Name: Um In vivo Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda um ensaio in vivo para avaliar a permeabilidade vascular em camundongos usando corante azul que se liga à albumina. Este método permite visualizar a integridade endotelial e investigar doenças relacionadas aos vasos sanguíneos.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, R01CA142928.

1. Injecção intravenosa de azul de Evans na veia da cauda do rato Lateral <ol><li> Prepara-se uma solução de 0,5% de azul de Evans estéril em PBS. Se necessário, esterilizar por filtração da solução para remover qualquer matéria particulada que não se dissolveu. </li><li> Aspirar 200 ul solução azul de Evans para uma seringa. Evitar as bolhas de ar que possam ter escapado para a seringa. </li><li> Coloque ratos que são de 8-12 semanas de idade para um dispositivo de retenção de modo a que o animal não seja livremente móvel, mas a cauda podem ser manipulados. </li><li> Colocar o dispositivo de retenção do rato sobre o seu lado, de modo a veia lateral da cauda é facilmente visível e está virada para cima. </li><li> Segure a cauda com a mão não-dominante entre o polegar eo dedo indicador. </li><li> Inserir a agulha (calibre pequeno, 27-30) a uma antecedência 10-15 graus de ângulo, bisel para cima, para dentro da veia lateral da cauda na direcção da cabeça. Manter o paralelo agulha e seringa para a cauda. </li><li> Do não aplicar pressão para trás para confirmar a colocação correta, pois isso poderia entrar em colapso da veia. </li><li> Lentamente injetar 200 ul Evans solução azul na veia da cauda do rato. </li><li> Observar a facilidade com que os avanços de êmbolo, tal como esta é a prova da correcta colocação da agulha na veia. </li><li> Coloque o mouse em sua gaiola e observá-lo durante 30 minutos. </li></ol> 2. Recolha de órgãos e Extração de azul de Evans dos Órgãos <ol><li> Sacrificar os animais por deslocamento cervical. Para fins de ensaio Miles deslocamento cervical é recomendada, uma vez que limita a interferência significativa com a permeabilidade vascular. Sacrificar todos os ratinhos, ao mesmo tempo, tão rápido quanto possível. Trabalhar com grupos de 6 ratinhos ou menos, porque logo após os vasos sanguíneos se tornam mais permeáveis ​​morte. </li><li> Coloque os ratos em suas costas e fixar os pés em uma placa branca. </li><li> Abra a cavidade abdominal e torácica para expor thorórgãos Acic e abdominal. </li><li> Tire fotos representativas para mostrar diferenças em Evans extravasamento Azul. Incluir todos os ratos no mesmo campo, a fim de ter condições de iluminação idênticas para todos os ratos. </li><li> Coletar órgãos de interesse e colocá-los em tubos de 1,5 ml </li><li> Pesar um tubo vazio e levar o valor do equilíbrio de zero. </li><li> Transfira a amostra de tecido e peso,. Repetir para todas as amostras de tecido. Os tecidos podem ser secos ao ar para eliminar a variabilidade teor de água entre os diferentes órgãos. </li><li> . Adicionar 500 ul de formamida a cada tubo de amostra de tecido. </li><li> Transferir todos os tubos para um banho de água 55 ° C ou bloco de calor. Incubar durante 24-48 h, para extrair Azul de Evans do tecido. </li></ol> 3. Quantificação de azul de Evans extravasado no tecido intersticial <ol><li> Centrifugar a formamida / azul de Evans mistura a pelota quaisquer fragmentos de tecido remanescentes. </li><li> Medir a absorvância a 610nm. Use 500 Formamida ul como em branco. </li><li> Calcular ng Azul de Evans extravasado por mg de tecido. </li><li> Traçar todos os dados em um gráfico. </li><li> Realizar a análise estatística para determinar diferenças significativas. </li></ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
<li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li>
<li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+reactions+to+histamine%2C+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li>
<li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li>
<li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability%3A+implications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li>
<li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability%2C+vascular+permeability+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%2C+histamine%2C+and+serotonin%2C+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle%2C+the+vesiculo-vacuolar+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li>
<li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nenhum conflito ou concorrentes interesses financeiros.

Permeabilidade vascular é um marcador para o estado fundamental do vaso sanguíneo. Aumento da permeabilidade vascular tem mostrado estar presente em várias doenças sistémicas, incluindo a diabetes, a hipertensão, e doenças auto-imunes 6,7,8. Aumento da permeabilidade vascular tem sido mostrado para ser mediada por tensão de corte, os factores de crescimento tais como o factor de crescimento endotelial vascular e factor de crescimento de fibroblastos, os mediadores inflamatórios tais como histamina, serotonina...

Formação e manutenção de barreiras permeáveis ​​selectivos são essenciais para o desenvolvimento do órgão apropriado e 1,2 desempenho. Linha de células endoteliais do lúmen do vaso sanguíneo e formar uma barreira semi-permeável, que é essencial para o transporte selectivo entre o sangue e o espaço intersticial de todos os órgãos. Uma barreira de permeabilidade adequada é mantida através apertados célula-a-célula junções que são estritamente controladas por factores de crescimento, citoquinas e moléculas de stress outros produtos 3. O rompimento da barreira de células endoteliais pode resultar em aumento da permeabilidade vascular e de fuga. Estes efeitos são observados em vários estados de doença e a compreensão da sinalização sublinhado molecular requer métodos multidisciplinares 4,5. Neste artigo, descreve um método in vivo para medir a permeabilidade vascular utilizando um modelo de rato. O ensaio que se descreve, também conhecido como ensaio de Miles, é uma bem establtada método para testar a permeabilidade vascular in vivo. O ensaio baseia-se no facto de que, sob condições fisiológicas basais, a albumina não atravessa a barreira endotelial. Azul de Evans, um corante azóico com elevada afinidade para a albumina, é injectado na corrente sanguínea de um animal experimental e, sob condições fisiológicas, é esperado para ser restringida dentro dos vasos sanguíneos. Quando um estímulo permeabilidade vascular é adicionado, quer por aplicação tópica ou sistemicamente, os vasos sanguíneos começar a vazar proteína e, assim, também o azul de Evans, que se liga à albumina. Isto resulta numa coloração rápida azulada dos tecidos que têm vasos permeáveis. Injecção com êxito do corante na veia da cauda do rato lateral é crítica para o bom resultado do experimento. Técnica de injecção da veia da cauda requer prática extensiva e deverá ser dominadas antes de se iniciar a experiência. Permeabilidade vascular é altamente dependente da idade e do peso do umImal, então quando comparando diferentes linhagens de camundongos, é imperativo que os ratos ou outros assuntos de teste têm perto de datas de nascimento e peso idênticos. Outros factores que influenciam a permeabilidade da barreira endotelial são condições ambientais, tais como temperatura, humidade, e muito importante, o stress manuseamento do rato. Devido ao grande número de fatores que podem influenciar o resultado do experimento, é sempre aconselhável que o experimento é repetido pelo menos três vezes e análise estatística realizada. Este ensaio pode ser utilizado para comparar a permeabilidade ou vaso de ratos que foram geneticamente modificadas, bem como os ratos com diferentes antecedentes genéticos. A permeabilidade pode ser determinada na presença ou na ausência de um estímulo, dependendo da função do gene, que é modulada. Este ensaio também pode ser usado ou para testar o efeito de diferentes compostos sobre a permeabilidade do vaso.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTES </td></tr><tr><td> Azul de Evans </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDA </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> Fosfato 0,2 M 1,5 M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> ESPECTROFOTÔMETRO </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> Dispositivo de retenção MOUSE </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> SERINGA </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> AGULHAS </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> O calibre da agulha depende do tamanho do animal. </td></tr><tr><td> BALANÇO </td><td> Denver Instrument </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

um<em&gt; in vivo</em&gt; ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Este método baseia-se na injecção intravenosa de azul de Evans nos ratinhos como modelo animal de teste. Azul de Evans é um corante que se liga a albumina. Sob condições fisiológicas o endotélio é impermeável à albumina, de modo do azul de Evans encadernados restos de albumina restrito dentro dos vasos sanguíneos. Em condições patológicas que promovem o aumento da permeabilidade vascular células endoteliais parcialmente perder seus contatos próximos e com o endotélio torna-se permeável a pequenas proteínas, como a albumina. Esta condição permite o extravasamento de azul de Evans dos tecidos. Um endotélio saudável impede o extravasamento do corante nos tecidos vizinhos vascularizados. Órgãos com aumento da permeabilidade irá mostrar um aumento significativo em comparação com coloração azul órgãos com endotélio intacto. O nível de permeabilidade vascular pode ser avaliado por simples visualização ou por medição quantitativa do corante incorporado por miligrama de tecido de controlo versus animal experimental / tecido. Dois powerful aspectos deste ensaio são a simplicidade e características quantitativas. O Evans Blue, podem ser extraídos a partir de tecidos por incubação de uma quantidade específica de tecido em formamida. Evans Blue é a absorvância máxima a 620 nm e a absorvência é mínima a 740 nm. Utilizando uma curva padrão para o azul de Evans, medições da densidade óptica pode ser convertida em miligrama de corante capturado por miligrama de tecido. A análise estatística deve ser usado para avaliar diferenças significativas na permeabilidade vascular.

Foi utilizado um ensaio in vivo para testar a permeabilidade vazamento navio em ratinhos de 8-12 semanas de idade. Este teste é útil para comparar a permeabilidade vascular relativa entre animais de fundo genético diferente ou em uma única estirpe de ratos submetidos a tratamentos que afectam a vasculatura. Os nossos resultados mostram que a estirpe de murganhos geneticamente modificados, criados no nosso laboratório tem um endotélio mais permeável em comparação com ratinhos de tipo selvagem. Estas alt...

Estamos apresentando um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para testar a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Este ensaio baseia-se na injecção intravenosa de uma visualização do corante e subsequente da sua difusão para os espaços intersticiais.

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Este vídeo apresenta um ensaio in vivo para testar a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Em camundongos, as células endoteliais revestem os vasos sanguíneos e formam uma barreira semipermeável. Em condições fisiológicas, o endotélio é impermeável à maioria das proteínas, de modo que estas são restritas ao fluxo sanguíneo.Em condições patológicas que promovem aumento da permeabilidade vascular, as células endoteliais perdem parcialmente o contato entre si. O endotélio torna-se permeável a proteínas pequenas, como a albumina. Neste ensaio, injetamos intravenosamente um corante azul que se liga à albumina em condições de permeabilidade endotelial aumentada.O D atravessa a barreira endotelial e difunde-se para o espaço intersticial. Isso resulta, em última instância, em uma coloração azulada do tecido afetado antes de o experimento ser iniciado. Prepare todos os materiais necessários, pipete e ponteiras estéreis.Azul de Evans, espátula estéril, PBS estéril, seringa estéril e agulhas. Camundongos, dispositivo de contenção para camundongos, instrumentos de dissecação, placa de dissecação e pinos. Balança de precisão, bloco térmico para banho-maria a 55 graus Celsius.Pese em um espectrof

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Este vídeo descreve um ensaio de permeabilidade para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro usando moléculas de fluoresceína de sódio.

Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

A manutenção da cobertura da barreira hematoencefálica é fundamental para a homeostase do sistema nervoso central. Este protocolo descreve técnicas in vitro para delinear os processos fundamentais e patológicos que modulam a cobertura da barreira hematoencefálica.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

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Um método In Vivo para avaliar a barreira de sangue do intestino e metabolismo hepático da Microbiota produtos

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

O método aqui apresentado pode avaliar o efeito dos reagentes na angiogênese ou permeabilidade vascular in vivo sem coloração. O método utiliza injeção de dextran-FITC através da veia caudal para visualizar neovasos ou extravasamento vascular.

Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Aprenda um ensaio in vivo para avaliar a permeabilidade vascular em camundongos usando corante azul que se liga à albumina. Este método permite visualizar a integridade endotelial e investigar doenças relacionadas aos vasos sanguíneos.

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