Name: Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em Milho rayado fino vírus Partículas semelhantes a vírus produzidas em Nicotiana benthamiana Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a analisar a acessibilidade de resíduos de cisteína em partículas semelhantes a vírus do Milho rayado fino vírus produzidas em Nicotiana benthamiana. Este método permite o cross-linking de peptídeos para aplicações em nanotecnologia.

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1. A inoculação do vírus e purificação de VLPs Plantas de Nicotiana benthamiana <ol><li> Produzir seladas T7-RNA transcritos a partir de Potato virus X (PVX) baseados em plasmídeos vector transportando MRFV de tipo selvagem (wt) e da proteína de revestimento Cys-mutada (CP) genes 12, utilizando T7-mMessage Ambion de mMachine Kit. </li><li> Para cada reacção de transcrição de T7, inocular duas folhas completamente expandidas de N. benthamiana com 10 ul de reacções e incuba-se as plantas durante 10 dias em estufa, a uma humidade de 60% ​​durante 16 h com luz (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 horas escuro a 20 ° C. </li><li> Harves t N. benthamiana infectadas por vírus folhas 10 dias após a inoculação (dpi), pesar o tecido vegetal (50 gramas) e colocar em gelo. </li><li> Homogeneizar o material de planta em um misturador em presença de 100 ml de uma solução gelada de 0,5 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5 (o uso de 2 ml de tampão por grama de tecido de planta). </li><li> Filtrar homogenato através de 3 camadas de cheeseclOTH e clarificar através de centrifugação a 27.000 xg durante 30 min. Transferir o sobrenadante em um cilindro refrigerado graduada, medir o volume, e depois transferir para um copo gelado estéril. Descartar o sedimento. </li><li> Processar-se o sobrenadante por adição de polietileno glicol 8000 a 10% (PEG 8000), agita-se durante 15 min a 4 ° C, e incubar durante mais 45 minutos a 4 ° C para precipitar as partículas semelhantes a vírus (VLPs) de PEG-matriz. </li><li> Centrifugar a amostra a 27.000 xg durante 20 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante. </li><li> Processar o sedimento, adicionando 8 ml de 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5, contendo 2% de Triton X-100. Redemoinho tubos da centrífuga bem para liberar o sedimento. Transferir o sedimento e tampão para um copo de gelado estéril. Enxaguar imediatamente os tubos com 2 ml do mesmo tampão e adicionar ao copo. Agita-se a suspensão a 4 ° C até que os grânulos são dissolvidos (em geral 1 hora). </li><li> Clarificar por centrifugação durante 5 min a 27.000 xg, rejeitar o sedimento, e process o sobrenadante por centrifugação a 140000 xg durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de 0,05 M de Na-citrato, pH 5,5 e colocar a suspensão no topo de um gradiente de sacarose 10-40% feita em 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5,5. </li><li> Centrifuga-se o gradiente durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C. </li><li> Brilhar uma luz sobre o topo do tubo da centrífuga e recolher a banda de dispersão da luz superior a 4 cm a partir do topo do tubo, diluiu-se com 0,05 M de tampão de Na-citrato, pH 5.5, e centrifuga-se durante 3 horas a 140.000 xg a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 0,5 ml de água estéril e armazenar a 4 ° C durante até seis meses. </li><li> Quantificar a concentração de VLPs por realização de um ensaio de proteína de Bradford. O rendimento de VLPs está entre 1 e 3 ng / g de tecido da planta. </li></ol> 2. Fluoresceína-5-maleimida rotulagem Reações de VLP <ol><li> Prepara-se uma solução 1 mM de f luoresceina-5-maleimida (427,37 g / mole) em 50 mM de sódio phosphate tampão, pH 7,0, 1 mM de EDTA. Misturar utilizando o vórtice e verificar dissolução completa. Proteger o tubo de luz, utilizando uma folha de alumínio. </li><li> Adicionar fluoresceína-5-maleimida de VLPs produzidas no passo 1 e misturar. Usar um excesso de 25 vezes molar de f luoresceina-5-maleimida para a quantidade molar de sulfidrilos. Geralmente, utilizar-se 30 ul de partículas VLP, na concentração de 1 ug / ul e 60 ul da solução de fluoresceína-5-maleimida produz resultados aceitáveis. </li><li> Incubar a mistura reaccional durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Terminar a reacção por adição de ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 50 mM. </li><li> Remover não reagidos fluoresceína, utilizando uma coluna de spin de dessalinização (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugação durante 2 minutos a 1500 xg à temperatura ambiente. </li><li> Por análise de SDS-PAGE, adicionam-se 10 ul de 2 x tampão de amostra de SDS-PAGE de Laemmli a 10 ul de cada reacção. Armazenar a proteína marcada ao abrigo da luz a 4 ° C, durante até um mês oude utilização única em alíquotas a -20 ° C até 3 meses. </li></ol> 3. Reação rotulagem e determinação de Incorporação Biotina <ol><li> Use colunas de centrifugação de dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) para realizar uma permuta de tampão de água a uma solução de tampão fosfato salino (PBS), pH 7,0 as VLPs produzidas no passo 1. </li><li> Prepare uma solução de 20 mM de maleimida-PEG2-biotina, adicionando 190 ul de PBS em No-Pesar maleimida PEG2-biotina e misture pipetando para cima e para baixo. </li><li> Adicionar maleimida-PEG2-biotina para as VLPs e misturar. Usar um excesso molar de 10 vezes de reagente de VLPs soluções ≤ 2 mg / ml. </li><li> Incubar a mistura reaccional à temperatura ambiente durante 4 horas. </li><li> Remover não reagidos maleimida-PEG2-biotina, utilizando uma coluna de dessalinização de spin (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) e centrifugação durante 2 minutos a 1500 xg à temperatura ambiente. </li><li> Determinar as moles de biotina por moles de VLPs utilizando o Kit Pierce Quantitation Biotina (Thermo Scientific) e following instruções do fabricante. </li></ol> 4. A ligação cruzada de 2-Cys e VLPs Peptide F <ol><li> VLPs que resultou em resíduos de cisteína disponível para a ligação cruzada no passo 2 (2-Cys VLPs) são utilizados no passo seguinte. Preparar uma solução-mãe fresca de reticulação (28,63 mM) por dissolução de 10 mg de agente de reticulação-NHS-PEG4-maleimida em 680 uL de sulfóxido de dimetilo. </li><li> Dissolver a 17 (F)-amino ácido do péptido longo (LLPNMOKDKEACAKAPL) em 50 ul de tampão de conjugação (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM de EDTA) a uma concentração de 0,1 mM. </li><li> Adicionar 4 ul de agente de reticulação de 50 ul de péptido dissolvido (proteína-NH2) a uma concentração de mM final (que é um excesso molar de 10 vezes para 0,1 mM de solução de péptido). </li><li> Incubar a mistura reaccional durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Purificar reticulado péptido utilizando uma coluna de dessalinização (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) equilibrada com tampão de conjugação (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) por centrifugação a 1500 xg, durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Defina-se a mistura de reacção combinando VLPs (proteína-SH) e de ligação cruzada de péptidos (proteína-NH2), em uma proporção molar determinada pelo número de aminas e tióis activados envolvidos na reacção e a diferença de peso molecular entre VLPs e peptídicas. </li><li> Incubar a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Para a análise de Western blot, misturar o produto resultante conjugado de 1:1 com tampão Laemmli, deixar ferver por 10 minutos, e continuar com SDS-PAGE num molde pré-10-20% de Tris-Glicina gel (Invitrogen), seguido de electrotransferência para uma membrana de nitrocelulose (Invitrogen). Bloquear as membranas com 1 x PBS, pH 7,2, contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) e leite em pó desnatado a 5% e com sonda de anticorpos específicos do péptido, seguido pelo anticorpo marcado com fosfatase secundário apropriado. </li></ol>

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</ol>

Menção dos nomes comerciais de produtos comerciais na publicação é exclusivamente para a finalidade de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo Departamento de Agricultura dos EUA.

O método aqui apresentado permite uma análise muito sensível e rápida de cisteínas reactivos presentes na superfície das plantas produzidas VLPs, bem como em outros complexos de proteínas. As maleimidas são específicas de reagentes de tiol, que reagem com o grupo sulfidrilo livre que contêm moléculas de modo a formar ligações tioéter estáveis. Este método baseia-se na especificidade das maleimidas para reagir com grupos sulfidrilo que não estão envolvidos em interacções com outros aminoácidos. A preservação da estrutura...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Thinwall, Ultra-Clear Tubos </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 Kit </td><td> Tecnologias de vida </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> F luoresceina-5-maleimida </td><td> Vida Thermo Scientific Technologies </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 está fora de ordem com substituto F150 </td></tr><tr><td> Pierce Kit quantificação Biotina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link Maleimida PEG2-Biotina, No-Pesar Formato </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Reticuladores </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% de Tris-Glicina gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de Laemmli </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine SDS tampão de corrida </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine Transferência de buffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de nitrocelulose Sandwich papel de filtro </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Afinidade fosfatase Labeled anticorpo purificado a IgG de coelho </td><td> Kirkegaard and Perry Laboratories </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP de substrato de fosfatase </td><td> Kirkegaard and Perry Laboratories </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em&gt; milho rayado fino vírus</em&gt; partículas semelhantes a vírus produzidas em<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; plantas e cross-linking de peptídeos para vlp

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Imitando e explorar as propriedades e características físico-químicas, vírus e física tem a promessa de fornecer soluções para alguns dos desafios mais prementes do mundo. A variedade e tipos de vírus, juntamente com suas propriedades intrigantes, potencialmente, dar oportunidades infinitas para aplicações em tecnologias baseadas em vírus. Vírus têm a capacidade de se auto-organizar em partículas com forma e tamanho discreto, a especificidade de simetria, polivalência e propriedades estáveis ​​sob uma variedade de condições de temperatura e pH. Não surpreendentemente, com uma gama tão extraordinária de propriedades, os vírus são propostas para uso em biomateriais 9, 14, 15 vacinas, materiais eletrônicos, ferramentas químicas e molecular recipientes eletrônico 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12. A fim de utilizar os vírus em nanotecnologia, eles devem ser modificados a partir de suas formas naturais para conferir novas funções. Este pr desafiadorocesso pode ser realizada através de vários mecanismos, incluindo a modificação genética do genoma virai e a fixação de moléculas quimicamente estrangeiras ou desejado para as partículas de vírus grupos reactivos 8. A capacidade de modificar vírus principalmente depende das propriedades físico-químicas e físicas do vírus. Além disso, as modificações genéticas ou físico-química precisam ser executadas sem afectar adversamente a estrutura do vírus nativo e função do vírus. Maize rayado fino vírus proteínas (MRFV) revestimento auto-montar em Escherichia coli produtoras de VLPs estáveis ​​e vazios que são estabilizadas por proteína-proteína interações e que pode ser usado em aplicações baseadas em tecnologias vírus 8. VLPs produzidas em plantas de tabaco foram examinados como um andaime sobre o qual uma grande variedade de péptidos pode ser covalentemente exibida 13. Aqui, descrevem-se as etapas de: 1) determinar quais as cisteínas solventes acessíveis em um capsídeo do vírus estão disponíveis para modificaçãocação, e 2) Bioconjugate péptidos aos capsídios modificados. Usando nativas ou mutationally-inserido resíduos de aminoácidos e as tecnologias de acoplamento normalizados, uma grande variedade de materiais tem sido apresentados na superfície de vírus de plantas, tais como, o vírus do mosaico Brome 3, vírus Carnation mottle 12, Cowpea cloróticas mottle virus 6, do mosaico do tabaco 17 vírus, o vírus do mosaico do nabo amarelo 1, e MRFV 13.

Expressão transitória de mutantes casaco MRFV proteína (PB) genes em N. benthamiana plantas em um PVX VLPs baseadas em vetor produção está descrito na Figura 1. A modificação MRFV gene da proteína da cápside é amplificado por PCR e, em seguida, colocado sob o controlo transcricional do promotor duplicado subgenómico CP num vector baseado PVX, pP2C2S 2, (uma oferta de D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inglaterra). Na transcrição de ARN in vitro produz tr...

Um método para analisar a acessibilidade do solvente do grupo tiol de resíduos de cisteína de<em&gt; Milho rayado fino vírus</em&gt; (MRFV)-partículas semelhantes a vírus (VLPs), seguido por uma reacção de ligação cruzada de péptidos é descrito. O método tira partido da existência de grupos químicos sobre a superfície das partículas VLP, que podem ser alvos para as reacções específicas.

Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em&gt; Milho rayado fino vírus</em&gt; Partículas semelhantes a vírus produzidas em<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar uma análise de acessibilidade ao solvente de resíduos de Cisteína na superfície de partículas semelhantes a vírus, ou VLPs, seguida pelo cruzamento de peptídeos com Cisteína nas partículas semelhantes a vírus. Isso é alcançado primeiramente clonando a proteína do capsídio do vírus do enfezamento listrado do milho, ou MRFV, em um vetor viral baseado no vírus X da batata. Em seguida, plantas de N. benthamiana são inoculadas com o vírus modificado e as VLPs de MRFV formadas a partir da proteína do capsídio são purificadas. Por fim, as VLPs e os peptídeos são cruzados usando amônia-PEG4-maleimida e detectados por meio de western blot. São obtidos resultados que identificam a produção de complexos peptídeo-VLP por análise de western blot. A técnica amplia a base de conhecimento sobre como modificar quimicamente a superfície de vírus e partículas semelhantes a vírus para produzir novos materiais para a nanotecnologia. Após produzir transcritos de RNA com capuz a partir de plasmídeos vetoriais baseados no vírus-X da batata contendo os genes da proteína capsidial selvagem e mutada em cisteína do MRFV, utilize duas alíquotas de 10 microlitros cada para infectar duas folhas de N. benthamiana. Incube as plantas por 10 dias em estufa com umidade de 60% e 16 horas de luz a 25 graus Celsius e oito horas de escuro a 20 graus Celsius. Ao final da incubação, colete as folhas infectadas pelo vírus, pese o tecido vegetal e coloque-o sobre gelo. Após purificar as partículas semelhantes a vírus conforme o protocolo descrito, prepare uma solução de um milimolar de Fluoresceína-5-maleimida em tampão fosfato de sódio 50 milimolar, pH 7,0, contendo 1 milimolar de EDTA. Agite em vórtex para dissolução completa e proteja a solução da luz com papel alumínio. Misture aproximadamente 30 microlitros de VLPs a um micrograma por microlitro com 60 microlitros da Fluoresceína-5-maleimida e incube por duas horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Interrompa a reação adicionando DTT numa concentração final de 50 milimolar. Utilizando uma coluna de centrifugação para dessalinização, remova a fluoresceína não reagida. Para visualizar as VLPs com resíduos de cisteína disponíveis para reticulação, realize análise em gel de SDS-PAGE adicionando 10 microlitros de tampão amostra 2x a 10 microlitros de cada reação. Armazene a proteína marcada protegida da luz a quatro graus Celsius por até um mês ou em alíquotas de uso único a menos 20 graus Celsius por até três meses.Prepare uma solução estoque de reticulação fresca dissolvendo 10 miligramas do reticulante NHS-PEG4-maleimida em 680 microlitros de dimetil sulfoxido. Dissolva um peptídeo de 17 (F) aminoácidos de comprimento em 50 microlitros de tampão de conjugação numa concentração de 0,1 milimolar. Adicione quatro microlitros do reticulante a 50 microlitros do peptídeo dissolvido para obter uma concentração final de um milimolar. Incube a reação durante duas horas a quatro graus Celsius. Em seguida, utilize uma coluna de dessalinização para purificar a reação. Usando VLPs com resíduos de cisteína disponíveis para reticulação e o peptídeo reticulado, prepare uma mistura de reação numa razão molar determinada pelo número de tióis e aminas ativadas envolvidas na reação e pela diferença de peso molecular entre VLPs e peptídeo. Após incubar a reação durante duas horas à temperatura ambiente, utilize-a para realizar eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e western blotting de acordo com o protocolo descrito no texto.Um exemplo de aminoácidos reativos da proteína do capsídeo do MRFV é mostrado aqui. Cada aminoácido selecionado pode ser usado para ligar grupos funcionais, desde que esteja exposto na superfície. As técnicas químicas incluem estratégias tradicionais de bioconjugação, como a acilação do grupo amino da lisina, alquilação do grupo sulfidrila da cisteína e ativação de resíduos de ácido carboxílico com acoplamento a aminas adicionadas.Além disso, os grupos aromáticos da tirosina e do triptofano podem ser alvos atrativos para bioconjugação por meio de diazotização e alquilação. Ilustra-se aqui a acessibilidade ao solvente dos resíduos de Cys em VLPs frente a reagentes específicos para tióis. VLPs do tipo selvagem purificados e mutantes cys-VLP que possuem resíduos de Cisteína nas posições 107 a 111 e 192 a 194 do gene da CP são inativos em condições nativas com um reagente específico para tióis. O fluoresceína-5-maleimida confere fluorescência alaranjada apenas ao mutante cys-VLP que possui resíduos de Cisteína nas posições 125 a 129 do gene da CP. O resultado mostra que as VLPs na segunda faixa possuem uma disposição geométrica de resíduos de Cisteína que resulta em grupos tióis livres expostos ao solvente, enquanto os resíduos de Cisteína nas amostras das faixas um e três estão possivelmente envolvidos em pontes dissulfeto durante a dobragem da proteína do capsídeo. Reações de marcação com maleimida-PEG2-biotina seguidas por um ensaio de biotinilação representam outro exemplo de análise da acessibilidade ao solvente de resíduos de cys. Como a biotina é uma molécula relativamente pequena, pode ser conjugada em várias cópias nas VLPs, cada uma delas combinando uma molécula de avidina, conforme mostrado aqui. O grau de biotinilação, 84,74 mols de biotina por mol de proteína, indica o número de moléculas de biotina ligadas às VLPs e, consequentemente, o número de ligantes que podem ser exibidos na superfície externa. Devido à disponibilidade de diversos grupos tióis nas VLPs, peptídeos podem ser ligados por reações de reticulação com NHS-PEG4-maleimida.Este reagente é um crosslinker heterobifuncional, que contém extremidades reativas, como N-hidroxissuccinimida ou éster NHS e grupos maleimida, permitindo a conjugação covalente de moléculas contendo aminas e sulfidrilas. Neste exemplo, o éster NHS reage com aminas primárias, formando ligações amida, enquanto o maleimida reage com grupos sulfidrila, formando ligações tioéster estáveis. Como visto aqui, as reações de reticulação produzem complexos de VLP-peptídeo que são imunorreativos com os anticorpos específicos em ensaio imunoenzimático (western blot).Este desenvolvimento demonstra aos pesquisadores na área de virologia como explorar o uso de partículas virais como estrutura para a fixação de uma grande variedade de ligantes em uma matriz geométrica regular para diversas aplicações.

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