Name: Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a realizar imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas usando microscopia confocal de alta resolução. Este método permite monitorar dinamicamente o controle de qualidade da dobra proteica e os mecanismos de proteostase.

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1. Preparativos levedura <ol><li> Transformar as estirpes de levedura com um plasmídeo contendo uma cassete de GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ts). </li><li> Crescer levedura em meio sintético contendo rafinose a 2% durante 24 horas e diluiu-se para trás a 2% de galactose para meios contendo 16 hr ou O / N. Incube as células a 30 ° C sob agitação a 200 rpm. </li><li> Na manhã seguinte, dilui-se a estirpe de consulta a OD 600 = 0,2. Agita-se durante 4-6 horas a 30 ° C (200 rpm) até a cultura atingir DO600 = 0,8-1,0. </li><li> Para reprimir a expressão (assim como para monitorar apenas a piscina já traduzido e dobrado de GFP-Ubc9 ts), meios de comunicação de mudança para meio sintético suplementado com 2% de glicose (SD) 30 min antes da imagem. </li><li> Tratamento - choque térmico das células durante 20 min a 37 ° C para induzir a misfolding, ou continuamente em microscópio incubadora para seguir a agregação de proteínas em condições de choque térmico. Nota - se você estiver usando o microscópio em qualquer temperatura acima de RT, pré-aqueça o for cerca de 2 horas para equilibrar a temperatura ao longo do corpo do microscópio e dos objectivos (ver abaixo). </li></ol> 2. Placa \ Preparações slides <ol><li> Escolha apropriada na placa. A principal consideração é a capacidade de manter o foco durante a aquisição de imagem. Os seguintes pontos são fundamentais para a formação de imagens 4D e não para lapsos de tempo de imagem 2D ou 3D. <ol><li> Multiple poços de placa do fundo dos poços diferentes pode não ser homogénea (isto é, os poços serão em diferentes alturas em relação ao objectivo). Isto irá tornar mais difícil manter o foco em pontos xy e pontos de tempo, independentemente da técnica de auto-focagem sendo usado. </li><li> Material de slide: vidro vs plástico. Lâminas de vidro de fundo são mais z-homogênea entre os poços, mas são mais caros. </li><li> Espessura da parte inferior do prato: geralmente usamos lamela-bottom placas índice de 1,5, mas um índice também é aceitável dependendo do objetivo. </li></ol></li><li> Cover inferior da placa deslizante \ com ConA (0,25 mg / ml) durante 10 min. ConA é usado na adesão de células à corrediça, o que permite seguir uma única célula ao longo do tempo. </li><li> Remover ConA e incubar a lâmina em uma capa química, de modo que o excesso de ConA vai evaporar. </li><li> Ul placa 200 de amostra de levedura (DO600 = 0,5) para o ConAed bem. </li><li> Incubar durante 15 min, de modo a permitir células aderem à superfície da placa. </li><li> Extrai-se a meio e lavar três vezes com meio de novo para obter uma camada de células. Nota: se um lapso de tempo longo é planeado, as células semente de baixa densidade, de modo que novos brotos não vai encher e interrompem a região de interesse. </li></ol> 3. Preparativos microscópio <ol><li> Nós usamos um microscópio Nikon A1Rsi confocal com algumas modificações não-padrão. Para imagens levedura que usar até 4 lasers (405 nm, 50 mW de laser CUBE; 457-514 nm, 65 mW Argon Ion laser; 561 nm, 50 mW Sapphire laser, e 640 nm, 40 mW de laser CUBE), e até 4 PMTs equipados comfiltros. A maioria de nossa imagem é feito com um conjunto de filtros verde para EGFP e um conjunto de filtros vermelho para mCherry e tdTomato. Com GFP e mCherry há quase bleedthrough não, portanto, muitas vezes usamos a digitalização simultânea. No entanto, a linha de varrimento também pode ser utilizado para prevenir bleedthrough quando ela ocorrer. Nossa confocal está também equipado com um estágio Piezo PInano (MCL), que pode fazer 3 etapas mseg em z, permitindo-z 2-3 pilhas (30-50 secções) por segundo. O sistema também tem um detector espectral, o foco perfeito (laser offset), e dois scanners - um scanner galvano e um scanner de ressonância. </li><li> Escolha objetivo adequado. Principais considerações: <ol><li> Água / objectiva de óleo / ar: a consideração principal é o índice de refracção do meio de imagiologia vs o meio da amostra. <ol><li> Objetivas vantagens de petróleo: <ol><li> Objetivos do petróleo pode ter maiores aberturas numéricas (óleo leve quebra mais do que água, e, portanto, mais fótons voltar para o objectivo). Objetivos do petróleo pode ter-sea NA 1,49, em comparação com 1,27 para a água. (No entanto, este não é realmente uma enorme diferença na resolução). </li><li> O índice de refracção do óleo corresponde ao índice de refracção do vidro, pelo que não são perdidos fotões indo a partir da amostra, através do vidro, para o objectivo. (Nota - escolheu um óleo de imersão que tem um índice de refração que é adequado para o seu objetivo e sua lamela). </li><li> Óleo permite livre de problemas longo de tempo, uma vez que os lapsos não evapora. </li></ol> Objetivo desvantagens de petróleo: <ol><li> Quanto maior for a resolução activado pelo aumento do NA dos objectivos do petróleo se degrada rapidamente a luz tem que viajar através de um meio aquoso (tal como uma célula). </li><li> Imagens normalmente têm aberrações esféricas e mais uma &quot;esticada&quot; efeito em 3D. </li><li> O óleo é pegajoso, confuso, e um perigo para a objetivos. </li></ol></li><li> Objetivas vantagens de água <ol><li> A célula é aquosa, portanto, há menos distorções na Z, And a resolução permanece elevada em profundidade uma amostra aquosa. </li><li> Limpe e amigável. Água desvantagens objectivas: evapora rapidamente, portanto, não adequados para filmes longos sem arranjos especiais que estão sendo feitos para bombear a água de forma contínua para o objetivo. </li></ol></li><li> Vantagens objectivas ar: 1. Nenhum material é perdido / evapora durante a aquisição de múltiplos pontos ou um filme longo. 2. Limpe e amigável. Desvantagem: baixa resolução e sensibilidade do sinal baixo. </li></ol></li><li> Temperatura ambiente e incubadora: temperatura mudança afeta propriedades da matéria, e em sistemas delicados muda o foco. A temperatura deve ser ajustada antes de escolher os pontos de aquisição. Alterando a temperatura durante a aquisição de imagem e vai perturbar irá resultar na perda de focagem. Deixamos que o nosso sistema de microscópio equilibrar durante 2 h à temperatura desejada antes de imagiologia. </li><li> Colares de correção: objetivos Muitos vêm com um anel de correção possibilitandoo objetivo de ser ajustada para uma dada espessura tampa de deslizamento. Recomendamos ajustar o colar correção, enquanto usando partículas fluorescentes para visualizar a função de propagação do ponto. Isso irá garantir configurações corretas para cada amostra. </li><li> Porta-amostras estáveis: descobrimos que a maioria dos titulares de amostras disponíveis comercialmente são a parte mais fraca do microscópio. Elas são muitas vezes vacilante e não em linha reta. Isso é um desastre para a alta-resolução, com vários pontos de imagens 4D. Nós projetamos nossos próprios porta-amostras que são retas e encaixar bem no palco. Eles também podem ser aparafusados ​​para baixo, quando necessário. </li><li> Multi-ponto de aquisição: o nosso sistema de imagem é equipado com o &quot;Perfect foco&quot; Nikon sistema, que é basicamente uma base de laser mecanismo de auto-foco. No entanto, de auto-focagem não é necessariamente necessário, com formação de imagens 4D, em especial, se o sistema não se desvia muito. </li></ol></li></ol> 4. Imagem <ol><li> Ligue o sistema: lasers, palco, controlador, câmera e compusoftware ter. </li><li> Colocar a placa no suporte palco, devidamente protegidas e estabilizada. </li><li> Usar porta olho para determinar a localização ea orientação de levedura. </li><li> Usando campo claro, avaliar a saúde e viabilidade celular de acordo com a forma e textura. </li><li> Ligar a luz de epifluorescência de acordo com o fluoróforo relevante (por exemplo FITC filtro para GFP), e concentrar-se em células que apresentam o fenótipo que está sujeita a sua pesquisa. As células que são altamente fluorescentes em mais do que um comprimento de onda podem ser mortos e, por conseguinte, autofluorescente. Nós visualizar o núcleo com um fluoróforo tdTomato fundido com um NLS sinal SV40 (NLS-TFP). TFP é duas vezes o tamanho da GFP, e é, portanto, acima do limite de difusão do núcleo, pelo que funciona muito bem como um marcador nuclear. Podemos também excitam TFP com um laser (488 nm), simultaneamente, como verde GFP, mas recolher as emissões de verde e vermelho em dois PMTs separados para resolução espectral. </li><li> Ajuste as seguintes configurações para minimizar o ruídoe supersaturação: <ol><li> Potência do laser - fotodegradação e fototoxicidade vs brilho da imagem deve ser considerada. </li><li> Ganho: afeta a sensibilidade da câmera, portanto, relação sinal-ruído. </li><li> Pinhole diâmetro - deve ser ajustada de acordo com o laser com o comprimento de onda mais curto. O diâmetro do furo de pino determina a espessura (altura) da secção óptica trabalhada. Assim, a abertura do buraco coletar mais luz (deixe em mais fótons), mas vai diminuir resolução em z (menos confocalidade). </li></ol></li><li> Dicas úteis: <ol><li> Se fluoróforos emitem comprimentos de onda diferentes congruente, use o recurso Detector espectral que permite a escolha de filtros virtuais. Tenha em mente que os detectores espectrais são menos sensíveis que PMTs regulares. </li><li> Se fluoróforos diferentes estão animados com o mesmo laser, usar o recurso de verificação de linha. </li><li> Um scanner Galvano permite mais sensibilidade, mas tem um risco maior de fotodegradação. Um scanner de ressonância permite um mais rápidoQUISIÇÃO, diminuindo assim o risco de fotodegradação, mas é menos sensível. </li><li> Uma média de entre 2 e 16 imagens, aumenta a relação sinal-ruído, mas torna mais lenta a aquisição e, naturalmente, implica uma maior exposição da amostra para o laser. </li><li> Duração de aquisição depende da questão biológica (por exemplo, formação e JUNQ IPOD leva ~ 2 horas). Temos fotografada fermento com o scanner de ressonância para até 30 h em 3D lapso de tempo. </li><li> Time Lapse intervalos menores-intervalos irá criar um filme mais coerente, mas pode causar foto de branqueamento e, portanto, perda de sinal. </li></ol></li></ol>

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<li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263(1999).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nossas intuições sobre processos bioquímicos derivar a partir de experiências de bancada de topo em que uma solução bem misturada dos reagentes e produtos é permitido para atingir o equilíbrio num copo. Em tal situação, a concentração de uma espécie química dadas pode ser expresso como um número único, que é a razão entre a quantidade molar de moléculas a um volume macroscópico. Muito do que sabemos sobre a estrutura e função das proteínas deriva da utilização de métodos que refletem o clássico, imagem reação em massa: borrões ocidentais, centrifugações e medições espectrofotométricas realizadas em extratos de homogeneizados de populações inteiras de células. Como a tecnologia que usamos para olhar para as células sob a ampliação melhora aos trancos e barrancos, torna-se cada vez mais claro que as condições em que a maioria das reações bioquímicas ocorrem in vivo ter apenas a menor semelhança aos do cenário clássico de bancada. Não só é o interior da cella densamente ambiente, em que os efeitos aglomeração altera substancialmente as actividades dos vários reagentes, também é o oposto de bem misturado. Isso explica a disparidade frequente entre in vitro e in vivo em eficiências de uma grande variedade de reacções macromoleculares complexos. Em nenhum lugar são intuições decorrentes de experimentos in vitro clássica bioquímicos mais propensas a enganar como em questões referentes ao vivo em dobrar, misfolding e agregação de proteínas. Considerando que os estudos de química de proteínas em reações em massa pode tratar a questão de dobrar para uma determinada proteína como um simples sim ou não questão, qualquer tentativa de acompanhar a dinâmica de populações inteiras de macromoléculas em uma célula viva deve ser sensível a toda a distribuição de possíveis resultados conformacionais disponíveis para uma cadeia polipeptídica, e em particular para o risco de misfolding e agregação. Por exemplo, podemos examinar uma célula ly grossosate a agregação de uma proteína de transferência de western, e determinar que a proteína é essencialmente insolúvel e não ubiquitinated. No entanto, em células vivas de um discreto sub-população da proteína, é difícil detectar quando a média sobre muitas células, podem ser solúveis e ubiquitinated num compartimento especial, quando a concentração local das espécies é extremamente elevado. O último caso pode ter consequências mais importantes para a viabilidade da célula do que a maior massa sub-população. Além disso, enquanto chaperones exibir uma variedade de comportamentos e funções pleiotrópicas, in vitro, torna-se evidente que, na célula suas funções discretas são espacialmente e temporalmente limitado. No paradigma emergente para a compreensão da bioquímica, a concentração se torna uma propriedade de cada variável específica nano-ambiente na célula, e os acontecimentos moleculares que estão na base dos processos biológicos devem ser ensaiadas não apenas no tempo, mas também em space. A imagiologia 4D abordagem aqui apresentada permite a modelagem sensível do enrolamento incorrecto da proteína em células vivas, no entanto, pode ser usado para estudar qualquer número de outros processos biológicos e de como eles são regulados no espaço, o tempo, e na sequência de alterações das condições ambientais. Neste trabalho, o uso do sensor Ubc9 ts dobrável, que demonstra eficazmente as fases e as opções para se lidar com o início da agregação de proteínas no citosol. Além de ilustrar a biologia celular de agregação de controlo de qualidade, esta abordagem pode servir como uma ferramenta poderosa para decifrar o efeito das perturbações específicas ou mutações genéticas em proteostasis (por exemplo Ubc9 ts podem ser usados ​​para medir a proteína de stress de dobragem em resposta à oxidação, a expressão de um agregado tóxico, ou mutações na via de controlo de qualidade). Formação de imagens 4D também é essencial para determinar com precisão a localização de proteínas ou de co-localização entre duas proteínas diferentess, e para a detecção de fenômenos que talvez ser transitórios, mas importante. Por exemplo, especialmente em um pequeno organismo esférico, tais como levedura, que pode parecer ser o caso de que uma estrutura ou agregado tem localização juxtanuclear, enquanto que imagens 4D pode revelar que este é simplesmente um artefacto do ângulo de inspecção. No experimento de exemplo apresenta-se aqui, que demonstram a utilização de um modelo de proteína misfolded, Ubc9 ts, a seguir a agregação de controle de qualidade ao longo do tempo e espaço no citosol. À temperatura permissiva, Ubc9 ts é dobrada e difundida no núcleo e citosol. Após induzida pelo calor misfolding, inicialmente forma rápida difusão de focos pequenos agregados de estresse que são processados ​​para a degradação proteosomal. Quando o proteassoma é parcialmente inibida, estes focos de stress são convertidos em JUNQ e inclusões IPOD ao longo de cerca de 2 horas. Se degradação mediada por ubiquitina não está disponível como uma opção de controlo de qualidade, Ubc9 ts é imediatamente redirecionado para a inclusão IPOD para agregação de proteção. Essas ferramentas oferecem oportunidades incríveis para descobrir novos fatores genéticos envolvidos na agregação de controle de qualidade, e explorar a sua regulação espacial e temporal na célula.

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>com A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fundo de vidro</td><td>ibidi</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4D Fluorescência Imaging de Agregação de Proteínas Filmes 3D confocais foram adquiridos usando um microscópio Nikon A1R-si equipado com um estágio PInano Piezo (MCL), usando uma objetiva de água 60x NA 1,27, fatias de 0,3 mícron, 0,5% da potência do laser (de 65 mW 488 laser e 50 mW 561 laser). z-stacks foram adquiridos a cada 5 min por 90 min. Cada série z foi adquirida com tamanho de passo de 0,5 mícron e 30 passos totais. O processamento das imagens foi realizado por meio do software NIS-Elements.</td></tr></tbody></table>

formação de imagens 4d de agregação de proteínas em células vivas

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Uma das tarefas-chave de qualquer célula viva é manter a dobradura adequada de proteínas recém-sintetizadas em face da constante mudança das condições ambientais e de um ambiente intracelular que é hermeticamente embalados, pegajoso, e perigosos para a estabilidade da proteína 1. A capacidade de equilibrar dinamicamente a produção de proteínas, dobradura e degradação exige altamente especializado de máquinas de controle de qualidade, cuja absoluta necessidade é observada melhor quando avarias. Doenças como a esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, de Parkinson, e certas formas de fibrose cística tem um link direto para proteínas componentes de qualidade dobráveis ​​de controle 2 e, portanto, o futuro desenvolvimento terapêutico requer um conhecimento básico de processos subjacentes. Nosso desafio experimental é entender como as células integram sinais de danos e de encontrar respostas que são adaptados às diversas circunstâncias. A principal razão pela qual misfolding proteína representa um thre existencialem que a célula é a propensão de proteínas incorrectamente dobradas para agregado, causando assim uma perturbação global do aglomerado e delicado ambiente intracelular de dobragem 1. A saúde dobrar, ou &quot;proteostasis&quot;, do proteoma celular é mantida, mesmo sob a pressão do envelhecimento, estresse e dano oxidativo, pela ação coordenada de diferentes unidades mecanicistas em um elaborado sistema de controle de qualidade 3,4. A maquinaria especializada de chaperonas moleculares podem ligar polipeptídeos não nativos e promover a sua dobragem para o estado nativo 1, orientá-las para a degradação pelo sistema ubiquitina-proteassoma 5, ou encaminhá-los para inclusões de agregação de protecção 6-9. Em eucariotas, a agregação de carga citosólica de controlo de qualidade é partilhado entre dois compartimentos 8-10: o compartimento de controle de qualidade juxtanuclear (JUNQ) e do depósito de proteína insolúvel (IPOD) (Figura 1 - modelo).Proteínas que são ubiquitinadas pelo mecanismo de controlo de qualidade de proteínas de dobragem são entregues ao JUNQ, onde eles são tratados para degradação pelo proteassoma. Proteínas deformadas que não são ubiquitinadas são desviadas para o iPod, onde eles estão ativamente agregadas em um compartimento de proteção. Até este ponto, o paradigma metodológico de live-célula de microscopia de fluorescência tem sido largamente às proteínas de etiqueta e rastrear suas localizações na célula específica em tempo de pontos e, geralmente, em duas dimensões. Como as novas tecnologias começaram a conceder experimentadores acesso sem precedentes à escala submicron em células vivas, a arquitetura dinâmica do citosol veio vista como uma fronteira novo e desafiador para a caracterização experimental. Apresenta-se um método para monitorizar rapidamente as distribuições espaciais em 3D de múltiplas proteínas marcadas com fluorescência no citosol de leveduras ao longo do tempo. Timelapse 3D (imagens 4D) não é apenas um desafio técnico; ratoela, também facilita uma mudança dramática na estrutura conceitual usada para analisar a estrutura celular. Utilizamos uma proteína citosólica do sensor de dobragem em levedura viva para visualizar destinos diferentes para proteínas deformadas no controle de qualidade celular agregação, utilizando imagiologia 4D rápida fluorescente. O mutante sensível à temperatura da proteína Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) é extremamente eficaz, tanto como um sensor de proteostasis celular, e um modelo fisiológico para controle de rastreamento agregação qualidade. Tal como acontece com a maioria das proteínas ts, ts Ubc9 é totalmente dobrada e funcional, a temperaturas permissivas, devido à activas chaperones celulares. Acima de 30 ° C, ou quando a célula enfrenta estresse misfolding, Ubc9 misfolds ts e segue o destino de uma proteína nativa globular que foi misfolded devido a mutação, a desnaturação pelo calor, ou o dano oxidativo. Ao fundir a GFP ou fluoróforos outros, que podem ser rastreados em 3D, como se forma stress Foci, ou é didirigido a JUNQ ou iPod.

<html><img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Figura 1. Modelo:. Sub-celular compartimentalização de proteínas deformadas máquinas controle de qualidade direciona proteínas deformadas em compartimentos distintos, com funções distintas: proteínas solúveis, alvo de degradação, sofrem ubiquitinação-poli e são enviados para o XTA-N uclear Ju Q ualidade compartimento de controle (JUNQ ). Proteínas insolúveis que não pode ser ubiquitinadas são enviados para o sequestro de proteção para o I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), ao lado do vacúolo, onde se submetem a agregação ativa. es.jpg &quot;src =&quot; files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg / &quot;/&gt; Figura 2. Misfolding modelagem proteína com GFP-Ubc9 ts. Em condições normais, GFP-Ubc9 ts (verde) é nativamente dobrado, e está localizada difusamente no núcleo e citoplasma. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). Expressão de Ubc9 ts foi desligado pela adição de 2% de glicose antes de imagem em todos os experimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol><li> Após a mudança de temperatura para 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (verde) é misfolded e forma Foci stress citosólica. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). </li><li> Após a recuperação do choque térmico a 23 ° C, o termicamente desnaturadas GFP-Ubc9 ts é degradada, tal como indicado pela diminuição do nível de fluorescência. </li><li> Após a mudança de temperatura para 37 C e a inibição do proteassoma ° com 80 Mm MG132, GFP-U<html> Bc9 ts é misfolded e transformado em JUNQ e inclusões IPOD. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). </li><li> Após a mudança de temperatura para 37 ° C e a inibição de ubiquitinação, GFP-Ubc9 ts é misfolded e processados ​​para a inclusão IPOD. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). A Protease Ubiquitina 4 (Ubp4) é sobre-expresso para bloquear Ubc9 ubiquitinação ts. </li></ol><img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Figura 3. Lapso de tempo de formação e JUNQ IPOD. Ao mudança de temperatura para 37 ° C e a inibição de proteassoma com 80 Mm MG132, GFP-Ubc9 Foci stress ts são processadas em JUNQ e inclusões IPOD. O núcleo é marcado por NLS-TFP (vermelho). Imagens 3D foram adquiridas em intervalos de 4 minutos. (Veja também o filme 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura.

Viabilidade celular depende de uma gestão eficiente e oportuna de misfolding proteína. Descrevemos aqui um método para a visualização dos diferentes destinos potenciais de uma proteína misfolded: redobramento, degradação, ou sequestração de inclusões. Nós demonstramos a utilização de um sensor de dobragem, Ubc9<sup&gt; Ts</sup&gt;, Por proteostasis monitoramento e controle de qualidade em agregação de células vivas usando microscopia 4D.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Este sistema experimental adquire imagens de fluorescência 3D de alta resolução em células vivas para monitorar e testar a dinâmica espaço-temporal do controle de qualidade do dobramento de proteínas. Primeiro, prepare as células para estudar os complexos de proteínas que se movem rapidamente. Adquira uma pilha Z de imagens em alta resolução Z.Em seguida, adquira uma série temporal composta por Zacks em seguida, renderize as imagens resultantes em um filme 3D e analise as imagens resultantes. Em última análise, a imagem de quatro D permite rastrear os fenômenos dinâmicos e transitórios nas células em diferentes condições. A principal vantagem da imagem de quatro D sobre os métodos existentes, como microscopia de campo amplo e lapso de tempo, é que ela nos permite visualizar simultaneamente a dinâmica e a distribuição temporal espacial de toda a população de proteínas na célula em alta resolução.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular de agregação de proteínas, controle de qualidade e dobramento de proteínas. Estes são processos altamente dinâmicos e transitórios. Portanto, sem alta resolução temporal e espacial, muitos deles seriam impossíveis de observar.Esse método pode fornecer informações sobre o controle de qualidade da agregação. Também pode revolucionar o estudo da interação e dinâmica das proteínas. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque fazer filmes 3D de proteínas marcadas endogenamente ou de baixa expressão requer a estabilidade do sistema.Alta sensibilidade e baixo fotobranqueamento Transforme as cepas de levedura com um plasmídeo de expressão para uma proteína de fusão de Fluor ligada a uma proteína sensor de dobramento citosólico, como o mutante sensível à temperatura do UBC nove. Cultive a levedura em meio sintético contendo 2% de rafinose por 24 horas e, em seguida, dilua novamente para 2% de meio contendo galactose durante a noite, dilua a cepa de consulta para um OD 600 de cerca de 0,2 e cultive por quatro a seis horas até que a cultura atinja um OD 600 entre 0,8 e 1,0 30 minutos antes da imagem. Reprima a expressão com meios sintéticos suplementados com 2% de glicose.Esta etapa permite o monitoramento apenas do pool já traduzido e dobrado da proteína expressa. Agora choque térmico as células por 20 minutos a 37 graus Celsius. Para induzir o dobramento incorreto, selecione uma placa apropriada para manter o foco durante a aquisição de quatro D.Imaging.Cubra o fundo do prato com 0,25 miligramas por mililitro con A por 10 minutos. O Con A é usado para aderir as células ao slide, o que permite seguir uma única célula ao longo do tempo. Aspire o con A e a seta, seque a placa em uma capa química.Em seguida, adicione 200 microlitros de amostra de fermento. Incube por 15 minutos para permitir que as células adiram à placa. Realize três lavagens com meio para obter uma única camada de células para imagens de levedura.Use um microscópio confocal com algumas modificações não padronizadas, conforme detalhado no texto que acompanha. Este sistema de imagem de levedura usa até quatro lasers e até quatro tubos fotomultiplicadores equipados com filtros. A maioria de nossas imagens é feita com o conjunto de filtros verdes para EGFP e um conjunto de filtros vermelhos para cereja e tomate TD.Equipe também o confocal com um sistema de foco perfeito de estágio pi nano pizo e os scanners galvan O e ressonante equilibram o sistema de microscópio até que a temperatura desejada seja atingida. Antes de fazer imagens com base no índice de refração do meio de imagem versus o meio da amostra, selecione a água, óleo ou ar objetivo apropriado. Ajuste o colar de correção de acordo com a espessura da placa.Limpe a objetiva usando lenços umedecidos e etanol. Limpe também a lâmina que transporta a amostra. Coloque a placa no suporte do stage com segurança e verifique a estabilidade do sample suporte para garantir as configurações corretas para cada sample.Ajuste o colar de correção enquanto usa contas fluorescentes para visualizar a função de propagação do ponto com a porta do olho. Determine a localização e orientação do fermento. Em seguida, ligue a luz epifluorescente necessária e concentre-se nas células que exibem o fenótipo relevante.Em seguida, usando o campo claro, avalie a saúde e a viabilidade celular de acordo com a forma e a textura para avaliações de viabilidade celular. Visualize o núcleo com um flúor da flora de tomate TD fundido a um sinal SV 40 e LS. A PTF tem o dobro do tamanho da GFP.Por estar acima do limite de difusão do núcleo, funciona muito bem como marcador nuclear. Excite o TFP com um laser verde de 4 88 nanômetros simultaneamente como GFP, mas colete as emissões verdes e vermelhas em dois PMTs separados para resolução espectral. Para minimizar o ruído e a saturação, ajuste a potência do laser e o diâmetro do orifício conforme detalhado no manuscrito anexo.Se diferentes forças de flora emitirem comprimento de onda congruente, use o recurso de detector espectral, que permite a escolha de filtros virtuais para adquirir imagens de lapso de tempo de acordo com o projeto experimental, a proteína mal dobrada U BBC nove Ts fornece um sistema modelo para seguir o controle de qualidade de agregação ao longo do tempo e do espaço. No citosol à temperatura permissiva, UBC nove Ts é dobrado e difuso no núcleo e citosol após o desdobramento induzido pelo calor. Inicialmente, forma pequenos pontos agregados citosólicos de rápida difusão que são processados para degradação proteassômica.Quando o proteassoma é parcialmente inibido, esses pontos são convertidos em lixo e inclusões de iPod ao longo de cerca de duas horas. Em condições normais, GFP UBC nove Ts é dobrado nativamente e está localizado difusamente no citosol do núcleo, como visto aqui em verde. Após a mudança de temperatura para 37 graus Celsius, a proteína de fusão é dobrada incorretamente e forma agregados de pontos citosólicos após a recuperação do choque térmico a 23 graus Celsius.Os nove Ts de G-F-P-U-B-C termicamente desnaturados são degradados conforme indicado pela diminuição do nível de fluorescência. O núcleo é marcado em vermelho por N-L-S-T-F-P. Quando a mudança de temperatura para 37 graus Celsius é combinada com a inibição do proteassoma, os nove Ts do GFP são dobrados incorretamente e processados em lixo e inclusões de iPod.Aqui, a ubiquitina protease quatro é superexpressa para bloquear a inibição da ubiquitinação da ubiquitinação, juntamente com a mudança de temperatura, resulta no processamento de G-F-P-U-B-C nove Ts na inclusão do iPod. Essas imagens de lapso de tempo adquiridas em intervalos de quatro minutos retratam claramente a dinâmica da formação de lixo e iPod. Essa técnica pode ser usada para monitorar a proteostase celular ao longo do tempo usando UBC nove Ts como um sensor de dobramento.A imagem quatro D também pode ser feita em outros sistemas modelo, como células de mamíferos e C elegance. A imagem Four D também permite a visão de outros eventos sutis no controle de qualidade da agregação, como a formação e a dinâmica de focos de tensão de agregados solúveis e a entrega de agregados aos compartimentos de lixo e iPod.

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de agregação de proteínas baseado em células usando inibidores de proteassoma, que bloqueiam a atividade do proteassoma, impedindo que proteínas mutantes mal dobradas, fundidas a um rótulo fluorescente, sofram degradação proteassômica dependente de ubiquitina, levando ao seu acúmulo dentro do citoplasma celular. Os agregados proteicos são então visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência.

Ensaio de Formação de Agregados de Proteínas: Um Método para Detectar e Quantificar a Agregação de Proteínas em Células Cultivadas após Indução por Inibidor de Proteassoma

Este vídeo demonstra imagens e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de Drosophila geneticamente modificados. Os cérebros são fixados, lavados e tratados com um agente antidesbotamento antes da montagem. As imagens são capturadas usando um microscópio confocal e quantificadas para observar a transmissão de agregados de proteínas mutantes.

Imagem e quantificação de agregados de proteínas em cérebros de drosófilas geneticamente modificadas

Informações espaço-temporais sobre proteínas dinâmicas dentro de células vivas são cruciais para a compreensão da biologia. Um tipo de microscopia de super-resolução chamada microscopia de iluminação rápida estruturada em 3D (f3D-SIM) revela informações únicas sobre o anel Z citocinético em bactérias: tanto sua aparência semelhante a um grânulo quanto a dinâmica rápida do FtsZ dentro do anel.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Nós descrevemos um método para quantificar a agregação de misfolded proteínas. Nossos detalhes de protocolo Lentivirus induzida por geração de linha celular estável, imagem latente confocal automatizada e análise de imagens de agregados de proteínas. Como uma aplicação ilustrativa, estudamos o efeito de pequenas moléculas na promoção da SOD1 agregação de maneira tempo e dose-dependente.

Desenvolvimento de ensaio para quantificação de conteúdo elevado de Sod1 proteína mutante formação agregada em células vivas

Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.

Monitoramento de transmissão de celular para celular da proteína príon como agregados em Drosophila Melanogaster.

Nós desenvolvemos um fluxo de trabalho simples e adaptável para extrair dados quantitativos de estudos biológicos fluorescência-imagem latente-à base de célula de agregação de proteínas e autophagic fluxo no sistema nervoso central de Drosophila modelos de Neurodegeneração.

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

4D microscopia de levedura

Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

Aqui, é apresentado um método para a análise da cinética de agregação de proteínas no nematode Caenorhabditis elegans. Animais de uma população sincronizada por idade são imagens em diferentes momentos, seguidos pela contagem de inclusão semiatomada no CellProfiler e adaptação a um modelo matemático em Amilafit.

Monitorando Cinética de Agregação de Proteínas In Vivo usando Contagem Automatizada de Inclusão em Elegans Caenorhabditis

Este protocolo descreve a marcação e a injeção de fluorescência personalizadas baseadas em anticorpos em embriões iniciais de Drosophila para permitir imagens vivas de proteínas de baixa abundância ou modificações pós-traducionais que são difíceis de detectar usando abordagens tradicionais de GFP/mCherry-tag.

Visualizando Proteínas de Baixa Abundância e Modificações Pós-Traducionais em Embriões Vivos de Drosophila Via Injeção de Anticorpos Fluorescentes

Aprenda a realizar imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas usando microscopia confocal de alta resolução. Este método permite monitorar dinamicamente o controle de qualidade da dobra proteica e os mecanismos de proteostase.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

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