Name: Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda um ensaio de migração de células de Schwann murinas ao longo de axônios em crescimento usando gânglios cervicais superiores de embriões de camundongo. Este método oferece um modelo mais preciso para estudar a regeneração de nervos periféricos.

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Queremos agradecer Arumae Urmas para compartilhar um protocolo de colágeno e Jutta Fey e Ursula Hinz para assistência técnica excelente. Além disso queremos agradecer a Christian F. Ackermann, Ulrike Engel ea Nikon Imaging Center da Universidade de Heidelberg e também Joachim Kirsch por gentilmente ajuda para o shoting vídeo. O trabalho foi parcialmente financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

1. Preparação de géis de colagénio <ol><li> Prepara-se uma média de valores, contendo 455 ul de MEM de 10x, 112 ul de 7,5% de NaHCO 3, 50 ul de glutamina e NaOH. A concentração e a quantidade de NaOH depende da preparação de colagénio da cauda de rato (ver 1.2), o volume final do meio de estoque sendo 1000 ul. </li><li> Prepare-colagénio da cauda de rato de acordo com Ebendal (1). Armazene a solução de colagénio, a 4 ° C. A degradação da solução de colagénio não pôde ser observado. Após a preparação de um novo lote, estimar a concentração de NaOH necessária para o meio de stock (ver 1.1). Utilizar o indicador de pH do meio para a titulação da quantidade e da concentração de NaOH. 800 ul colágeno rato-cauda ácida tem que virar um tom de vermelho quando misturado com 210 ul do meio de ações. Se a concentração de NaOH é muito baixa a solução de colagénio ficará amarela, devido a que o indicador de pH do meio. Adicione o colágeno para o meio e misture sem producing bolhas. Execute essas etapas em gelo. A polimerização ocorre dentro de 2 horas após a solução de colagénio e o meio de estoque foram misturados e a nova solução é incubada a 37 ° C. Testar isso antes de iniciar um experimento. 1.3) Misture 800 ml de solução de colágeno com 210 ul de meio de ações (ver 1.2). Coloque 100 ul desta solução nos poços de uma lâmina de câmara 8 também. Incubar as lâminas a 37 ° C, 5% de CO 2 e de condições de humidade numa incubadora de cultura de células. Preparar os géis de colagénio em um banco de cultura de células e condições estéreis. O colagénio é gelatinizado dentro de 2 horas. </li></ol> 2. Dissecação de SCGs embrionárias <ol><li> Colheita de embriões em tempo ratas grávidas (E16-18) do útero e mantê-los em PBS até mais necessário. </li><li> Dissecar um embrião a partir do âmnio. Decapitar o caudal embrião do nível clavicular. Fixe a cabeça em um prato fundo de silício com &quot;inseto-agulhas&quot;. O lado ventral da cabeça tem de enfrentar a você umaD Você tem que ver a região submandibular. A fixação permite a fácil preparação. </li><li> Remova a pele da região submandibular esquerda e para a direita e com ele o tecido conjuntivo sub-cutânea. </li><li> Retire as glândulas salivares submandibulares de sua localização para limpar a vista para o hióide, os músculos infrahyoidal eo músculo esternocleidomastóideo. </li><li> Remova os músculos cuidadosamente para limpar a vista para a laringe ea traquéia. Remover a traqueia e laringe. As artérias carótidas são, então, visível em ambos os lados sobre os músculos pré-vertebrais. O GCS está localizado na bifurcação das artérias carótidas e tem uma forma oval. Remova cuidadosamente os gânglios e colocá-los em PBS. Remover os gânglios suavemente a partir das ferramentas de dissecação, se forem aderindo a elas. É vantajoso usar uma pinça, bem como um porta-agulhas montado com uma &quot;agulha de insectos&quot; para a remoção do SCG. </li><li> Uma vez em PBS, armazenar os gânglios à temperatura ambiente em PBS até dissecados enougânglios gh. Em seguida, limpe os gânglios dos vasos sanguíneos e tecido conjuntivo. Realizar a dissecção SCG e limpeza sob um microscópio de dissecação colocado debaixo de um banco de fluxo laminar. </li><li> Finalmente, coloque os gânglios explantados para os géis de colagénio gelatinizadas com a ajuda de agulhas de seringa montado em uma seringa para uma manipulação mais fácil. </li><li> Incubar os explantes SCG sobre o colagénio gelatinizado numa incubadora de cultura de células a 37 ° C, com as condições de 5% de CO2 e humidade. </li></ol> 3. Tratamento de Explantes SCG <ol><li> Após 1-2 horas de incubação, cobrir o colagénio explante SCG contendo meio de cultura com 100 uL contendo Neurobasal célula B27 suplemento, glutamina e antibióticos. Agora, os poços das lâminas de câmara conter um volume de 200 ul (100 e 100 ul de gel ul de meio). Adicione outro ul 200 do meio, no entanto agora contendo NGF (60 ng / ml) para facilitar o crescimento axonal. Por conseguinte, a concentração final de NGF é de 30 ng / ml. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para investigar o aparecimento de SC migração, adicione fatores adicionais diretamente no dia in vitro 0 (DIV0). Dissolver os fatores do meio de NGF contendo em o dobro da concentração necessária (2). </li><li> A fim de analisar o impacto no SCS, que já começaram a migrar ao longo de axônios, adicione fatores adicionais a DIV3 até DIV4 (paragem potencial do experimento). Para este fim, retirar cuidadosamente 180 ul da solução, em DIV3, e adiciona-se 200 ul de meio novo NGF contendo e os factores adicionais de interesse na concentração dupla (2). </li></ol></li></ol> 4. Lapso de tempo de imagem Use um microscópio invertido para análises. Diferentes objectivos podem ser usados, que define o campo de visão e ampliação. Um aspecto importante, contudo, é a distância de trabalho do objectivo utilizado, como imagens dos explantes SCG é realizada por meio da lâmina de vidro e o colagéniogel. A taxa de quadros de gravação de 1/10-30 minutos, mostrou bons resultados (2). No entanto, este aspecto tem de ser ajustado para a questão científica. Uma câmara CCD normal pode ser utilizado para a obtenção da imagem. Para imagiologia de lapso de tempo de uma câmara de incubação de células de cultura tem que ser ligado à fase do microscópio. Incubar o tecido durante a imagiologia, a 37 ° C, com as condições de 5% de CO2 e humidade. Inicie a incubação de uma hora antes do início do sistema de geração de imagens. Isto permite que as partes do microscópio (por exemplo, objectivo), incluindo a câmara de corrediça para ajustar a temperatura e evita desvios de temperatura induzidas. Definir as áreas específicas de análises (dentro de explante e entre diferentes explantes) com a ajuda do software de microscópio e uma fase motorizada controlada por software (configuração multiposições) para análises simultâneas de diferentes condições aplicadas aos explantes SCG. Por lapso de tempo tecidual de tipo selvagem, bem como nos tecidos dos animais transgénicos pode ser usadomarcando o SCs (S100B: GFP) (3). Para fluoróforos de imagem de uma fonte de luz fluorescente deve ser implementado na configuração micropscope. Use filtros padrão. 5. Quantificação das distâncias de migração SC <ol><li> No ponto final (DIV4 por exemplo), corrigir os géis de colágeno com PFA 4% no slide câmara para 3-4 horas. Consecutivamente, os géis de colagénio lavar 5 vezes durante 10 min com PBS. Aplicar protocolos padrão para a imunocitoquímica (2). Se você é novo para a preparação de SCGs, verificar a identidade do gânglio como um gânglio simpático por imuno-histoquímica contra tirosina hidroxilase (TH) um marcador comum para células catecolaminérgicos. Durante imunohistoquímica (após o anticorpo primário), transferir os explantes géis de colagénio contendo a placas de 24 poços, os quais têm um volume maior, o que é benéfico para a lavagem do gel. </li><li> Depois de imuno-histoquímica, coloque cuidadosamente o gel de colágeno em lâminas de vidro. Cuidadosamenteremover a solução restante e deixe secar o colágeno / encolher a duas dimensões. Isso permite que as medições fáceis de distâncias (2). Depois disso, montar as amostras. </li><li> Finalmente, medir distâncias de migração com a ajuda de software Fiji (NIH). Não plugins especiais são necessários para esse fim. Para permitir que medidas corretas em um, verificar os metadados de imagem correta e as configurações no Fiji, imagem e escala. Use Fiji também para a quantificação das células. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
<li>Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuron-glia+signal+beta-neuregulin+promotes+Schwann+cell+motility+via+the+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway.</a> Glia. 34 (1), 39-51 (2001).</li>
<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
<li>Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+its+low-affinity+receptor+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).</li>
<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O desenvolvimento do sistema nervoso periférico é um processo excitante. Quando o desenvolvimento estiver concluído, os axônios são ensheathed por SCs ao longo de todo o comprimento, o qual pode, em humanos, ser muitas vezes mais de 100 cm. Para este fim, o número correcto de os SCs requeridas deve ser estabelecido durante o desenvolvimento e as SCs também tem que se mover ao longo de axónios estendem para a periferia para assegurar a cobertura completa axonal. Isso vale para mielinizadas, mas também para os axônios unm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> MEM 10x </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio (7,5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Roche </td><td> 1058231 </td><td> R &amp; D # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Meio Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> antibióticos </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> d-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> agulhas de insetos </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> agulha da seringa </td><td> Braun </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 slides câmara bem </td><td> Laboratório tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisando o desenvolvimento de células de schwann murino junto axônios em crescimento

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

O desenvolvimento de nervos periféricos é um processo intrigante. Neurônios enviam axônios para inervar alvos específicos, que nos seres humanos muitas vezes são mais de 100 cm de distância da soma do neurônio. A sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento depende de factores de crescimento derivados alvo, mas também com o apoio de células de Schwann (SC). Para este fim os axônios ensheath SC a partir da região da soma neuronal (ou a transição da central para o sistema nervoso periférico) para a sinapse ou junção neuromuscular. As células de Schwann são derivados da crista neural e migram ao longo de axónios como precursores emergentes até o axónio inteiro é coberto com SCs. Isto demonstra a importância do SC de migração para o desenvolvimento do sistema nervoso periférico e sublinha a necessidade de investigar este processo. A fim de analisar SC desenvolvimento, uma configuração é necessário que ao lado das SCs também inclui seu substrato fisiológico para a migração, o axônio. Devido ao desenvolvimento intra-uterino <em&gt; imagem in vivo com lapso de tempo, no entanto, não é viável em vertebrados placentários como camundongo (Mus musculus). Para contornar isso, adaptamos o gânglio cervical superior técnica de explante (SCG). Após tratamento com factor de crescimento do nervo (NGF) explantes SCG estendem axónios, seguido de precursores SC migram ao longo dos axónios do gânglio para a periferia. A beleza deste sistema é que o SC são derivados a partir de um pool de SC endógena e que migram ao longo das suas próprias axônios fisiológicos que estão a crescer, ao mesmo tempo. Este sistema é especialmente interessante, porque o desenvolvimento ao longo SC axónios podem ser analisados ​​por lapso de tempo de imagem, abrindo novas possibilidades para obter insights sobre migração SC.

Crescimento axonal é facilitada a partir de explantes de SCG, após tratamento com NGF (4) (esquema filme Figura 1 esquema de S1). Este processo é facilmente visível por um microscópio invertido e pode ser seguido por lapso de tempo de imagem (vídeo S2). Se um cientista é novo para dissecar SCG de embriões de camundongos recomendamos uma validação da técnica por um hidroxilase anti-tirosina simples (TH) imuno-histoquímica. TH é um marcador para neurónios catecolaminérgicos comum (neste c...

Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.

Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

O objetivo do experimento a seguir é analisar o desenvolvimento de células de schwan ao longo de axônios em crescimento, seu habitat natural. Isso é conseguido pela primeira explanação dos gânglios cervicais superiores, ou S cgs de embriões de camundongos em matrizes de colágeno como um segundo passo. Os S cgs são tratados com fator de crescimento nervoso ou NGF, que facilita o crescimento axonal dos neurônios SCG de forma coronal.Além do crescimento axonal do explanamento X, as células endógenas de schwan podem ser observadas migrando ao longo dos axônios estendidos em direção à periferia. O desenvolvimento de células de Schwan pode ser analisado por imagens de lapso de tempo e também por análise de endpoint de tecido fixo, o que permite medições de distância. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de migração de arranhões, é que o habitat natural das células do cisne está incluído neste ensaio.A demonstração visual desse método é crítica. Como a montagem correta das métricas de colágeno e a dissecção correta dos sgs são a chave para o sucesso. Essas etapas não são especialmente difíceis de aprender.Eles só precisam praticar primeiro. Enquanto trabalhava em uma cultura de tecidos, Hood entendeu nossas condições com todas as soluções no gelo. Prepare o meio de cultura de estoque e o colágeno de cauda de rato de acordo com as instruções do protocolo escrito.Misture 800 microlitros de colágeno de cauda de rato com 210 microlitros do meio padrão. Sem introduzir bolhas, a solução deve permanecer na cor vermelha. Se a solução ficar amarela, a solução de colágeno Ratal é muito ácida e precisa ser refeita com uma concentração maior de hidróxido de sódio pipeta 100 micro liberação da solução em cada poço de uma lâmina de vários poços e certifique-se de que o fundo de cada poço esteja completamente coberto.Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas. Após a colheita, os embriões E 16 a E 18 são colocados em uma placa de Petri contendo PBS, em seguida, dissecados do âmnio e decapitados em um cordão nivelado do C clavicular. As regiões da cabeça e do pescoço são então transferidas para uma placa de fundo de silicone e, ao olhar através de um microscópio de dissecação, agulhas de insetos são usadas para prender o tecido nas regiões submandibular e clavicular.Agora use uma pinça para remover a pele e o tecido subcutâneo da região submandibular. Em seguida, remova as glândulas salivares submandibulares para revelar os músculos supra-hióideo, infra-hial e esternocleidomastóideo. Em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente os músculos infra-hial e esternocleidomastóideo para revelar a laringe e a traqueia.Segure a traqueia com a pinça e levante a traqueia e a laringe. Uma vez que a laringe e a traqueia foram removidas, as artérias carótidas são visíveis, são ambos os lados dos músculos pré-vertebrais. Os gânglios cervicais superiores estão localizados na bifurcação das artérias carótidas e podem ser identificados como uma forma oval.Use uma pinça e um porta-agulha montado com uma agulha de inseto para remover os gânglios cervicais superiores e coloque em um prato fresco contendo PBS, em seguida, disseque quaisquer vasos sanguíneos ou tecido conectado dos gânglios. Com a ajuda de agulhas de seringa, remova os géis de colágeno gelatinizados da incubadora e use agulhas de seringa montadas em seringas para transferir os gânglios para os géis. Coloque os explantes na incubadora de cultura de tecidos ajustada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e condições úmidas por uma a duas horas.Após uma a duas horas de incubação, os explantes do gânglio cervical superior são recuperados da incubadora de cultura de tecidos e 100 microlitros de meio neurobasal contendo suplemento B 27 glutamina e antibióticos são adicionados a cada x explan. Posteriormente, 200 microlitros de meio neurobasal contendo 60 nanogramas por mililitro. O NGF também é adicionado aos poços para facilitar o crescimento axonal.Podem também ser adicionadas substâncias de ensaio neste momento, que é definido como dia in vitro zero para estudar o efeito nas células de cisne que já começaram a migrar. As substâncias axonais podem ser administradas em três dias in vitro, removendo 180 microlitros do meio existente e substituindo por 200 microlitros de meio contendo a substância de interesse e NGF no dobro da concentração final, a imagem de lapso de tempo é realizada usando uma configuração de microscópio invertido que permitirá a incubação de cultura de células paralela e imagens de lapso de tempo para comparar diferentes substâncias de teste. Em um experimento, uma configuração de várias posições é recomendada no ponto final do experimento.Após fixar os explantes dentro das lâminas de cultura com 4% de PFA por três a quatro horas e lavar com PBS, realizar a imuno-histoquímica para validar o explante X, pois o SCG bloqueia o tecido com PBS contendo 10% de soro normal de burro e 2% de tritton X 100 por duas horas. Em seguida, siga com a incubação de anticorpos primários em solução de bloqueio durante a noite. No dia seguinte após a incubação de anticorpos primários, transfira o X explan contendo géis para uma placa de 24 poços após a lavagem com PBS, incube com anticorpos secundários marcados com fluorescência por duas horas enquanto protegido da luz, depois lave com PBS e incube com solução de dappy por 10 minutos.Depois de lavar várias vezes, coloque os géis de colágeno contendo o X explan em um microscópio, deslize, seque as lâminas e, em seguida, monte com vitela. Use um microscópio fluorescente padrão para obter imagens para posterior análise quantitativa. É útil se o software do microscópio for capaz de registrar metadados.A análise quantitativa das imagens obtidas pode ser realizada com o software Fiji ou ImageJ, que pode ser usado gratuitamente para aplicações científicas. O crescimento axonal de um SCGX EXPLAN esquemático durante quatro dias in vitro é demonstrado neste filme. A imuno-histoquímica pode ser realizada no quarto dia in vitro para identificar claramente o gânglio explantado.Como um gânglio simpático, as células de schwan podem ser observadas migrando ao longo do axônio, movendo-se do gânglio cervical superior para a periferia. Este vídeo mostra o mesmo padrão de migração que acabamos de ver em uma ampliação maior. As distâncias de migração podem ser facilmente medidas em amostras contra-coloração para núcleos com DPI, medindo a distância dos núcleos das células schwan principais até a borda do SCG explantado em vários locais, conforme ilustrado no esquema e na imagem de uma amostra tratada com NGF rotulada com DPI em quatro dias in vitro, este filme mostra a migração de células schwan na borda de um explane SCG.A combinação de campo claro e fluorescência permite a visualização de células de cisne positivas para S 100 GFP e dos axônios. Finalmente, este filme mostra a migração de células de schwan na borda de um gânglio cervical superior ex explan. Aqui, apenas o canal de fluorescência é mostrado, permitindo uma interpretação mais fácil das células schwan positivas para S 100 GFP.Seguindo este procedimento, análises quantitativas adicionais podem ser realizadas, como a quantificação de uma proliferação celular ou a quantificação de uma apoptose celular. Obviamente, a imuno-histoquímica adequada deve ser realizada para análise de endpoint ou os animais transgênicos específicos devem ser usados para mostrar os efeitos no contexto de vida.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este artigo pretende descrever de forma gradual o comumente...

Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

Estudo genético da regeneração do axônio com cultivadas Adulto neurônios do gânglio da raiz dorsal

Este vídeo demonstra o modelo de cocultura de um explante de gânglio da raiz dorsal e células de Schwann. Em condições de cocultura, o ácido ascórbico promove a diferenciação das células de Schwann em formas mielinizantes. As células mielinizantes de Schwann envolvem os axônios várias vezes para criar uma bainha de mielina, que é essencial para a função nervosa.

Co-cultura de um explante de gânglio da raiz dorsal com células de Schwann para mielinização de neurônios

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para genotipar, corar e preparar fetos de camundongos para a imagem de projeções de axônios nociceptores periféricos em todo o animal, como um método eficaz para avaliar fenótipos de crescimento sensorial de axônios no desenvolvimento de camundongos geneticamente modificados.

Todo-mount imagem de embrião de rato Projeções Sensorial Axon

Técnicas de microscopia de luz acopladas a ensaios bioquímicos elucidam o envolvimento da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina. Essa combinação de técnicas permite a identificação de mecanismos moleculares que controlam a ramificação do axônio e a mudança da forma celular.

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização de projeção dos neurônios motores e arborização do axônio em embriões de rato transgénicos Hb9::GFP . Depois de imunocoloração para os neurônios motores, usamos a microscopia de fluorescência folha de luz aos embriões de imagem para posterior análise quantitativa. Este protocolo é aplicável a outros processos de navegação do neurônio no sistema nervoso central.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Um ensaio ex vivo da fatia permite que o conseqüência do nervo oculomotor seja imaged no tempo real. As fatias são geradas incorporando E 10.5 ISLMN: embriões de GFP no agarose, cortando em um vibratome, e crescendo em uma incubadora do estágio-parte superior. O papel das vias de orientação do AXON é avaliado pela adição de inibidores aos meios de cultura.

Cultura ex vivo oculomotor Slice de camundongos que expressam GFP embrionário para a imagem de lapso temporal do crescimento do nervo oculomotor

No sistema de cocultura dos gânglios da raiz dorsal e células de Schwann, a mielinização do sistema nervoso periférico pode ser estudada. Este modelo oferece oportunidades experimentais para observar e quantificar a mielinização periférica e estudar os efeitos de compostos de interesse sobre a bainha de mielina.

Mielinização in vitro de axônios periféricos em cocultura de explantes de gânglios dorsais de rato e células de Schwann

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, os neurônios e as células gliais se originam na zona ventricular que reveste o ventrículo e migram em direção à superfície do cérebro. Muitos genes estão envolvidos neste processo. Este protocolo apresenta a técnica para a imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais.

Imagem de lapso de tempo de neurônios migratórios e progenitores gliais em fatias de cérebro de camundongo embrionário

Aprenda um ensaio de migração de células de Schwann murinas ao longo de axônios em crescimento usando gânglios cervicais superiores de embriões de camundongo. Este método oferece um modelo mais preciso para estudar a regeneração de nervos periféricos.

Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

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