Name: Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Aprenda a combinar imunofluorescência e DNA FISH para detectar modificações de histonas e sequências de DNA simultaneamente em núcleos interfásicos preservados em 3D. Este método avançado permite visualizar a dinâmica da cromatina com microscopia confocal tridimensional.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Skok, especialmente Susannah Hewitt, para discussões e comentários. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de bolsas de Saúde R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS é um Leukemia &amp; Lymphoma Society estudioso. JC é um Irvington Fellow Instituto do Cancer Research Institute. MM é apoiado por um National Science Foundation Grant Integrativa Pós-Graduação Pesquisa e Estágio (NSF IGERT 0.333.389).

1. DNA Labeling Sonda com fluoróforos: Nick Tradução (~ 6 horas) <ol><li> Limpeza BAC DNA (preparado por maxi-prep) ou plasmídeos ou produtos de PCR, todos ressuspenso em H 2 O, podem ser utilizados para a rotulagem. Note-se que para um sinal de FISH robusto, as sondas devem abranger pelo menos 10 kb. </li><li> Incubar DNA em RNase A durante 30 min a 37 ° C (todos os reagentes estão listados na Tabela 1). </li><li> Incubar a reacção de tradução de nick durante 2 horas a 16 ° C (ver Tabelas 2 e 3). Os métodos alternativos de marcação directa pode ser utilizado (exemplo: Tag FISH, Invitrogen). </li><li> Inactivar a reacção durante uma hora à temperatura de -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C. </li><li> Determinar o tamanho da sonda sobre um gel de agarose a 2%. O esfregaço deve estar entre 100 e 1000 pb, com a maioria a cerca de 300-500 pb (Note-se que a mancha de Cy5 sondas não é visível). Se o DNA não é digerida suficiente, mais DNA Pol I eDNase I pode ser adicionado à mistura reaccional e incubou-se durante mais duas horas a 16 ° C. </li><li> Purifica-se as sondas de 0,025 milímetros filtros em duas provetas de litros cheio com H 2 0 por duas horas no escuro. </li><li> Adicionar factores de bloqueio para as sondas como se segue: 10 ug de ADN Cot-1, 10 ug de DNA Hybloc e 100 ug de esperma de salmão de 10 ^ g de sondas de DNA. Loja de sondas de ADN a -20 ° C. </li></ol> 2. Probe Precipitation / desnaturação / pré-hibridação (3-4 horas) <ol><li> Entre 0,3 ug e 1 ug de DNA de sonda é usada por lamela. Sondas de mistura com 0,1 volumes de NaAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%, a incubação durante uma hora a -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C e centrifugação a 13.000 rpm para baixo a 4 ° C durante 30 min. Note-se que a quantidade de sonda de DNA pode ser ajustada em função da qualidade do DNA e da região nuclear de hibridação. Os métodos alternativos de marcação directa podem permitir a utilização de quantidades reduzidas desonda. Para a detecção de sinais de DNA várias peixe em um slide, as diferentes sondas pode ser precipitada juntos (exceto sondas que não deve ser pré-recozido, como seqüências de repetição). Sondas para várias experiências realizadas ao mesmo tempo, podem também ser precipitados juntos. Pellets deve ser levemente coloridos de acordo com os fluoróforos usados ​​(se pequenas quantidades de sondas são precipitados, o sedimento pode não ser visível). </li><li> Pelotas secas e ressuspender-los em 15 ul de tampão de hibridação (ver Tabela 4) por cada lamela com agitação (usando um Thermomixer de Eppendorf) no escuro a 37-45 ° C (durante cerca de 20 min). </li><li> Sondas desnaturar durante 5 min a 75-95 ° C. </li><li> Pré-recozer sondas, a 37 ° C durante 30-60 min. Comprimento de pré-hibridação pode ser ajustada em função da complexidade e da qualidade das sondas. </li><li> Aplicar sondas para as lamelas para cruzamentos durante a noite (ver Seção 3). </li></ol> 3. 3PEIXES-dimensional DNA - Primeiro Dia (~ 3 horas) <ol><li> As células não aderentes são concentrados num pequeno volume de 1x PBS (~ 2x10 5 células em 5-10 ul de PBS 1x por lamela) e deixado cair no centro de uma lamela de poli-L-lisina revestido. As células aderentes deverá ser cultivadas em lamelas durante pelo menos 24 h (~ 70% de confluência) (lamelas podem ser revestidos com gelatina a 0,1%). Quadrados 18x18 para lamelas 24-24 mm são colocados em placas de 6 poços, e ao longo do protocolo, dois ml de cada solução é usada por poço (alternativamente redondo 1,5 mm, podem ser lamelas colocadas em placas de 12/24-well). </li><li> Fixar as células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, durante 10 min à TA (stocks PFA a 4% pode ser dividido em alíquotas, armazenado a -20 ° C). Paraformaldeído podem ser comprados em solução (16%), ou as soluções de reserva de 4% pode ser preparada a partir de pó / grânulos. Paraformaldeído em pó é dissolvido em 1x PBS a&gt; 60 ° C (pH pode ser aumentado para 8-9 para facilitar a dissolução), arrefecido para baixo sobre o gelo, ajustared a pH 7-7,4, filtrada, aliquotadas e armazenadas em falcões durante semanas à temperatura de -20 ° C. </li><li> Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min em gelo. Comprimento de permeabilização pode ser ajustado dependendo do tipo de célula-NB:. PEIXES Se o DNA é combinado com imunofluorescência, a imunomarcação devem ser realizados nesta fase (ver secção 4). </li><li> Após três lavagens em PBS 1x, as células a incubar com 0,1 ug / ul de ARNase A em 1x PBS, durante uma hora a 37 ° C. As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça. Se alguma resistência é encontrada, lamelas devem ser inundado com 1x PBS, a fim de evitar danificar as células. </li><li> Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,7% de Triton-X-100 / HCl 0,1 M durante 10 minutos em gelo. </li><li> Após três lavagens in 1x PBS, as células desnaturam em HCl 1,9 M durante 30 min à temperatura ambiente. Alternativamente, as células podem ser desnaturadas em formamida 50% / 2x SSC a 75-80 ° C durante pelo menos 30 min. Note-se que a hibridação comprimento (e da temperatura), pode ser optimizada, dependendo do tipo de célula. </li><li> Após três lavagens em gelo frio 1x PBS, hibridar com sondas de células durante a noite a 37 ° C numa câmara escura e húmida. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 15 ul de sonda em um slide, e selado com cimento de borracha. </li></ol> 4. 3-dimensional Imuno-FISH - Primeiro dia (~ 6-7 horas) <ol><li> Por combinados FISH imunofluorescência / DNA, imuno-coloração deve ser realizada após a permeabilização em 0,4% de Triton-X-100 (Passo 3.3). </li><li> Incubar as células em solução de bloqueio durante 30 minutos a RT (2,5% de albumina sérica bovina (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,1% de Tween-20). A solução de bloqueio é filtrado, aliquotadas em 1,5 ml eppendorfs e armazenado para meses a -20 ° C. </li><li> Incubar as células com o anticorpo primário produzido contra a proteína ou a modificação das histonas de interesse diluído em solução de bloqueio, por uma hora, à temperatura ambiente numa câmara húmida. Aqui, mostramos o exemplo de um anticorpo contra a serina-139 fosforilada da H2AX (γ-H2AX, Millipore; Consulte a Tabela 5 para detalhes). As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça (inundado com 1x PBS, se necessário). Note-se que a diluição e tempo de incubação pode ser ajustada em função da qualidade do anticorpo e tipos de células. </li><li> Lave as células em 0,2% BSA / 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação. </li><li> Incubar as células com o anticorpo conjugado com fluoróforo adequado secundário diluído em solução de bloqueio durante uma hora, à temperatura ambiente numa câmara escura e húmida. Aqui vamos mostrar um exemplo de detecção com umasecundário anticorpo de cabra anti-rato (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Consulte a Tabela 5 para detalhes). Hapteno-anticorpos secundários conjugados (biotina, digoxigenina, etc) podem também ser usados. Neste caso, um passo adicional para a detecção apropriada (estreptavidina, anti-dig, etc) pode ser realizada antes ou depois durante a noite a hibridação de DNA-FISH. </li><li> Enxaguar as células em 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação no escuro. </li><li> Pós-fix células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x durante 10 min à RT, no escuro. </li><li> Continuar FISH DNA como acima de incubação em RNase A (Passo 3.4). </li></ol> 5. 3-dimensional DNA FISH / Imuno-FISH - Segundo dia (~ 2 horas) <ol><li> Remova cuidadosamente cimento de borracha, lamínulas de inundação com 2x SSC, remova cuidadosamente com uma pinça e colocá-los em poços contendo solução de lavagem. </li><li> Lave as células em 2x SSC durante 30 min a 37 ° C no escuro, com agitação.</li><li> Lave as células em 2x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação. </li><li> Lave as células em 1x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação Note-se que em caso de desnaturação com formamida, lavagens deve ser substituído pelo seguinte:. Lavagens três lavagens em 50% de formamida / SSC 2x e 3 em 2x SSC, 5 min cada, a 37 ° C. </li><li> Montar as células em meio de prolongar a ouro de montagem contendo 1,5 ug / ml de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para contracoloração de DNA total. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 10-15 ul de meio de montagem de um slide e selado com unha polonês. As lâminas são mantidos durante meses a -20 ° C. </li></ol> 6. Microscopia 3D e Análise <ol><li> Imagens em 3D podem ser adquiridos com diversos sistemas de microscópio. Nas nossas experiências, secções ópticas separadas por 0,3 pm são recolhidas num AOBS SP5 Leica sistema confocal (acústico-óptico divisor de feixe). Note-se que a separação entre optical aviões pode ser ajustada dependendo do tipo de análise. </li><li> Pilhas de imagens em 3D podem ser analisados ​​utilizando um software diferente e ferramentas. Usamos o software Image J para avaliar medidas de distância entre loci de interesse e analisar diferentes tipos de associação dos locos de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas. </li><li> Todas as análises estatísticas foram realizadas para comparar dois (ou mais) diferentes condições biológicas com pairwise avaliação (s) de significância: comparação entre diferentes tipos de células ou estágios, a comparação entre os diferentes loci de interesse. Em todos os testes estatísticos, valores de P ≤ 5.00E-2 (a = 0,05) estão a ser tomadas significativa (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * muito significativa, P &lt;1.00E-3 *** altamente significativo). </li></ol> A análise estatística das distribuições inteiras de distâncias entre dois alelos. Nós c primeiroonstruct curvas de freqüência acumulada em toda a faixa de distâncias entre dois alleles.To avaliar a significância das diferenças nas distribuições de empíricos inter-alélicas distâncias usamos o teste não paramétrico de duas amostras de Kolmogorov-Smirnov (KS) 13,14. A análise estatística da associação estreita (ou seja, o emparelhamento) de dois alelos usando uma distância ideal de corte. Para identificar a gama de a maioria das diferenças robustas em distâncias entre dois alelos ou loci, usamos uma série de bicaudal teste exato de Fisher 15 s. Ou seja, em cada distância medida que testa se uma condição é significativamente sobre-representados em distâncias mais curtas entre as duas amostras. A mínima na distribuição dos valores de P indica a gama de distâncias que devem ser considerados como um ponto de corte para a íntima associação (emparelhamento ie) um dos dois alelos. Posteriormente, a bicaudal teste exato de Fisher é usado tó avaliar a importância do emparelhamento de dois alelos identificados no valor de corte 15. Correcções de teste são aplicados a contabilizar o número total de testes de Fisher realizada 16. A análise estatística da associação entre o locus de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas. O teste de duas caudas exacto de Fisher-é utilizado para analisar a importância da associação do locus de interesse com compartimentos diferentes ou proteínas 15.

<ol><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells%3A+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li>
<li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li>
<li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture%3A+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+%28immuno%29-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays+%3A+news+and+reviews+in+molecular%2C+cellular+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li>
<li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li>
<li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li>
<li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li>
<li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li>
<li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).</li>
<li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li>
<li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951(1951).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li>
<li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interpretation+of+%CF%872+from+contingency+tables%2C+and+the+calculation+of+P%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%22%5BJournal%5D)">On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li>
<li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%2C+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li>
<li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+accessibility%2C+nuclear+positioning%2C+recombination%2C+and+transcription+at+the+Igkappa+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li>
<li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li>
<li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3%27+Igk+enhancer+induces+%27decontraction%27+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li>
<li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li>
<li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568(2008).</li>
<li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li>
<li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li>
<li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+%27decontraction%27+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li>
<li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li>
<li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li>
<li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li>
<li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li>
<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

As técnicas descritas acima foram usadas no nosso laboratório para analisar a regulação da recombinação V (D) J de imunoglobulina e Tcra / d loci no desenvolvimento de linfócitos 30,31. Estamos confiantes de que esta técnica pode ser adaptada para a detecção de várias proteínas nucleares, compartimentos nucleares e locos, em diferentes tipos de células. Modificações do protocolo pode ser necessário, e, neste caso, os passos principais para se concentrar são as seguintes. Em primeiro lugar, o...

Estabelecimento de mecanismos epigenéticos gatilho e herança de desenvolvimento e de células do tipo perfis específicos de transcrição. Em um nível, este envolve a modulação da embalagem da cromatina, que define as regiões genômicas ativas ou em silêncio. Numa escala maior, a organização 3D global do genoma e arquitectura nuclear também desempenhar um papel no controlo da transcrição de padrões. Assim, o esvaziamento desses recursos epigenômico é essencial para um entendimento completo de como os genes são regulados 6-11. FISH DNA combinado imunofluorescência e 3D fornecem uma oportunidade única para complementar análises moleculares e bioquímicos, avaliando interacções específicas / associações de sequências de ADN e / ou proteínas dentro do núcleo. Além disso, enquanto do genoma técnicas de alto rendimento, como cromatina imunoprecipitação (CHIP-seq) ou conformação cromossomo captura juntamente com o seqüenciamento de profundidade (4C-seq, 5C, Hi-C) fornecer dat mundialuma população de células em 12, técnicas de imunofluorescência / ADN FISH permitir análises ao nível da célula individual. Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por seqüências de DNA por imunofluorescência e FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D imuno-FISH). A vantagem deste protocolo é a visualização conjunta de DNA e preservação de estruturas de proteínas. A nossa experiência neste campo nos permitiu melhorar e simplificar os protocolos existentes. Apesar de termos utilizados neste protocolo para a detecção de ADN de cadeia dupla em intervalos linfócitos submetidos a recombinação, este método pode ser aplicado a outras proteínas e de outros tipos de células.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Pescador </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 a C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 ou Cy5 dUTP </td><td> Pescador </td><td> N º 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 mM filtros </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1 DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc ADN de 1 mg / ml </td><td> Genética Aplicada </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Esperma de salmão </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> pó a serem ressuspensas a 10 mg / ml em H2O </td></tr><tr><td> NaAc (Acetato de sódio, pH 5,2, solução tampão) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol. Biol grau) </td><td> Pescador </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polivinilpirrolidona (Mol Biol grau) </td><td> Pescador </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran pó de sulfato </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Solução salina-fosfato de sódio-EDTA) solução 20x </td&gt; <td> Pescador </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Pescador </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Pescador </td><td> º 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td> Pescador </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 6 poços </td><td> Pescador </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Pescador </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina solução </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído, grânulos, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol grau </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Albumina de Soro Bovino) Fracção V </td><td> Pescador </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol grau </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (citrato de sódio Saline) solução 20x </td><td> Pescador </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> Prolongar reagente Antifade Ouro </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Melhor teste de um cimento de borracha casaco </td><td> Abastecimento de lojas de arte ou de escritório </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Reagentes específicos e pequenos equipamentos. </td></tr></tbody></table>

imunofluorescência combinados e fish dna em 3d preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3d

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Hibridização fluorescente in situ utilizando sondas de DNA em 3-dimensionalmente núcleos preservados seguido por microscopia confocal 3D (3D FISH DNA) representa a forma mais direta de visualizar a localização de locos gênicos, cromossômica sub-regiões ou territórios inteiros em células individuais. Este tipo de análise fornece insights sobre a arquitetura global do núcleo, bem como o comportamento de loci genômicos e regiões específicas dentro do espaço nuclear. Imunofluorescência, por outro lado, permite a detecção de proteínas nucleares (histonas modificados, variantes de histonas e modificadores, maquinaria de transcrição e factores nucleares, sub-compartimentos, etc.) O principal desafio na combinação FISH DNA imunofluorescência e 3D é, por um lado, para preservar o epitopo detectada pelo anticorpo, bem como a arquitectura 3D do núcleo, e, por outro lado, para permitir a penetração da sonda de ADN para detectar locos gênicos ou territórios cromossômicos 1-5. Aqui nós fornecemos um protocolo que combina visualização de modificações da cromatina com loci genômicos em núcleos preservados 3D.

DNA e imuno-FISH são utilizados no laboratório Skok para estudar as alterações na organização nuclear associadas com o processo de recombinação V (D) J de receptor de antigénio, durante loci B e T o desenvolvimento de linfócitos. As técnicas acima descritas nos permitir i) medir distâncias entre as duas extremidades de um locus (contração) ii) medir distâncias entre alelos ou loci (emparelhamento), iii) analisar os danos no DNA que ocorrem dentro loci, iv) avaliar a localização de alelos e locos em relação ao nuclear su...

Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por imunofluorescência e seqüências de DNA por FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D FISH imuno-DNA).

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar modificações da cromatina e sequências de DNA simultaneamente usando microscopia confocal 3D, as primeiras sondas de DNA específicas são geradas. Enquanto isso, as células experimentais são fixas permanentes e imunocoradas. Para os marcadores de histonas de interesse.As células são então desnaturadas e uma fluorescência noturna dentro de você. A hibridização ou peixe é realizada usando uma ou mais sondas de DNA. Finalmente, as células são lavadas e montadas para fluorescência 3D.A análise microscópica das imagens resultantes revela localização nuclear de loci de interesse e associação com modificações específicas de cálculos de His. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina a visualização de proteínas nucleares, incluindo cálculos com loci genômicos em núcleos de preservação 3D, e pode ajudar a responder a questões-chave no campo da organização nuclear epigenética da cromatina ou regulação gênica. Para este procedimento, plasmídeos traseiros ou produtos de PCR podem ser usados para rotulagem.Estes devem ser preparados conforme descrito no texto anexo. Observe que, para um sinal de peixe robusto, as sondas devem gastar pelo menos 10 pares de quilobases. Comece este procedimento combinando um micrograma de DNA e 0,17 microgramas de RNAs A em um tubo de microcentrífuga.Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, inative brevemente os RNAs A no gelo e adicione a quantidade apropriada de tradução Nick. Misture incubar por duas horas a 16 graus Celsius em banho-maria refrigerado ou em um bloco frio para inativar a reação.Coloque os tubos a 80 graus Celsius negativos por uma hora ou 20 graus Celsius negativos durante a noite. Em seguida, determine o tamanho da sonda em um gel 2%agros. O esfregaço deve estar entre 101.000 pares de bases, com a maioria em aproximadamente 300 a 500 pares de bases.Observe que a mancha das sondas de ficção científica não é visível. Uma vez determinado o tamanho, purificar as sondas por diálise em 0,02. Filtros de cinco milímetros em copos de dois litros cheios de água.Pipetar suavemente 200 microgramas de sonda no centro de cada filtro flutuante e, em seguida, incubar durante duas horas no escuro. Após a incubação, use uma pipeta para transferir suavemente a sonda dos filtros para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione fatores de bloqueio às sondas da seguinte maneira.Um micrograma de CO 1D NA. Um micrograma de DNA de alto bloco e 10 microgramas de esperma de salmão para um micrograma de sonda de DNA e mistura armazenam as sondas de DNA a 20 graus Celsius negativos. No dia do procedimento de pesca, as sondas são precipitadas e preparadas para uso. Observe que as etapas descritas nesta seção do vídeo devem ser executadas em paralelo com as etapas na seção a seguir.Para precipitar as sondas, siga-as e combine-as com 0,1 volume de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 100% incubar por uma hora a 80 graus Celsius negativos. Após a incubação, gire as sondas para baixo a 16.000 vezes G a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e seque os pellets ao ar no escuro.Dependendo da quantidade e cor das sondas, o pellet pode ou não ser visível. Resus suspenda o pellet em 15 microlitros de tampão de hibridização por condição de teste e agite usando um misturador térmico einor no escuro a 37 a 45 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos. Em seguida, para desnaturar, as sondas as incubam por cinco minutos a 75 a 95 graus Celsius.Em seguida, para pré-sondas, incube-as a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos no misturador térmico. Imediatamente após a incubação, as sondas serão aplicadas às células em lamínulas, conforme descrito na próxima seção do vídeo. Observe que, para as etapas a seguir, os tempos de incubação devem ser modificados conforme necessário para os anticorpos e células usados.As etapas descritas nesta seção do vídeo devem ser executadas em paralelo com as etapas da seção anterior, conforme descrito no texto que acompanha. Solte as células não aderentes em lamínulas revestidas de polilisina em poços de placas de seis poços e deixe-as se prender por cinco minutos. Em seguida, adicione suavemente dois mililitros de aldeído paraforme 2% em PBS incube por 10 minutos em temperatura ambiente após a incubação.Enxágue cada poço com PB S3 vezes e, em seguida, permeabilize as células, adicione dois mililitros de gelo frio, 0,4% Triton X 100 em PBS e incube por cinco minutos no gelo. Depois de aspirar a solução permeável, se o DNA peixe for combinado com imunofluorescência, proceda da seguinte forma. Primeiro pipete 100 microlitros de solução de bloqueio em uma câmara umidificada.Coloque a lamínula com a célula voltada para baixo na solução de bloqueio e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira. A cobertura desliza para gotas de 100 microlitros do anticorpo primário diluído em solução de bloqueio.Aqui, o anticorpo usado reconhece sírio fosforilado 1 39 de H dois A x ou gama H dois A x. Incube as lâminas em uma câmara umidificada por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, use uma pinça para remover cuidadosamente as lamínulas.Se as lamínulas forem difíceis de pegar, inunde com PBS e tente novamente. Transfira cada lâmina para um poço de seis. Placa de poço contendo dois mililitros de 0,2% BSA 0,1% entre 20 em PBS, lave as lamínulas nesta solução três vezes por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação e, em seguida, incube as células com o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado diluído em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara escura e úmida em param.Como antes de seguir a incubação, enxágue as células em 0,1% entre 20 em PB S3 vezes por cinco minutos em temperatura ambiente no escuro para fixar as células, mergulhe-as em dois mililitros de formaldeído a 2% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Uma vez que as células tenham sido coradas ou se não estiverem coradas, continue o DNA fish enxaguando as lamínulas três vezes em PBS. Em seguida, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em uma gota de 100 microlitros de 0,1 miligramas por mililitro.RNAs em param em uma câmara umidificada e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, enxágue as lamínulas três vezes em PBS e, em seguida, permee as células em ácido clorídrico 0,7% Trix 100 em 0,1 molar frio por 10 minutos em gelo no escuro. Após três enxágues em PBS, desnature as células em ácido clorídrico 1,9 molar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro e lave mais três vezes em PBS gelado ao lado de hibridizar as células com as sondas.Coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em uma gota de sonda de 15 microlitros preparada na seção anterior deste vídeo em uma lâmina de microscópio, sele a lâmina com cimento de borracha e incube durante a noite a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada escura. No dia seguinte, use uma pinça para remover cuidadosamente o cimento de borracha das lâminas. Em seguida, gripe as lamínulas com dois Acts SSC e use uma pinça para remover cuidadosamente as lamínulas com as células.Em seguida, coloque-os em poços contendo solução de lavagem. Em seguida, execute as seguintes lavagens com agitação no escuro, dois XSSC por 30 minutos a 37 graus Celsius, dois XSSC por 30 minutos em temperatura ambiente e um XSSC por 30 minutos em temperatura ambiente para montar as lâminas, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em uma gota de 10 a 15 microlitros de meio de montagem de ouro prolongado contendo 1.5 miligramas por mililitro de vedação DPI com esmalte. As lâminas podem ser armazenadas por meses a 20 graus Celsius negativos.Assim que as lâminas estiverem prontas, colete imagens 3D com seções ópticas separadas por 0,3 mícron e analise conforme descrito no documento anexo para determinar se as mudanças na associação dos dois alelos dos loci do receptor de antígeno estão ligadas à regulação do processo de recombinação de VDJ durante o desenvolvimento de linfócitos, células selvagens e mutantes deficientes na proteína recombinase rag um foram usadas para examinar um locus de interesse usando um DNA sonda de peixe gerada a partir de um dorso que se estende por aproximadamente 200 pares de quilobases, abrangendo a região genômica. As distâncias entre os alelos foram medidas entre o centro de massa de cada sinal de retorno em pilhas de imagens 3D, círculos tracejados, formas de núcleo de contorno. As barras de escala mostradas são curvas de distribuição de frequência cumulativa de um mícron foram então geradas para mostrar toda a faixa de distâncias entre os dois alelos medidos no tipo selvagem e nas células mutantes.O teste não paramétrico de KS para duas amostras foi então usado para avaliar a significância das diferenças entre as duas distribuições. A faixa das diferenças mais robustas nas distâncias interalélicas foi avaliada usando uma série de dois testes exatos de pesca de cauda indicados pelos pontos azuis. Os valores de P mais robustos indicados pelos pontos mais altos foram encontrados para as distâncias em torno de um mícron.Assim, o ponto de corte para associação próxima ou emparelhamento dos dois alelos foi estabelecido em um mícron. As curvas de frequência cumulativa mostradas aqui indicam a faixa de distâncias para associação estreita dos dois alelos de zero a 1,5 mícron nas duas condições biológicas diferentes. A significância do emparelhamento dos dois alelos foi avaliada usando o teste exato de duas caudas de fisher para um ponto de corte em um mícron.Este gráfico mostra que, na condição mutante, os dois alelos não estão associados à alta frequência como no tipo selvagem. Assim, o pano de proteína ausente está envolvido no emparelhamento ínico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar imunofluorescência e DNA de peixe.Essa técnica abriu o caminho para os pesquisadores, fornecendo insights sobre as mudanças globais na arquitetura nuclear, o comportamento de loci genômicos específicos e regiões dentro do espaço nuclear e a associação de proteínas nucleares específicas dentro dessas regiões. E ajuda a entender os mecanismos subjacentes às diferentes doenças após esse procedimento. Outros métodos, como técnicas de rendimento de gelo em todo o genoma, como cromatina, imunoprecipitações ou busca de chips ou confirmação de captura de cromossomos, juntamente com sequenciamento profundo, como cinco C ou IC, podem ser realizados para fornecer dados globais sobre populações de células.

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescência dupla In situ Hibridação nas Seções cérebro fresco

Este artigo descreve a seleção de sondas adequadas para uma única célula FISH, técnicas de espalhamento de núcleos de blastômeros, e hibridização in situ e marcando sinal, aplicada ao diagnóstico genético pré-implantação (PGD) em um ambiente clínico.

FISH para diagnóstico pré-implantação Genética

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

O material aqui descreve um método desenvolvido para preservar a estrutura de cromatina tridimensional das células germinativas testiculares. Este foi chamado de método de slides tridimensional (3D). Este método melhora a sensibilidade para detecção de estruturas subnucleares e é aplicável para imunofluorescência, DNA e fluorescência de RNA na hibridização situ (FISH).

Método de preparação de slides para preservar arquitetura de cromatina tridimensional de células germinativas testiculares

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.

Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas

Apresentamos aqui um protocolo aprimorado para a preparação e imunossagem completa de testículos Drosophila, adequados para microscopia confocal e também permitindo rotulagem reprodutível e confiável. Ilustramos este protocolo por representação 3D e quantificação de experimentos de colocalização nos grandes espermatos S4-S5.

Imunostaining de Testes Drosophila de Monte Inteiro para Análise Confocal 3D de Grandes Espermatocitos

Aprenda a combinar imunofluorescência e DNA FISH para detectar modificações de histonas e sequências de DNA simultaneamente em núcleos interfásicos preservados em 3D. Este método avançado permite visualizar a dinâmica da cromatina com microscopia confocal tridimensional.

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Explorar mais vídeos