínimo. O excesso pode levar a danos na pele graves devido a arranhões. </li><li> Immediately após a cirurgia, o rato deve ser injectado por via subcutânea com Ketprophen (5 mg / kg) para diminuir a dor no pós-operatório. Isto deve ser repetido 24 horas depois. Aplicar analgésicos tópicos (Bupivicaine) e antibióticos (Neosporin) para a pele suturada e em torno da base do implante. </li><li> Posicione o mouse em uma gaiola sobre uma manta de aquecimento para a recuperação da anestesia. Posicione o mouse em uma gaiola estéril, recuperação pós-operatória. A gaiola de recuperação não deve conter qualquer cama a fim de manter a temperatura e evitar a asfixia. O rato pode ser devolvida à gaiola original ou uma nova gaiola uma vez acordado. </li></ol> Montagem adequada do implante de fibra óptica e os resultados do acoplador na perda de fotões mínima entre a fonte de luz e a extremidade da fibra óptica na região de interesse. Ótica bem polidas fibra devem transmitir a luz em um uniforme, círculo concêntrico (Figura 2d). Com a implantação cuidadosa e sutura, o implante não causa irritação visívelo rato e pode permanecer no lugar por estudos de longo prazo (Figura 3D,&gt; 1 mês, observações não publicadas), sem qualquer degradação significativa da fibra óptica ou da quantidade de luz transmitida. Implantação inadequada ou sutura pode causar irritação e pode resultar no rato arranhões através do seu couro cabeludo, expondo o cimento dentário, ou quebra da ponteira do cimento dental devido à manipulação persistente. Um diagrama esquemático do sistema montado pode ser visto na Figura 4. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Figura 1. Assembleia da fibra óptica implantáveis. (A) A fibra óptica é inserido na manga, ligeiramente saliente para além da extremidade convexa indicada pela seta. (B) A extremidade convexa da virola é polida utilizando um FOPD em graus progressivamente mais finos de folhas de polimento. (C) O opt fibra acabado implantávelIC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Figura 2. Montagem do acoplador de fibra óptica utilizado para amarrar o conjunto rotativo de fibra óptica para o implante. (A) a aderência fibra óptica através do conjunto ponteira. (B) O lado da virola do conjunto é inserido nos graus FOPD e polidas usando progressivamente mais finas de papel de lustro. (C) A manga ponteira é colocada sobre a manga e fixada com um tubo de retracção térmica. (D) O acoplador de fibra óptica deve terminar produzem uma luz concêntrico com perda mínima de fotões. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Figura 3. Implante cirúrgico das fibras ópticas. (A) A superfície total do cranium é exposta e o tecido conjuntivo é apagada. (B) O implante de fibra óptica é mantida em posição com o braço estereotáxico. (C) de cimento dental é aplicado fixação do implante de fibra óptica ao crânio. (D)&gt; 1 mês após a implantação, a pele tenha cicatrizado em torno do implante e não existem sinais de irritação. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Figura 4. Diagrama esquemático do sistema funcional

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenética é uma nova e poderosa técnica que permite o controle sem precedentes sobre subtipos específicos de neurônios. Isto pode ser explorado para modular os circuitos neurais com precisão anatómica e temporal, evitando ao mesmo tempo o tipo de célula indiscriminada e efeitos invasivas de estimulação eléctrica através de um eléctrodo. O implante de fibras ópticas permite uma estimulação consistente e crónica dos circuitos neurais mais sessões múltiplas em desperto, comportando camundongos com danos mínimos para o t...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> LC Manga Ferrule </td><td> Fibra produtos de precisão (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1,25 mm ID </td></tr><tr><td> FC MM pré-montados Conector </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 mM Virola </td></tr><tr><td> Miller FOPD-LC Disco </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> Para LC virolas </td></tr><tr><td> Tubulação de furca </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 ^ M od, 250 uM ID </td></tr><tr><td> MM LC Vara Virola 1,25 milímetros </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> ID 127 mM Diâmetro </td></tr><tr><td> MM LC Vara Virola 1,25 milímetros </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 mMID Diâmetro </td></tr><tr><td> Heat-curável epóxi, resina e endurecedor </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC e SC / PC Conector Disk Polimento </td><td> Thorlabs </td><td> D50-FC </td><td> Para o FC virolas </td></tr><tr><td> Potência óptica digital e medidor de energia </td><td> Thorlabs </td><td> PM100D </td><td> Espectrofotômetro </td></tr><tr><td> Polir </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durômetro </td></tr><tr><td> Óxido de alumínio lapidação (polimento) Folhas: 0,3, 1, 3, 5 grits mM </td><td> Thorlabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> Fibra Revestimento rígido padrão Multimodo </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> OH baixo, 200 Núcleo uM, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Ferramenta de descascamento da fibra </td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Clad / Coem: 200 um 300 um / </td></tr><tr><td> SÍLICA / sílica de fibra óptica </td><td> Polymicro Technologies </td><td> FVP100110125 </td><td> Alta-OH, UV Enhanced, 0,22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 Conjunto Fiberoptic Rotary </td><td> lentes dóricas </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Mono Fiberoptic Patchcord </td><td> lentes dóricas </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Dissipadores de calor, tubos 1/8 polegada </td><td> Aliado Eletrônica </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Pistola de calor </td><td> Aliado Eletrônica </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W; 750-800 ° F </td></tr><tr><td> Algodão derrubou aplicadores </td><td> Puritano Medical Products Company </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> Adesivo de tecido VetBond </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flash acrílica para base de prótese </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN Miniatura Iris Tesoura </td><td> Miltex Integra </td><td> 18-1392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8,9 centímetros), em linha reta, 15 lâminas milímetros </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Grampo </td><td> Miltex Integra </td><td> 7-290 </td><td> 1-1/2 &quot;(3,8 cm), curvada </td></tr><tr><td> MEGA-Torque Elétrica Laboratório Motor </td><td> Vetor </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Pantera Burs-Bola 1 </td><td> Clarkson Laboratório </td><td> 77,1006 </td><td></td></tr><tr><td> Violet Blue Laser System </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> Comprimento de onda: 473 nm </td></tr><tr><td> Laser Alimentação </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont n º 2 Fórceps laminectomia </td><td> FFerramentas ine Ciência </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Belas Science Tools </td><td> 10140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 Hemostat &quot;Straight </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Vise com base ponderada </td><td> Altex Eletrônica </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

implantação de fibra óptica para estimulação crônica optogenética do tecido cerebral

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidando padrões de conectividade neuronal tem sido um desafio para a neurociência clínica e básica. Eletrofisiologia tem sido o padrão ouro para analisar padrões de conectividade sináptica, mas emparelhados registros eletrofisiológicos pode ser tanto complicado e experimentalmente limitante. O desenvolvimento de Optogenetics introduziu um método elegante para estimular os neurónios e circuitos, tanto in vitro e in vivo 1 2,3. Ao explorar tipo de célula-atividade do promotor específico para dirigir a expressão opsina em discretos populações neuronais, pode-se precisamente estimular geneticamente definidas subtipos neuronais em circuitos distintos 4-6. Métodos bem descritos para estimular os neurônios, incluindo a estimulação elétrica e / ou manipulações farmacológicas, são muitas vezes de células do tipo indiscriminada, invasivo e pode danificar os tecidos circundantes. Estas limitações podem alterar a função sináptica normal e / ou o comportamento do circuito. Além disso, devidoa natureza da manipulação, os métodos actuais são, muitas vezes aguda e terminal. Optogenetics proporciona a capacidade de estimular os neurónios de uma maneira relativamente inócua, e em neurónios alvo geneticamente. A maioria dos estudos in vivo envolvendo em Optogenetics actualmente utilizar uma fibra óptica guiada através de uma cânula implantada 6,7, no entanto, limitações deste método incluem o tecido cerebral danificado com inserção repetida de uma fibra óptica, e quebra potencial da fibra no interior da cânula. Dada a florescente campo de optogenética, um método mais confiável de estimulação crônica é necessária para facilitar estudos de longo prazo com o mínimo de danos colaterais tecido. Aqui nós fornecemos nosso protocolo modificado tal como um artigo de vídeo para complementar o método eficaz e elegante descrito em Sparta et al. 8 para o fabrico de um implante de fibra óptica e a sua fixação permanente sobre o crânio de ratos anestesiados, assim como a montagem do fibraacoplador óptico de ligar o implante a uma fonte de luz. O implante, conectado com fibras ópticas a um laser de estado sólido, permite um método eficiente para cronicamente photostimulate circuito neuronal funcional com menos danos do tecido 9 usando pequenos destacáveis, amarras. Fixação permanente dos implantes de fibra óptica fornece consistentes, a longo prazo, em estudos in vivo optogenética de circuitos neuronais em ratos acordados, comportando 10 a uma lesão tecidual mínima.

O desenvolvimento de Optogenetics agora fornece os meios para estimular precisamente neurônios geneticamente definidas e circuitos, tanto<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt;. Aqui, descrevemos a montagem e implantação de uma fibra óptica para fotoestimulação crônica do tecido cerebral.

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

O objetivo do experimento a seguir é ativar e estudar circuitos neuronais a longo prazo em camundongos acordados e comportados. Este método é adaptado do conceito originalmente descrito em Sparta etal. Isso é conseguido primeiro montando um cabo de acoplamento de fibra óptica, que conecta a junta rotativa óptica ao implante de fibra óptica.Em seguida, a fibra óptica é implantada sobre o tecido cerebral de interesse para criar uma passagem para a luz viajar diretamente para o canal de neurônios que expressam redina. Finalmente, a fonte de luz é conectada à junta rotativa óptica para criar um caminho conectado em série da fonte de luz ao tecido cerebral. Em última análise, o disparo induzido por luz de neurônios que expressam redsina de canal pode ser avaliado com base em estudos in vivo, eletrofisiológicos e comportamentais.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como cânulas guia, é que ela minimiza os danos ao tecido cerebral causados pela inserção e remoção repetidas de uma fibra óptica. Embora esse método possa fornecer informações sobre a função do circuito neural, ele também pode ser aplicado a outros sistemas para entender melhor os mecanismos dependentes de sinapse e circuito subjacentes a certos tipos de distúrbios neurológicos. A demonstração visual desse método é crítica.Como as etapas de implantação são difíceis de dominar, cada etapa aparentemente menor contribui muito para a estabilidade geral e confiabilidade do método. Comece cortando 35 milímetros de uma fibra óptica de 125 mícrons de diâmetro com um núcleo de 100 mícrons, posicionando um escriba de carboneto de ponta de cunha perpendicular à fibra óptica e marcando a fibra em um único movimento unidirecional seguido de puxar para fora. Agora, insira um feral cerâmico lc com um 127 mícrons em um diâmetro furo lado convexo apontado para baixo em um torno e, em seguida, insira a peça de fibra óptica no selvagem.A fibra óptica deve deslizar suavemente e se projetar marginalmente além da extremidade convexa do selvagem. Em seguida, aplique uma gota de epóxi de fibra óptica curável por calor recém-preparado na extremidade plana do e, em seguida, aplique uma pistola de calor no epóxi. O epóxi deve preencher o selvagem à medida que é aquecido e é curado quando fica preto.Após a cura, limpe qualquer epóxi das laterais do feral e, em seguida, usando um disco de polimento de fibra óptica lc, faça padrões de rotação circular para polir a extremidade convexa do feral em folhas de polimento de óxido de alumínio em uma almofada de polimento em quatro graus decrescentes. Em seguida, corte a fibra óptica na extremidade plana no comprimento apropriado para atingir a região de interesse. Para testar a fibra óptica polida, insira a extremidade polida do implante na manga do acoplador.Até que o contato direto com o feral oposto seja sentido, um implante ruim terá um ponto focal fraco próximo à ponta da fibra óptica, enquanto um bom implante transmitirá um círculo concêntrico suave de luz sem saída. Potências de até 10 miliwatts armazenam os implantes acabados em espuma até o uso. Comece esta etapa medindo e, em seguida, marcando uma fibra óptica de 220 mícrons de diâmetro com um núcleo de 200 mícrons para permitir que um mouse se mova livremente, mas não permita que o mouse mastigue a fibra.Em seguida, insira a fibra óptica em um pedaço de tubo de furação com um diâmetro interno ligeiramente maior e um comprimento ligeiramente menor que os da fibra óptica. Agora, retire cerca de 25 milímetros de uma extremidade da fibra óptica e insira-a na extremidade de metal de um conjunto feral multimodo FC MM. Com um furo de 230 mícrons em um diâmetro até parar, a fibra óptica deve se destacar através da extremidade selvagem.Em seguida, prenda a conexão com cianoacrilato na extremidade de metal e cubra a conexão com um conector Bote polir a extremidade selvagem com um disco de polimento FC, conforme demonstrado. Depois de descascar a outra extremidade da fibra óptica, insira-a em um feral cerâmico lc com apenas a extremidade convexa distal. Em seguida, aplique uma gota de epóxi na extremidade plana e aqueça até a cura, como acabamos de demonstrar.Depois de polir a extremidade convexa do feral como acabamos de demonstrar, deslize uma manga lc feral sobre a extremidade convexa do feral até que o feral atinja o ponto médio da manga. Em seguida, coloque um tubo termorretrátil sobre o tubo de ação e a luva e aqueça o tubo termorretrátil para proteger e proteger a conexão. Finalmente, conecte o feral à fonte de laser e teste-o medindo a saída de luz através do acoplador com um espectrofotômetro, a perda de luz entre a saída do laser e a saída medida do acoplador não deve exceder 30% antes de iniciar a cirurgia.Desinfetar a área cirúrgica com álcool de perfil isop seguido de solução de clorexidina. Em seguida, coloque o mouse no equipamento estereotáxico e prenda a cabeça garantindo que o crânio esteja nivelado. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar ressecamento e dor pós-operatória.Agora faça uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio das órbitas oculares até a sutura lambda. Use grampos de serafin para segurar a pele e manter o acesso ao crânio. Em seguida, use um palito de dente para gravar um padrão quadriculado em toda a superfície do crânio.Lave os detritos resultantes com solução salina estéril. Depois de secar completamente, use um cotonete para aplicar peróxido de hidrogênio a 3% no crânio exposto por cerca de dois a três segundos para criar microporos. Em seguida, lave o crânio várias vezes com solução salina mais estéril e seque-o completamente.Depois de gravar, lavar e secar o padrão quadriculado no crânio, novamente, insira o implante de fibra óptica selvagem no suporte da sonda e, em seguida, conecte-o ao braço estereotáxico. Determine a localização do orifício da broca com um atlas estereotáxico calibrado para bgma e lambda. Em seguida, use uma broca odontológica rotativa para fazer uma pequena craniotomia com menos de um milímetro de diâmetro acima da região de interesse, tomando cuidado para não quebrar a dura-máter ou danificar qualquer tecido.Usando a posição estereotáxica do braço o implante diretamente acima da região de interesse, o feral deve repousar sobre o tecido craniano circundante. Agora use um palito estéril para aplicar uma camada fina e uniforme de cimento dental recém-preparado no crânio e na parte inferior do implante. Tomando cuidado para não entrar em contato com a pele do animal, a camada de base do cimento dentário deve cobrir o máximo possível da área de superfície do crânio.O aspecto mais difícil desse procedimento é aplicar o cimento dental sem que ele toque na massa da pele. Para garantir o sucesso, aplique pequenas quantidades de cimento de cada vez em camadas finas e espere que cada camada seque completamente antes de adicionar a próxima. Aplique camadas uniformes do cimento dentário para formar um pequeno monte no topo do crânio e ao redor do implante.Deixe os três a cinco milímetros da extremidade convexa do cimento selvagem limpo para permitir uma conexão suave e desobstruída. Em seguida, suture o couro cabeludo sobre o monte de cimento dentário e ao redor do adesivo de ligação veterinária do implante pode ser usado para ligação adicional após a sutura. Finalmente, aplique analgésicos tópicos e antibióticos na pele da sutura e ao redor da base do implante e, em seguida, coloque o camundongo em uma gaiola para recuperação pós-operatória.A montagem adequada do implante e acoplador de fibra óptica resulta em perda mínima de fótons entre a fonte de luz e a extremidade da fibra óptica na região de interesse. Embora a fibra óptica polida deva transmitir luz em um círculo concêntrico uniforme semelhante ao círculo mostrado aqui, como pode ser visto nesta imagem com implantação e sutura cuidadosas, o implante não causa irritação visível no camundongo e pode permanecer no local por estudos de longo prazo sem qualquer degradação significativa da fibra óptica ou da quantidade de luz transmitida Ensaios comportamentais funcionais em um camundongo acordado mostram uma resposta direta da estimulação através de uma fibra óptica implantada sobre o córtex motor, como evidenciado por este vídeo de eletrofisiologia in vivo mostra a ativação de neurônios direcionados através do implante e a resposta comportamental do animal durante a estimulação cerebral. Após este procedimento, outros métodos, como fotoestimulação de regiões cerebrais específicas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são os padrões de conectividade do circuito associados às células-alvo?Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar implantes de fibra óptica e cabos acopladores e como implantá-los sobre o tecido cerebral expressando porters optogenéticos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neurônios adultos-nascido do bulbo olfativo pode ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 expressando injeção lentiviral no fluxo migratório rostral e fotoestimulação crônica com uma miniatura implantado LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

O recente desenvolvimento de ferramentas de neurociência que combinam genética e óptica, denominado "optogenetics", possibilita o controle sobre a atividade do circuito neural com um nível sem precedentes de resolução espacial e temporal. Aqui nós fornecemos um protocolo para a integração na gravação vivo com manipulação optogenetic de subconjuntos geneticamente definidos de neurônios piramidais corticais pré-frontais e subicular.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

A optogenética tornou-se uma ferramenta poderosa para uso em experimentos de neurociência comportamental. Este protocolo oferece um guia passo a passo para o projeto e configuração de sistemas de laser e fornece um protocolo completo para a realização de estímulos optogenéticos in vivo múltiplos e simultâneos compatíveis com a maioria dos paradigmas de teste comportamental de roedores.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

Este protocolo descreve as etapas e a análise de dados necessárias para realizar com sucesso a ressonância magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI é uma nova técnica que combina leitura de fMRI de alto campo com estimulação optogenética, permitindo o mapeamento específico do tipo de célula de circuitos neurais funcionais e sua dinâmica em todo o cérebro vivo.

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Aqui, apresentamos um método de distribuição de vetores de expressão viral no cérebro usando filmes de seda da fibroína. Esse método permite que o alvo entrega de vetores de expressão usando windows cranianas, cônico de fibras ópticas e fibras ópticas revestidas de seda/AAV.

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Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

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Aqui, apresentamos o método de fabricação de um sistema optrode com fibras ópticas para entrega de luz e uma matriz de eletrodos para gravação neural. Experimentos in vivo com camundongos transgênicos expressando channelrhodopsin-2 mostram a viabilidade do sistema para estimulação optogenética simultânea e gravação eletrofisiológica.

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Desenvolvemos uma abordagem simplificada e econômica para a fabricação de eletrodos e realizamos gravações de sinais em várias regiões em camundongos em movimento livre. A utilização da optogenética, juntamente com a eletrofisiologia multirregional e o registro do sinal de cálcio, permitiu a revelação de atividades neuronais em todas as regiões do modelo de acendimento de convulsões.

Um método integrado para criar otérios eletrofisiológicos flexíveis e convenientes para gravação in vivo em várias regiões

Esse protocolo oferece um método integrado que inclui entrega viral, implantação de optrodo, indução fototrombótica, registro simultâneo da atividade de astrócitos e neurais, e estimulação optogenética de astrócitos. Esse método integrado visa fornecer investigação simultânea da relação astrócito-neurônio nos estágios agudo a crônico do AVC isquêmico.

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Aprenda a implantar fibra óptica para estimulação optogenética crônica em camundongos acordados. Esta técnica minimiza danos teciduais cerebrais e permite estudar circuitos neurais em tempo real.

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