Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Este protocolo visa isolar as partes epiteliais da glândula mamária livres de células estromais mamárias associadas. Comece com a dissecção acumulada do material de descarte cirúrgico para enriquecer as estruturas epiteliais usando digestão enzimática. Separe os organoides epiteliais do material estromal fora da membrana basal.

Em seguida, processe os organoides digeridos através de filtros de células de tamanho de poro fixo para obter frações enriquecidas. Semeie os organoides para cultura imediata ou congele os estoques para uso futuro. Em última análise, os organoides epiteliais são usados para gerar culturas de longo prazo de células epiteliais mamárias humanas normais.

Desenvolvi esse método pela primeira vez no final dos anos 1970 para avançar no campo da biologia celular epitelial humana e da carcinogênese. Abundante material de descarte cirúrgico de tecidos normais de memória humana estava disponível. O que era necessário era um método para processar esse material heterogêneo em massa para torná-lo adequado para cultura de células epiteliais puras e meios para apoiar o crescimento a longo prazo.

A demonstração visual desse método é útil, principalmente para observar como fazer a dissecação bruta. Como são os organoides digeridos adequadamente? Filtrando os organoides e chapeando os organoides para cultura.

A vantagem dessa técnica é que ela fornece frações epiteliais limpas para o estroma e as células epiteliais permanecem intactas. Os organoides, que descobrimos, proporcionam o melhor crescimento inicial e maximizam o número de células que podem ser obtidas. Dois cientistas do Laboratório Nacional Lawrence Berkeley, James Garvey e Mark LeBarge, agora demonstrarão este procedimento A partir do material descartado de procedimentos cirúrgicos.

Obtenha tecido mamário humano em recipientes estéreis contendo tampão ou meio completo mais antibióticos a quatro graus Celsius. Corte pedaços do tecido e coloque-os em um prato grande de vidro estéril. Separe as áreas epiteliais da matriz estromal do tecido adiposo, tecido conjuntivo e vasos sanguíneos.

Disseque suavemente os fios brancos das áreas epiteliais embutidas na matriz estromal mais amarela. Segure o material com uma pinça e raspe o material grosseiramente gorduroso com um bisturi. Em seguida, com bisturis opostos, corte o tecido epitelial em pedaços de aproximadamente quatro milímetros para facilitar a digestão.

Transfira o tecido epitelial dissecado para um tubo centrífugo cônico de 50 ou 15 mililitros Em tecido fortemente fibroso. Haverá mais material não epitelial branco sólido. Se é difícil dissecar as células epiteliais de tais matrizes fibrosas.

O tecido pode ser cortado em pedaços de área quadrada de um a três milímetros e digerido separadamente. Encher o tubo com os meios de digestão contendo colagenase bruta e dias de alta altitude, deixando um pequeno espaço de ar para permitir a mistura durante a rotação. Incube a amostra durante a noite a 37 graus Celsius em um rotador de 360 graus a oito RPM após a digestão.

Pulverizar as amostras por centrifugação a 600 G durante cinco minutos. Rejeitar a gordura e o meio sobrenadantes de acordo com as directrizes institucionais para a eliminação de tecidos humanos. Para monitorar a digestão do tecido, dilua um pequeno Eloqua do pellet em meio e examine microscopicamente em organoides completamente digeridos para mostrar o estroma aderido.

Repita a digestão enzimática até que o tecido seja completamente digerido em organoides puros. Se for necessária uma segunda digestão durante a noite, a concentração de enzimas pode precisar ser reduzida para evitar a digestão excessiva. Organoides adequadamente digeridos mostrarão alveolar ductal de aparência lisa ou estruturas alveolares ductais livres de estroma aderido.

Quando a digestão estiver completa, suspenda o pellet final em antibióticos de local médio. Passe a amostra digerida em quats através de um filtro estéril de 100 mícrons sobre um tubo estéril de 50 mililitros. Depois que o meio for drenado para o tubo, lave os organoides com três mililitros de meio.

Repita até que todo o pellet ressuspenso tenha sido transferido. Em seguida, vire cuidadosamente o filtro sobre um tubo estéril e lave os organoides no tubo com mais meio. Este é o pool organoide de 100 mícrons.

Agora passe o material que drenou para o tubo original de 50 mililitros através de um filtro de 40 mícrons para separar as estruturas alveolares do pool filtrado de células individuais e pequenos aglomerados de células mesenquimais e epiteliais e pequenos pedaços de tecido vascular. Centrifugar as poças de 100 mícrons a 40 mícrons e filtrar a 600 G durante cinco minutos. Reconstituir cada amostra com um mililitro de ccpm.

Duas soluções de congelamento por 0,1 mililitro de palato compactado. Mantenha a quatro graus Celsius. Coloque cuidadosamente 0,1 mililitro de cada uma das duas piscinas organoides.

Gota a gota em uma distribuição uniforme em um ou 2 pratos de 35 milímetros. Evite arranhar a superfície do prato depois de alguns minutos permitindo que os organoides se fixem. Adicione meios de crescimento lentamente para evitar o deslocamento dos organoides.

Em seguida, incube as culturas primárias a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2 umidificada. Semeie também 0,1 mililitro do pool de filtrado diretamente no plástico de cultura de tecidos com meio de fibroblastos. Incubar as culturas primárias a 37 graus Celsius em incubadora de CO2 umidificado.

Após 24 a 48 horas, verifique a migração celular dos organoides e, após dois a três dias, monitore a cultura de crescimento mitótico. As células se aproximam da confluência reabastecendo o meio a cada dois ou três dias. Pequenos pedaços da vasculatura podem se fixar e dar origem ao crescimento de células de fibroblastos.

Em casos de crescimento significativo de fibroblastos. Realize trippin diferencial para remover os fibroblastos das grandes manchas epiteliais. Lave as células uma vez em tampão STE.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de STE fresco para cobrir o prato com observação microscópica contínua e batidas suaves, mas agudas, do prato contra uma superfície dura. Procure por descolamento de fibroblastos enquanto as células epiteliais ainda estão aderidas à passagem. As culturas primárias quando as manchas de crescimento epitelial estão se aproximando da confluência.

Para reter a cultura primária e gerar várias culturas secundárias, use tripsina parcial. Lave as células uma vez no tampão STE e, em seguida, adicione STE fresco para cobrir apenas o prato. Monitore se aproximadamente 50% das células se desprenderam.

Em seguida, adicione dois mililitros de soro contendo meio de crescimento e colha as células. Em seguida, transfira as células para um tubo estéril de 15 mililitros após duas lavagens. Agrupe as células colhidas e a cultura A parcialização pode ser repetida cerca de quatro a oito vezes com bom crescimento celular das placas primárias e com crescimento equivalente a longo prazo da subcultura ou secundárias congeladas.

Recomendamos congelar as células da primeira tripsina parcial para proteção e usar células do segundo PT para subcultura. Quando o tecido é adequadamente digerido e filtrado, organoides exibindo estruturas ductais e alveolares podem ser vistos com bordas lisas livres de estroma aderido. Se subdigerido, haverá material ligado e mais contaminação por fibroblastos se digerido demais, as bordas serão ásperas e a fixação será menos eficiente após a fixação do organoide.

O crescimento epitelial começa dentro de 48 a 72 horas em 48 horas. Ainda não há divisão celular ativa com mitose visível em 72 horas. A mitose deve se tornar mais visível.

Pequenos pedaços de vasculatura podem ser uma fonte de crescimento de células mesenquimais após quatro dias. As protuberâncias epiteliais exibem populações morfologicamente heterogêneas aqui, corando-se com anticorpos para queratina 14 e queratina 19 marcam as linhagens mioepiteliais luminais K 19 positivas verdes e K 14 positivas vermelhas, e também as células progenitoras K 14 positivas K 19 amarelas. O HMEC pode ser cultivado em diferentes formulações de meios.

Meios de baixo estresse, como M 87 a suplementados com toxina de cólera e ocitocina, apoiarão o crescimento superior a longo prazo do HMEC normal pré-estase, bem como o crescimento de várias linhagens HMEC. Os resultados da análise de fatos ilustram a diversidade de linhagem nos organoides não cultivados e, na quarta passagem, HMEC cultivado em M 87, meio A. Aqui, as populações luminais e mioepiteliais são identificadas pela expressão de marcadores luminais, EPCA e CD 2 27 e marcadores mioepiteliais CD 49 F e CD 10 replaqueados.

Quarta passagem, HMEC. Os fatos enriquecidos para os marcadores luminais e mioepiteliais anteriores têm sua linhagem confirmada por meio de análises de imunofluorescência para queratina K 14 e K 19 HMEC. Cultivados em plástico para a passagem quatro são capazes de formar estruturas organizadas com in vivo como relações de linhagem de células luminais e mioepiteliais quando colocadas em CD 2 27 e CD 10 apropriados são usados para enriquecer essas duas linhagens.

Os HMCs mantêm sua capacidade de formar uma organização celular 3D adequada em micro poços 3D padronizados com células luminais no interior das células mioepiteliais. As células progenitoras enriquecidas com fatos também podem formar estruturas 3D robustas quando revestidas em matrigel imitando estruturas ductulares e alveolares. As estruturas 3D em Matrigel também exibem auto-organização 3D adequada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar as partes epiteliais da glândula mamária livres do estroma mamário associado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita ao longo de dois a três dias. A técnica de processamento de tecidos é geralmente direta.

É importante lembrar de interromper a digestão no ponto correto.