Todo o Monte RNA Fluorescente In situ A hibridação de Drosophila Embriões

Este procedimento descreve um método de peixe otimizado para avaliar as características de expressão e localização do RNA em embriões inteiros de Drosophila. Isso é feito sintetizando primeiro uma sonda de RNA marcada, complementar a um Sr. NA ou RNA não revestinte de interesse por transcrição in vitro de um molde de DNA adequadamente selecionado. Em gaiolas de população de moscas paralelas são usadas para colher, fixar e permear embriões do estágio de desenvolvimento desejado.

Após várias etapas pós-fixação, os embriões são hibridizados com a sonda de RNA antisense marcada. Finalmente, após extensa lavagem das amostras, a sonda hibridizada é detectada por imunomarcação com um anticorpo específico e reagentes de detecção conjugados com fluorocromo, fornecendo assim uma leitura sensível da distribuição do RNA alvo. Em última análise, os resultados produzem sinais fluorescentes altamente resolvidos que são analisados por microscopia de fluorescência padrão para documentar as características de expressão espacial e temporal do RNA alvo durante a embriogênese da drosófila.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como Northern blot ou RTPCR, é que se pode avaliar a expressão de RNA dentro de espécimes de tecido intactos. Embora este método se destine à análise das propriedades de expressão de RNA em embriões iniciais de drosófila, ele também pode ser empregado para a análise de embriões em estágios posteriores de desenvolvimento de tecido dissecado de larvas ou moscas adultas. Um aspecto importante do nosso procedimento é o aumento do número de amostras que podemos alcançar realizando peixes no local de PCR, o que aumenta substancialmente o rendimento da abordagem.

Os membros do laboratório que demonstram esse procedimento incluem resistência à pesquisa de graduação, estudantes de pós-graduação e bolsistas de pós-doutorado. Comece com gaiolas populacionais bem alimentadas. Substitua o prato por um prato de fermento de suco de maçã e deixe as moscas por uma hora a 25 graus Celsius.

Em seguida, substitua o prato de fermento de suco de maçã para colher embriões em estágio inicial. Incube a gaiola a 25 graus Celsius e espere até que o estágio de desenvolvimento desejado dos embriões seja atingido enquanto espera em uma capa química, misture os produtos químicos para fazer 37% de formaldeído em um frasco de inalação de vidro. Ferva a solução até que o pó de PFA esteja completamente dissolvido.

Em seguida, resfrie-o à temperatura ambiente e filtre-o em um novo frasco de cintilação. Em seguida, prepare uma solução de fixação bifásica. Combine PBS com formaldeído a 37% em um frasco de cintilação e, em seguida, adicione heptano quando estiver pronto.

Colha os embriões do prato de suco de maçã em temperatura ambiente, água da torneira e varredura delicada com um pincel fino. Transfira os embriões ressuspensos para uma cesta e enxágue-os com água morna da torneira. Agora cubra os embriões por 90 segundos, banhando a cesta em uma solução fresca de alvejante a 3%.

Em seguida, remova o alvejante com água morna da torneira até que o cheiro de alvejante desapareça. Para coletar os embriões, desmonte a cesta de coleta e transfira suavemente os embriões para a solução de fixação bifásica. Usando o pincel, os embriões se acumularão na interface entre as camadas de PBS e heptano.

Agora sele os frascos de cintilação, prenda-os a um misturador de vórtice e agite-os por 20 minutos na configuração mais baixa. Após a agitação, descartar a maior parte das fases PBS inferior e heane superior usando uma pipeta de pastagem. Em seguida, aspire a mistura restante para a pipeta e retire cuidadosamente a fase inferior sem perder os embriões.

Deposite os embriões em um tubo de 1,5 mililitro contendo uma solução bifásica de 500 microlitros de heptano e 500 microlitros de metanol. Agite o tubo vigorosamente por 30 a 45 segundos para quebrar as membranas da patela. Uma vez quebrados, os embriões afundarão no metanol.

Descarte a fase superior e os embriões não quebrados e adicione um mililitro de metanol. Agora agite brevemente o tubo por cinco segundos e lave os embriões três vezes com metanol. Após as lavagens, os embriões podem ser armazenados por vários meses a menos 20 graus Celsius.

Comece adicionando 500 microlitros de PK a cada um dos embriões e incube as amostras por 10 minutos em temperatura ambiente sem agitar. Tome muito cuidado para danificar as amostras digerindo-as demais com proteína a k ou por meio de manipulação desleixada. Durante a incubação PK, misture os embriões a cada dois minutos, jateando-os com uma pipeta.

Após 10 minutos, coloque os embriões no gelo por uma hora. Após uma hora, remova a solução PK em temperatura ambiente. Lave os embriões duas vezes com glicina em PBT por dois minutos.

Agora, fixe as amostras por 20 minutos em um mililitro de formaldeído a 3,7% em PBT com balanço. Lave o formaldeído com cinco enxágues em PBT. Em seguida, enxágue os embriões com um mililitro de PBT e HI de volumes iguais e substitua a mistura por 0,5 a um mililitro de solução pura.

Nesse ponto, os embriões podem ser armazenados por vários dias a semanas a menos 20 graus Celsius. Em uma alíquota de placa de 96 poços, 10 a 15 microlitros de embriões sedimentados por poço. Use uma ponta de furo largo para evitar danificar os embriões.

Agora prepare a solução de pré-hibridização fervendo 100 microlitros de solução de hype por amostra. Bem, por cinco minutos, resfrie a solução Pre-Hype no gelo por cinco minutos e, em seguida, adicione 100 microlitros a cada poço de placa, que contém as amostras de embriões. Recupere a sonda de RNA preparada quantificada por um espectrofotômetro NanoDrop.

Além disso, para verificar a qualidade da sonda, execute de um a dois microlitros dela em um gel agrícola. Agora, para cada amostra, dilua cerca de 100 nanogramas de sonda em 100 microlitros de solução HI. É vital trabalhar em condições livres de RNAs.

Ao manusear a sonda. Aqueça a solução a 80 graus Celsius por três minutos. Em seguida, deixe esfriar no gelo por pelo menos cinco minutos.

Pode ser mantido resfriado por várias horas. Retirar a placa e retirar a solução de Pre-Hype dos embriões por aspiração. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução hype com a sonda de RNA a cada um.

Bem, hibridize a sonda a 56 graus Celsius por 12 a 16 horas no dia seguinte. Uma série de cinco soluções é pré-aquecida a 56 graus Celsius. A primeira é pura solução de hype e a última é pura PBT.

Os outros três são a diluição de HI em PBT. Depois de aquecido, enxágue rapidamente as amostras uma vez em solução pura de hype. Em seguida, execute três lavagens de 15 minutos, começando com a solução de hype menos diluída, seguida por cada uma das diluições sucessivas.

Por fim, lave as amostras quatro vezes por cinco minutos em PBT puro. Em seguida, leve as amostras à temperatura ambiente. Agora prossiga com as aplicações de anticorpos para detectar a sonda para melhorar a mistura de amostras.

Durante essas etapas, a placa pode ser colocada em uma pequena caixa que pode ser acoplada a um misturador mutante usando o protocolo descrito, o gene clássico da regra do par foi analisado em estágios distintos da embriogênese. A análise dos peixes revelou como a ampla expressão inicial na porção média do embrião no estágio embrionário quatro é refinada em um padrão de listras segmentadas. Em estágios posteriores, o peixe foi realizado usando várias sondas de RNA diggen e antisense marcadas hibridizadas com embriões de drosófila de zero a quatro horas de idade.

As sondas hibridizadas foram detectadas por incubações sequenciais com um antígeno biotinilado e um estreptococo de anticorpo ávido em HRP e Ceramida. As amostras foram montadas e analisadas por microscopia de fluorescência. Um amplo mosaico de resultados de peixes foi observado nesses embriões de estágio quatro a sete Ao tentar este procedimento, é importante tomar precauções em várias etapas, como proteger suas sondas de RNA e degradação trabalhando em condições livres de RNAs e usando suprimentos livres de RNAs.

Uma vez que esse básico seja dominado, etapas adicionais podem ser adicionadas ao método para fazer a experiência de marcação múltipla para visualizar diferentes RNAs ou marcadores de proteínas específicos na mesma amostra. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa ideia de como realizar a hibridização fluorescente em C dois para documentar a expressão ou dinâmica de localização subcelular de seu RNA favorito durante a embriogênese de Drosophila Happy Fishing.