Name: Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar miofibras individuais do músculo EDL de camundongos adultos, preservando a associação com células satélites. Este método permite estudar a ativação e diferenciação celular em nicho fisiológico relevante.

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Gostaríamos de agradecer a Sarah Dick para a prestação de leitura crítica e comentários. MAR detém a Cátedra de Pesquisa do Canadá em Genética Molecular e é um estudioso de Pesquisa Internacional do Howard Hughes Medical Institute. Este trabalho foi financiado por doações para MAR dos Institutos Nacionais de Saúde, do Howard Hughes Medical Institute, dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, a Associação de Distrofia Muscular e do Canadá Research Chair Programa.

Todos os experimentos foram tratadas de acordo com a Universidade de Ottawa regulamentos para cuidados com os animais e manuseio. Ver Tabela 1 para uma visão geral do protocolo. 1. Antes de iniciar o isolamento <ol><li> Prepare as seguintes soluções: A colagenase do tipo I de 0,2% em DMEM (meio de Dulbecco modificado por Eagle; glucose elevada, L-glutamina, com 110 mg / ml de piruvato de sódio). Para dois músculos EDL preparar 2 ml de Collagenease 0,2% em DMEM. Filtrar a solução através de filtro de 0,22 ^ m. 10 min antes do isolamento, Pré-aquecer a 37 ° C num banho de água. Alíquotas adicionais de colagenase não diluído pode ser congelada a -20 ° C para uso posterior. Nota: utilizar DMEM com piruvato de sódio ao longo de todo o processo. Fibras não sobrevivem em meio de sódio-piruvato livre. <ul><li> A lavagem de mídia (usar para executar todas as lavagens). Suplemento DMEM com 1% de Penicilina / Estreptomicina. Filtrar com 00,22 uM de filtro antes do uso. </li><li> Meios de Cultura de miofibras. Suplemento DMEM com FBS a 20% de extracto de embriões, 1% de galinha e 1% de Penicilina / Estreptomicina. Filtrar através de filtro de 0,22 um antes da utilização. </li><li> Matrigel pratos revestidos. Para fibras de cultura para longo período de tempo, recomendamos a utilização Matrigel como substrato de revestimento. Para preparar Matrigel pratos revestidos, descongelar uma aliquota de Matrigel, a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, diluir 1:10 em DMEM Matrigel. Matrigel manter a 4 ° C em todos os momentos e evitar mudanças bruscas de temperatura, pois isso irá criar cristais microscópicos na solução resultando em Matrigel revestimento desigual. Pratos lugar para ser revestido em gelo. Pratos casaco com volume suficiente para cobrir a superfície. Deixe descansar por 1 min. Remover completamente o Matrigel sobra. Deixe pratos seco a 37 ° C durante pelo menos 3 horas antes da sua utilização ou durante a noite. </li></ul> Nota: aliquotas de Matrigel diluída pode ser re-utilizada várias vezes para fins de revestimento, se armazenado a 4 &amp; deg; C. </li><li> Por último, não se esqueça de limpar a estação de microscópio e ferramentas de dissecação com etanol 70%. </li><li> Por dois isolamentos EDL (um rato) preparar cinco pratos de Petri de plástico (60 * 15mm) como segue: <ul><li> Quatro pratos para o isolamento (1 para o músculo dissociação, 3 para lavagens de série). Todos os pratos devem ser revestidos com soro de cavalo (HS) para evitar miofibras de se ligarem ao plástico. Para revestir, pipeta de 3 ml de soro de cavalo em cada prato redemoinho, para permitir o revestimento mesmo, remover o soro de cavalo e deixar que o prato seco durante pelo menos 30 min. Adicionar 4 ml de DMEM a cada placa. Mantenha pratos a 37 ° C em 5% de uma incubadora de CO 2 antes da sua utilização. </li></ul> Nota: soro do cavalo pode ser re-utilizada várias vezes, se mantidas estéreis. Alternativamente, uma solução de HS a 10% em DMEM pode ser utilizado para revestir os pratos. Use pratos SH revestidos durante todo o protocolo de cultura e miofibras quando em condições de flutuação. <ul><li> Um prato será utilizado para miofibras de cultura, após o isolamento. Alttamanhos prato ernative ou formatos pode ser utilizada para a cultura final de miofibras dependendo aplicações a jusante. No entanto, não sugerem prato tamanhos maiores do que 60 * 15 milímetros. Miofibras podem ser mantidas em suspensão durante não mais do que 96 horas antes de contração hiper ocorre. Por vezes mais cultura, recomendamos o uso de Matrigel pratos revestidos ou placas. </li></ul></li><li> Para um isolamento de fibra (2 EDL), preparar duas pipetas de Pasteur estéril: uma pipeta de grande diâmetro para manipulação muscular e uma pipeta de diâmetro pequeno para a manipulação de células musculares. Use uma caneta de diamante para cortar cada pipeta de vidro para o comprimento desejado e polonês calor para suavizar as bordas da pipeta. Ao utilizar a chama, o ponta curva da pipeta pequeno furo. Isso vai ajudar a lidar com fibras individuais. Chama para esterilizar. Brasão pipeta cada um com HS antes do uso. </li></ol> 2. Dissecção muscular e digestão <ol><li> Para efeitos dessas experiências, de 8 semanas de idade SV129, Pax7 creer Cklr; Rosa26TdTomato (Pax7Cre-TdTomato) e Myf5-Cre; Rosa26YFP foram utilizados. </li><li> Pulverizar membros posteriores com etanol a 70%. Pin o animal (o rosto) para uma placa de apoio para ter uma melhor compreensão do membro posterior durante o procedimento. </li><li> Com a ajuda de uma tesoura, corte através de todo o comprimento do membro e expor o músculo subjacente. Remova a pele, bem como todo o cabelo ou da pele (Figura 1A). </li><li> Com uma tesoura fina, corte através da fáscia fina, sem danificar os músculos subjacentes. Visualmente localizar o EDL. O EDL é encontrada no compartimento anterior do membro posterior, imediatamente abaixo do músculo tibial anterior (TA). </li><li> Com a ajuda de duas pinças, expor os tendões distais. </li><li> Corte os tendões distais (tanto do TA e EDL) com afiadas tesouras Cohann-Vannas primavera. </li><li> Com a ajuda de fórceps mantenha ambos TA e EDL músculos por os tendões e os músculos delicadamente puxar-se no sentido da extremidade proximal. Neste ponto, você deve ser capaz de ver claramentemúsculo EDL logo abaixo do músculo TA. Agora, separar a partir do músculo EDL TA puxando os dois tendões em sentidos opostos (Figura 1B). Evite alongamento do músculo EDL ao executar esta operação pois isso irá danificar as fibras musculares. </li><li> Expor o tendão EDL. Para melhor visualizar o tendão proximal pode ajudar neste momento para remover o músculo TA. Também pode ajudar a cortar algum tecido conectivo em torno do joelho (Figura 1C). </li><li> Cortar o tendão proximal e retire cuidadosamente o EDL (Figura 1D). </li><li> Mantendo o músculo por meio de seus tendões, transferi-lo para 2 ml de solução de colagenase previamente preparada. Incubar a 37 ° C num banho de água. Nota: para o isolamento de fibras de sucesso, é importante isolar a EDL a partir do tendão de tendão de modo que a integridade da fibra muscular é mantida. Passos 2,3-2,9 pode ser realizada sob um microscópio de dissecação. Como alternativa, o uso de um magnlificação de vidro também pode ajudar a ter uma melhor visão dos músculos. </li><li> Repita os passos de 2,3-2,9 para isolar o EDL segundo. Transferir o EDL em segundo lugar no mesmo tubo. Para evitar a digestão irregular, o isolamento do segundo EDL deve ser completado não mais de 5 minutos após a primeira. Nota 1: O tempo de incubação pode ter de ser ajustada em função da actividade da colagenase. De incubação mais longo ou mais curto pode ser necessária, dependendo do tamanho, idade e / ou condição do músculo (por exemplo, músculos precisam de tempo mais longo fibróticas digestão). Nota 2: Se examinar o comportamento das células satélite em condições de quiescência, agitação durante o tempo de digestão muscular pode ativar as células satélites 10. </li><li> Durante o tempo de digestão, visite regularmente o músculo para evitar o excesso de digestão. Pare a digestão quando os músculos começam a relaxar e miofibras são visíveis. Para parar a digestão, transferir cuidadosamente ambos os músculos para uma placa de Petri, pré-aquecido com 4 ml de DMEM (dissociatino prato). Use a pipeta tamanho grande diâmetro para realizar esta operação. Nota: evitar overdigestion muscular, o que resulta inevitavelmente em isolamento de hiper miofibras contratados. </li></ol> 3. Único miofibras Dissociação e Cultura <ol><li> Para liberar miofibras, use a pipeta de vidro de grande diâmetro para lavar o músculo com meio morna até fibras naturalmente começam a ser liberados. Não triturar o músculo como isso vai resultar inevitavelmente em fibras prejudiciais. Execute este e os seguintes passos sob um microscópio de dissecação. </li><li> Continuar lançando miofibras até que o número desejado seja alcançado. Se o prato é necessária, à temperatura ambiente durante mais de 10 min a 5 min permitir (mínimo) de incubação a 37 ° C, 5% de CO 2 para re-equilibrar o meio. Observação: se o meio atinge temperaturas abaixo fisiológica (37 ° C) durante um período de tempo prolongado miofibras morrerá. </li><li> Utilizando o tamanho pequeno furo pipeta, transfer viver miofibras simples para um novo prato pré-aquecido (primeira de três lavagens consecutivas). Lidar com cada fibra muscular individualmente em vez de transferir em massa de fibras musculares de uma só vez. Se necessário, incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante 10-15 minutos para re-equilibrar o meio. </li><li> Repetir o passo 3.3 para mais 2 vezes ou até que todas as fibras musculares mortas e detritos são removidos. Recomendamos pelo menos três lavagens consecutivas para adequada limpeza. Nota: miofibras mortos aparecerá tão curto e hiper contratada sob a luz do microscópio. </li><li> Incubar miofibras individuais a 37 ° C, 5% de CO 2 no prato última lavagem (DMEM apenas) durante pelo menos uma hora antes de mudar para o meio de cultura. Isto permite ajustar a miofibras as condições in vitro, na ausência de soro. Nós descobrimos que a cultura imediato de miofibras em meio rico soro aumenta o encolhimento das fibras. </li><li> Após uma hora, a transferência de miofibras um prato pré-aquecido ou novo para o formato de cultura apropriadodependendo da aplicação a jusante. Fibras de cultura em meio de soro de alta para permitir a ativação de células satélites. Alternativamente, diferentes concentrações de soro ou extractos de embrião de galinha podem também ser usados. Alterar médio em dias alternados. </li></ol> 4. Aplicações jusante <ol><li> Imunocoloração. Miofibras vivo podem ser fixadas e coradas em qualquer ponto de tempo durante o isolamento. Imunofluorescência podem ser realizadas tanto em miofibras flutuantes e substrato anexado. Se a coloração miofibras flutuantes, utilizar uma pipeta de vidro de pequeno diâmetro para transferir miofibras de uma solução para a outra. Em alternativa, é possível manter miofibras no mesmo poço ao longo de todo o procedimento e adicionar / remover soluções utilizando uma pipeta de vidro. Evitar a aspiração normal como isso vai resultar na remoção das fibras musculares, bem. Resumidamente, remover completamente o meio de cultura; miofibras fix em paraformaldeído a 4%, pré-aquecido (PFA), durante 5 min. Extensivamente lavar em tempos vários PBS. Incubaçãote em miofibras de glicina a 1% em PBS ou outras soluções de têmpera padrão para minimizar o PFA coloração de fundo. Se necessário, permeabilizar miofibras com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 10 min, seguido por uma lavagem de 5 minutos em PBS. Incubar as fibras em solução de bloqueio (10% de soro de cavalo, 0,1% de Triton X-100, 1% NaN) durante 1 hora à temperatura ambiente ou, de preferência durante a noite a 4 ° C. Soluções alternativas de bloqueio pode ser utilizado, dependendo do anticorpo de interesse. Lavar uma vez com PBS durante 5 min. Incubar com o anticorpo primário apropriado diluído em solução de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Lavar 3 vezes em fibras 5 min por lavagem com PBS para remover qualquer anticorpo não ligado. Incubar com o anticorpo secundário adequado, durante 45 minutos a 1 h à temperatura ambiente. Lavar 3 vezes em 5 minutos por lavagem em PBS. Contracoloração núcleos com 1 mg / ml DAPI. Se corar fibras flutuantes, transferir cada fibra a uma lâmina de vidro para microscópio adequado. Retire o excesso de PBS ou médio prazo. Aplicar montagem medihum e adicione lamela. Avance para visualizar miofibras sob um microscópio de fluorescência. Ver Figura 4 para imunofluorescência representante no miofibras EDL. Procedimentos de coloração que utilizam fixadores alternativos mais fortes encontram-se descritos em Verma, M. et al. 11 e Wosniak, AC et al. 12. </li><li> Oligonucleótido ou plasmídeo de transfecção transiente. Miofibras vivo podem ser transfectadas com plasmídeo ou siRNA para gene específico / s de interesse. Ao usar siRNA, transfecção dupla é recomendado para knockdown do gene eficiente. Sugerimos realizar a transfecção primeira após 8 horas a partir do isolamento. Seis horas após a transfecção, substitua por meio fresco. Para a transfecção siRNA, sugerimos iniciar usando uma concentração final de 50 nM. Knockdown expressão do gene pode ser analisado por extração de RNA ou, preferivelmente, por imunocoloração. </li><li> Infecção viral. Infecção de miofibras vivos é possível embora a incidência de célulamorte é maior do que com o oligo de transfecção e a eficiência da infecção pode ser variável, dependendo das condições do músculo e da idade. Por exemplo, fibras musculares dos músculos adultos intactos são particularmente não responsivo a infecção viral, devido à presença da lâmina basal, que foi mostrado para proporcionar uma barreira de protecção contra a infecção pelo anfitrião 13, 14. Lentivirais são preferidos sobre os vectores retrovirais, pois eles podem infectar células quiescentes (mitótica não). Para infecção viral, é aconselhável que as fibras em um prato de cultura revestido com Matrigel ou placa e deixar miofibras ajustar às condições de media para o primeiro 24 hr. </li><li> Viver Imaging. Vivo imaging de miofibras é particularmente demorado e necessita de um microscópio equipado com um 37 ° C, 5% de CO 2 da câmara. É útil quando se avalia o comportamento das células satélites individuais. Trabalho feito com essa técnica tem sido fundamental para a descoberta da heterogeneidade da célula satélite e estudar sua BehaVior sobre as fibras (15 e 16). </li></ol>

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<li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+required+for+the+specification+of+myogenic+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates%3A+a+mechanism+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li>
</ol>

Não há interesses conflitantes.

O isolamento e cultura de miofibras individuais a partir de músculos intactos fornece um excelente modelo in vitro para estudar o processo de regeneração muscular. Uma característica única do presente sistema é a preservação de células satélites no seu ambiente fisiológico abaixo da lâmina basal. Mais importante, a técnica pode ser utilizada para investigar o comportamento de células estaminais musculares, tanto quiescência e estados activados. Ao longo dos últimos 20 anos, o sistema de cultura de células musculares forneceu introspecções significativas sobre a biologia da população de células satélite em relação a ambos os determinantes intrínsecos e extrínsecos. Por fibras musculares individuais de cultura, a heterogeneidade de células satélites em relação à fibra muscular, tipo de músculo ou potencial regenerativo foi abordada 15. Elaborar estudos usando imagens ao vivo de um único fibras cultivadas permitidos para as informações sobre o padrão de satélite ganhando a migração de células 16. A aquisição de dados é um quantitativoslso possível. Embora demorado, que fornece informações importantes sobre a distribuição e a ocorrência de eventos específicos (células estaminais rácio divisão proliferação, diferenciação e assimétrico, etc.) Juntamente com as aplicações acima descritas, a proteína ou a extracção de ARN a partir de fibras individuais é também possível, embora o isolamento da população pura de células satélites por FACS ou outros meios podem proporcionar uma melhor plataforma para investigar mudanças de expressão de proteínas ou genes num nível molecular. Em nossa experiência, o passo mais importante para o isolamento de fibra de sucesso é o &quot;tendão para tendão&quot; isolamento (passos 2,5-2,9 no texto do protocolo). Isto garante que, após a digestão do músculo, as fibras são libertadas a partir do EDL com danos mínimos ou sem aumentando assim o seu desempenho nas etapas seguintes.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente / Material </td></tr><tr><td> Colagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-1g </td><td> Prepare frescos todos os momentos para melhores resultados. Alíquotas adicionais de colagenase não diluído pode ser armazenado a -20 ° C. </td></tr><tr><td> DMEM alta glicose + NaPyr </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td> Adição de Pen / Strep é necessário para minimizar a contaminação do ar </td></tr><tr><td> Caracterizado soro fetal bovino </td><td> Hyclone </td><td> SH30396.03 </td><td> Lote # KUJ35152 </td></tr><tr><td> O soro de cavalo </td><td> Hyclone </td><td> SH300.74.03 </td><td> Lote # AVJ82494 </td></tr><tr><td> Extrato de embrião de galinha </td><td> Accurate Chemical </td><td> CE-650-T, Batch B7035010 </td><td> Evitar o congelamento-descongelamento ciclos. </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td></td><td> Alíquotas de armazenar a -20 ° C. Evitar o congelamento-descongelamento ciclos. Armazenar aliquotas diluídas a 4 ° C. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Cohann-Vannas Scissor Primavera 6 milímetros Lâminas-Straight-Sharp </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-02 </td><td></td></tr><tr><td> Iris extra fino Tesoura-10,5 centímetros </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Moria-Íris Fórceps Curvo </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11373-12 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur Pipetas </td><td> VWR </td><td> 14672-380 </td><td> 14672-200 </td></tr><tr><td> Diamante Pen </td><td> VWR </td><td> 52865-005 </td><td></td></tr><tr><td> 60 * 15mm prato de Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-092 </td><td></td></tr><tr><td> Acrodisc 0,22 uM filtro </td&gt; <td> VWR </td><td> CA28-145-477 </td><td></td></tr><tr><td> Dissecando microscópio StemiV6 </td><td> Zeiss </td><td></td><td> Uma fonte de luz adicional pode ser necessário para ter uma visão melhor foco </td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Regeneração muscular no adulto é realizada por células estaminais residentes chamadas células satélite. Células satélites são definidas pela sua posição entre a lâmina basal e o sarcolema de cada fibra muscular. O conhecimento científico actual do seu comportamento fortemente dependente da utilização do protocolo de isolamento única fibra muscular. Em 1985, Bischoff descrito um protocolo para isolar as fibras individuais em directo da flexor Brevis (FDB) de ratos adultos, com o objectivo de criar um sistema in vitro em que a associação física entre a fibra muscular e as células estaminais são preservados os seus 1. Em 1995, o protocolo Rosenblattmodified Bischoff tal que as miofibras são individualmente colhidos e tratados separadamente, após digestão com colagenase em vez de serem isolados por sedimentação por gravidade 2, 3. O Rosenblatt ou Bischoff protocolo já foi adaptado para diferentes músculos, idade ou condições 3-6. A técnica de isolamento é uma única fibra muscular indispensávelferramenta devido suas vantagens únicas. Em primeiro lugar, no protocolo fibromuscular único, as células satélites são mantidas abaixo da lâmina basal. Esta é uma característica única do protocolo como outras técnicas, como a classificação de fluorescência celular ativado exigem química e mecânica do tecido dissociação 7. Embora o sistema de cultura de fibra muscular não pode substituir para estudos in vivo, ele oferece uma excelente plataforma para abordar relevantes propriedades biológicas de células-tronco musculares. Miofibras individuais podem ser cultivadas em condições normais de revestimento, ou em condições de flutuação. Células satélites em miofibras flutuantes são submetidos a praticamente nenhuma influência diferente do ambiente de fibra muscular. Rigidez do substrato e do revestimento têm sido mostrados para influenciar a capacidade de células satélites &quot;para regenerar músculos 8, 9 de modo a ser capaz de controlar a cada um destes factores de forma independente permite a discriminação entre nicho-dependentes e independentes de respostas. Diferentes concentrações de soro têmTambém foi mostrado para ter um efeito sobre a transição da quiescência da activação. Para preservar o estado de quiescência das suas células satélites associados, as fibras devem ser mantidas em meio de soro baixo 1-3. Isto é particularmente útil quando se estuda os genes envolvidos no estado de repouso. Em meio rico soro, as células satélites ativar rapidamente, proliferam, migram e se diferenciar, assim, imitando o processo regenerativo in vivo 1-3. O sistema pode ser utilizado para realizar uma variedade de ensaios, tais como o teste de inibidores químicos; expressão ectópica de genes de vírus da entrega; gene baseada oligonucleótido knock-down ou imagens ao vivo. Este artigo descreve o protocolo de vídeo utilizado atualmente em nosso laboratório para isolar miofibras simples do extensor longo dos dedos (EDL) músculos de camundongos adultos (6-8 semanas de idade).

Aqui descrevemos o isolamento de miofibras individuais a partir do músculo EDL de camundongos adultos. Miofibras sucesso produzir depender de vários fatores, tais como a atividade da colagenase ou condições musculares ou idade. Mais importante ainda, o isolamento do músculo do tendão para resultados de tendão em comprimento, miofibras intactas de músculo EDL. Figura 1 mostra uma passo a passo representação gráfica do &quot;tendão para tendão&quot; isolamento. Uma vez que o músculo é totalmente digerido, miofibras são libertados pela aplicação de uma pressão suave para o músculo. Figura 2A mostra uma imagem representativa de um experimento de isolamento de fibra muscular após a primeira lavagem. Neste ponto, a cultura contém uma mistura de feixes de fibras musculares individuais que aparecem como longas e brilhantes estruturas tubulares, hiper contraído miofibras que são escuro e curto e detritos a partir do processo de digestão. Para o fim de, pelo menos, três lavagens consecutivas, apenas simples miofibras vivos devem permanecer na dish para a cultura ou a análise a jusante (Figura 2B). A Figura 2C mostra uma fibra longa, ao vivo, em comparação com uma fibra de hiper contraído (C &#39;). No momento do isolamento, as células satélites aparecem como pequenas saliências na superfície de fibra muscular (Figura 3A). Se mantidas em meio rico de soro, as células satélites activar, proliferam, migram e eventualmente fundir em miotubos (B). Após 15 dias de cultura, todos os miotubos expressar o Myf5 repórter YFP (C) o que sugere que a regeneração muscular no adulto é realizada por células que, em algum momento durante o seu desenvolvimento exprimiram o factor determinante miogênica Myf5. Todas as células satélites expressar o fator de transcrição emparelhado caixa Pax7 17. A linha de rato repórter Pax7Cre-TdTomato pode ser utilizado para rastrear as células satélite através da expressão do sinal TdTomato fluorescente (Figuras 3D e E). Figura 4 mostra um representante IMMUnofluorescence da dupla Pax7 + / células satélites MyoD. Classicamente dupla Pax7 + / + MyoD células satélites são considerados proliferativas progenitores musculares comprometidos, que quer concluir o programa de diferenciação por baixo regulação Pax7 mantendo expressão MyoD ou retorno à quiescência por baixo regulação MyoD e manter Pax7 expressão 18 <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Isolamento músculo EDL de rato dos membros posteriores. Um dos membros posteriores. De um rato adulto 8 semana de idade. Setas indicam o tendão (joelho) eo tendão distal (pé) proximal. B. Posição anatômica do músculo tibial anterior (TA) e extensor longo dos dedos (EDL) muscular. C. Ao segurar o EDL através do tendão proximal, o músculo é puxado para o joelho para expor o tendão distal. D. O tendão distal écortadas ea EDL é liberado. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Os resultados representativos de uma única experiência de fibra muscular isolamento. A. Imagem de campo brilhante de uma experiência de isolamento de fibra muscular na etapa a primeira lavagem. Seta vermelha indica miofibras ao vivo, seta branca indica hiper miofibras contratados e seta amarela indica células, células musculares ou detritos ECM. B. Após lavagens consecutivas em DMEM, apenas miofibras vivo permanecem. C e C &#39;. Imagem representa uma longa intacto vivo fibromuscular (C) e uma hiper curto contratada fibra muscular (C &#39;). Bar de 10 um. Fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 equipado com AxioCam RH. <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figur<html> e 3. Os resultados representativos de uma única experiência de fibra muscular cultura. Uma. Imagem campo brilhante de uma fibra muscular, único vivo com seu celular via satélite associado (seta), logo após o isolamento (Tempo 0). B. Miofibras individuais foram plaqueados em Matrigel e cultivadas em meio rico de soro durante 15 dias. Seta branca indica miotubos diferenciadas em comparação com as células individuais (seta amarela) c. Miofibras individuais de um Myf5Cre; rato RosaYFP foram cultivados como em B. A seta indica a Myf5 miotubos derivados. D e E. Miofibras individuais de Pax7Cre; TdTomato foram isoladas e fixadas logo após. As setas indicam Pax7 células satélites quiescentes positiva (E, vermelho). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (D). Bar: 50 ^ m. Fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 equipado com AxioCam RH. maneiras &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Exemplo de coloração por imunofluorescência de células satélites em miofibras. Miofibras individuais foram isoladas e cultivadas durante 72 horas em condições de flutuação. Células satélites em miofibras foram marcadas para o satélite célula específica marcador Pax7 (B, vermelho) e do fator miogênico MyoD regulamentar (C, verde). Os núcleos foram contrastadas com DAPI (A). Barras: 50 ^ m. Fotos foram tiradas com um microscópio Zeiss Axio Observer Z1 equipado com AxioCam RH. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> A dissecção do músculo (5 min cada músculo) </td><td><ul><li> Tendão para tendão isolamento </li><li> Ferramentas afiadas </li><li> Dano muscular mínima </li></ul></td></tr><tr><td> Digestão muscular (30-45 min) </td><td><ul><li> Temperaturasensível </li><li> Evite overdigestion </li></ul></td></tr><tr><td> Isolamento de fibra </td><td><ul><li> Evitar o excesso de manipulação de fibras </li><li> Eliminar os detritos com várias lavagens </li></ul></td></tr><tr><td> Cultura de Fibra (até 3-4 semanas) </td><td><ul><li> Formato: qualquer </li><li> Revestimento: soro de cavalo, Matrigel </li><li> Meio: basal ou elevado soro </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Visão geral do protocolo de isolamento de fibra muscular. O protocolo de isolamento de fibra muscular consiste em 4 passos principais. Para cada etapa, o tempo aproximado e os principais pontos críticos são discutidos. Para uma discussão detalhada de cada etapa, consulte o texto do protocolo.

Isolamento e cultivo de fibras musculares é o padrão ouro<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar a passagem de células através da activação de satélite quiescência e a diferenciação. É importante notar que o sistema de cultura de células musculares único preserva a associação de células fibromuscular / haste, que é um componente essencial do nicho de células-tronco do músculo.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar fibras vivas individuais e suas células-tronco associadas do músculo EDL de camundongos adultos. Isso é feito dissecando primeiro o EDL usando um procedimento de dissecação tendão a tendão que não danifica as fibras. Em seguida, é realizada uma digestão muscular para desagregar as fibras, preservando a associação de células-tronco de miofibras, que é uma etapa única para este protocolo.Na etapa final, as fibras miométricas individuais são suavemente separadas umas das outras, enquanto os detritos ou fibras hipercontraídas são removidos por lavagens sequenciais. Em última análise, as fibras de mio isoladas por esta técnica podem ser mantidas em um estado semi-quiescente com estímulos mínimos de ativação ou cultivadas em meio sérico alto para estudar a ativação e diferenciação de células satélites. Nos últimos anos, o uso de fibras de pântano cultivadas tem sido uma abordagem muito poderosa para estudar a ativação, proliferação e diferenciação de células satélites em um nicho fisiológico relevante.Essa abordagem realmente nos permitiu fazer grandes progressos na compreensão da função dessas células no nível molecular e celular. Para cada camundongo do qual o EDL é isolado, prepare cinco placas de Petri de plástico de 60 milímetros com uma camada de pipeta de soro de cavalo, quatro milímetros de soro de cavalo em um prato e gire-o para obter um revestimento uniforme. Em seguida, remova o soro de cavalo aspirando qualquer sobra de soro e deixe o prato secar por pelo menos 30 minutos.Depois de meia hora, adicione quatro mililitros de mídia de lavagem a quatro pratos. Rotule os pratos da seguinte forma, músculo após digestão, lave um, lave dois e lave três. Adicione quatro mililitros de meio de cultura de fibra ao prato de cultura de fibra restante.Mantenha os pratos a 37 graus Celsius em uma incubadora de 5% de dióxido de carbono antes de usar. Em seguida, para um isolamento de fibra, prepare duas pipetas estéreis ao microscópio. Faça uma pipeta de furo grande cortando uma pipeta de furo pequeno com uma caneta de diamante para que a abertura seja grande o suficiente para que todo o músculo seja lavado.A segunda pipeta é uma pipeta de pequeno diâmetro para manipulação MyFi. Agora acenda as pipetas para alisar as bordas e para esterilização usando a curva de chama, a ponta da pipeta de pequeno diâmetro. Isso ajudará a lidar com fibras individuais durante o isolamento.Em seguida, cubra ambas as pipetas com soro de cavalo. Por fim, certifique-se de limpar a estação do microscópio e as ferramentas de dissecação com etanol a 70%. Para esta demonstração, camundongos transgênicos SV 1 29 com oito semanas de idade.Foram sacrificados. Pulverize os membros posteriores com 70% de etanol. Em seguida, prenda o animal em uma placa de suporte voltada para cima.Isso é necessário para fornecer uma melhor compreensão dos membros posteriores. Em seguida, corte todo o comprimento do membro e exponha o músculo subjacente. Remova a pele, bem como qualquer cabelo ou pelo.Usando uma tesoura fina, corte a fáscia fina que envolve o músculo sem danificar o tecido subjacente. Exponha os tendões distais TA e EDL usando cohan Vana afiado. Tesoura de mola.Corte os tendões distais EDL e TA. Em seguida, com a ajuda de uma pinça, segure os músculos TA e EDL pelos tendões e puxe delicadamente os músculos para cima em direção à extremidade proximal. Neste ponto, você deve ser capaz de ver claramente o músculo EDL logo abaixo do músculo TA.Agora separe o EDL do músculo TA puxando os dois tendões em direções opostas. Evite alongar o músculo EDL durante a realização desta operação. Como isso danificará as fibras myo.Exponha o tendão EDL. Neste ponto, pode ajudar a remover o músculo TA para visualizar melhor o tendão proximal. Também pode ajudar a cortar parte do tecido conjuntivo ao redor do joelho.Quando o tendão estiver claramente visível, use uma tesoura afiada de mola de Vênus Cohan para liberar o músculo EDL. Se o procedimento foi feito corretamente, se o EDL deve ser capaz de manter sua forma alongada, uma vez removido do membro, segurando o músculo EDL através de seus tendões, transfira-o para uma solução pré-aquecida de colagenase de dois mililitros e incube em banho-maria a 37 graus Celsius. Repita o processo para isolar o segundo EDL e transferi-lo para o mesmo tubo de colagenase para uma digestão desigual.O isolamento do segundo EDL deve ser concluído dentro de cinco minutos após o isolamento. O primeiro tempo de incubação EDL pode precisar ser ajustado dependendo da atividade colágena, tamanho do músculo, idade do animal ou condição muscular. Por exemplo, músculos com muito tecido fibrótico podem exigir um tempo de incubação mais longo.Além disso, observe que a agitação durante esse período demonstrou ativar as células S Durante o tempo de digestão, verifique regularmente o músculo para evitar a digestão excessiva. Pare a digestão quando os músculos começarem a se soltar e as fibras do mio se tornarem visíveis. Usando a pipeta de calibre grande, transfira cuidadosamente os dois músculos para uma placa de Petri pré-quente.Com quatro mililitros de meios de lavagem sobre a digestão, deve-se evitar, pois resulta em fibras mio-semi hipercontraídas. Para liberar as fibras myo, use a pipeta de vidros de grande calibre para lavar o músculo com meio quente até que as fibras comecem a ser liberadas naturalmente. Não tritra o músculo, pois isso inevitavelmente resultará em danos às fibras.Continue liberando as fibras myo até atingir o número desejado. Não deixe o prato em temperatura ambiente por mais de 10 minutos. Devolva-o à incubadora por cinco minutos para se reequilibrar antes de trabalhar com ele por mais tempo.A cultura atualmente contém uma mistura de fibras mio únicas vivas, que são estruturas tubulares longas e brilhantes, fibras hipercontraídas, que são escuras e curtas e detritos. Agora, usando a pipeta de tamanho pequeno, transfira as fibras MYOP vivas para um novo prato pré-vermifugado. Manuseie cada fibra de miopia individualmente.Em vez de transferir a maior parte das fibras de myo de uma só vez, se necessário, retorne o prato a uma incubadora por 10 a 15 minutos para reequilibrar o meio. Transfira as fibras de miop mais duas vezes para remover todas as fibras de miopila mortas e detritos até o final de pelo menos três lavagens consecutivas. Apenas fibras de myo vivas individuais devem permanecer no prato para cultura ou análise a jusante.As fibras vivas têm uma morfologia longa. Pelo contrário, as fibras hipercontraídas são mais curtas e espessas. Agora, incube as fibras de mio isoladas no meio de lavagem por pelo menos uma hora antes de mudar para o meio de cultura.Em uma nova placa pré-quente, o meio alto permitirá a ativação de células satélites para culturas longas. Matrigel pode ser apropriado independentemente do meio escolhido. Troque-o a cada dois dias no momento do isolamento.As células satélites em cada MyFi aparecem como pequenas protuberâncias na superfície da miofibra quando observadas sob um microscópio óptico. Se as fibras miogênicas forem mantidas em meio rico em soro por longos períodos de tempo, tubos miométricos totalmente diferenciados são predominantemente observados na cultura. As cepas de camundongos repórteres, como a linha MIFF five Cree Rosa YFP, são ferramentas ideais para estudar o processo de regeneração muscular.Os tubos Myo derivados de uma cultura de fibra Miff five Cree Rosa YFP expressaram o MIFF five repórter YFP. Isso sugere que a regeneração muscular requer a ativação do Miff cinco. A cepa de camundongo tomate PAX seven Cree TD é outra linha de repórter.O sinal de fluorescência do tomate TD é detectado apenas por células satélites, enquanto os núcleos myON são claramente negativos. Isso sugere que o fator de transcrição PAX seven é expresso exclusivamente por células-tronco musculares e não por sua progênie diferenciada. As fibras Myo e suas células satélites associadas podem ser fixadas a jusante.Imunofluorescência PAC sete células satélites positivas para myo D positivas são classicamente consideradas progenitoras musculares comprometidas proliferativas. Eles completarão o programa de diferenciação REGULANDO NEGATIVAMENTE o PAC sete enquanto mantêm minha expressão de OD ou retornarão à quiescência regulando negativamente meu OD e mantendo a expressão de PAC sete. A técnica de isolamento de fibra única tem a característica única de preservar a associação fisiológica de células satélites de miofibra.A etapa mais crítica deste procedimento é a dissecção do músculo EDL do tendão ao tendão. A manipulação mínima da fibra também permite a preservação da integridade e viabilidade da fibra. O isolamento bem-sucedido de fibras miopas únicas depende de vários fatores, como atividade colágena, condição muscular ou idade.Mais importante ainda, o isolamento do músculo de tendão a tendão permite manter a integridade da fibra. Além disso, a manipulação mínima da fibra durante todo o procedimento permite maior taxa de sobrevivência.

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Biology

Biologia

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