Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

O objetivo geral deste procedimento é detectar modificações da cromatina e sequências de DNA simultaneamente usando microscopia confocal 3D, as primeiras sondas de DNA específicas são geradas. Enquanto isso, as células experimentais são fixas permanentes e imunocoradas. Para os marcadores de histonas de interesse.

As células são então desnaturadas e uma fluorescência noturna dentro de você. A hibridização ou peixe é realizada usando uma ou mais sondas de DNA. Finalmente, as células são lavadas e montadas para fluorescência 3D.

A análise microscópica das imagens resultantes revela localização nuclear de loci de interesse e associação com modificações específicas de cálculos de His. A principal vantagem dessa técnica é que ela combina a visualização de proteínas nucleares, incluindo cálculos com loci genômicos em núcleos de preservação 3D, e pode ajudar a responder a questões-chave no campo da organização nuclear epigenética da cromatina ou regulação gênica. Para este procedimento, plasmídeos traseiros ou produtos de PCR podem ser usados para rotulagem.

Estes devem ser preparados conforme descrito no texto anexo. Observe que, para um sinal de peixe robusto, as sondas devem gastar pelo menos 10 pares de quilobases. Comece este procedimento combinando um micrograma de DNA e 0,17 microgramas de RNAs A em um tubo de microcentrífuga.

Incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, inative brevemente os RNAs A no gelo e adicione a quantidade apropriada de tradução Nick. Misture incubar por duas horas a 16 graus Celsius em banho-maria refrigerado ou em um bloco frio para inativar a reação.

Coloque os tubos a 80 graus Celsius negativos por uma hora ou 20 graus Celsius negativos durante a noite. Em seguida, determine o tamanho da sonda em um gel 2%agros. O esfregaço deve estar entre 101.000 pares de bases, com a maioria em aproximadamente 300 a 500 pares de bases.

Observe que a mancha das sondas de ficção científica não é visível. Uma vez determinado o tamanho, purificar as sondas por diálise em 0,02. Filtros de cinco milímetros em copos de dois litros cheios de água.

Pipetar suavemente 200 microgramas de sonda no centro de cada filtro flutuante e, em seguida, incubar durante duas horas no escuro. Após a incubação, use uma pipeta para transferir suavemente a sonda dos filtros para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, adicione fatores de bloqueio às sondas da seguinte maneira.

Um micrograma de CO 1D NA. Um micrograma de DNA de alto bloco e 10 microgramas de esperma de salmão para um micrograma de sonda de DNA e mistura armazenam as sondas de DNA a 20 graus Celsius negativos. No dia do procedimento de pesca, as sondas são precipitadas e preparadas para uso. Observe que as etapas descritas nesta seção do vídeo devem ser executadas em paralelo com as etapas na seção a seguir.

Para precipitar as sondas, siga-as e combine-as com 0,1 volume de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 100% incubar por uma hora a 80 graus Celsius negativos. Após a incubação, gire as sondas para baixo a 16.000 vezes G a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e seque os pellets ao ar no escuro.

Dependendo da quantidade e cor das sondas, o pellet pode ou não ser visível. Resus suspenda o pellet em 15 microlitros de tampão de hibridização por condição de teste e agite usando um misturador térmico einor no escuro a 37 a 45 graus Celsius por aproximadamente 20 minutos. Em seguida, para desnaturar, as sondas as incubam por cinco minutos a 75 a 95 graus Celsius.

Em seguida, para pré-sondas, incube-as a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos no misturador térmico. Imediatamente após a incubação, as sondas serão aplicadas às células em lamínulas, conforme descrito na próxima seção do vídeo. Observe que, para as etapas a seguir, os tempos de incubação devem ser modificados conforme necessário para os anticorpos e células usados.

As etapas descritas nesta seção do vídeo devem ser executadas em paralelo com as etapas da seção anterior, conforme descrito no texto que acompanha. Solte as células não aderentes em lamínulas revestidas de polilisina em poços de placas de seis poços e deixe-as se prender por cinco minutos. Em seguida, adicione suavemente dois mililitros de aldeído paraforme 2% em PBS incube por 10 minutos em temperatura ambiente após a incubação.

Enxágue cada poço com PB S3 vezes e, em seguida, permeabilize as células, adicione dois mililitros de gelo frio, 0,4% Triton X 100 em PBS e incube por cinco minutos no gelo. Depois de aspirar a solução permeável, se o DNA peixe for combinado com imunofluorescência, proceda da seguinte forma. Primeiro pipete 100 microlitros de solução de bloqueio em uma câmara umidificada.

Coloque a lamínula com a célula voltada para baixo na solução de bloqueio e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira. A cobertura desliza para gotas de 100 microlitros do anticorpo primário diluído em solução de bloqueio.

Aqui, o anticorpo usado reconhece sírio fosforilado 1 39 de H dois A x ou gama H dois A x. Incube as lâminas em uma câmara umidificada por uma hora em temperatura ambiente. Após a incubação, use uma pinça para remover cuidadosamente as lamínulas.

Se as lamínulas forem difíceis de pegar, inunde com PBS e tente novamente. Transfira cada lâmina para um poço de seis. Placa de poço contendo dois mililitros de 0,2% BSA 0,1% entre 20 em PBS, lave as lamínulas nesta solução três vezes por cinco minutos à temperatura ambiente com agitação e, em seguida, incube as células com o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado diluído em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara escura e úmida em param.

Como antes de seguir a incubação, enxágue as células em 0,1% entre 20 em PB S3 vezes por cinco minutos em temperatura ambiente no escuro para fixar as células, mergulhe-as em dois mililitros de formaldeído a 2% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Uma vez que as células tenham sido coradas ou se não estiverem coradas, continue o DNA fish enxaguando as lamínulas três vezes em PBS. Em seguida, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em uma gota de 100 microlitros de 0,1 miligramas por mililitro.

RNAs em param em uma câmara umidificada e incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, enxágue as lamínulas três vezes em PBS e, em seguida, permee as células em ácido clorídrico 0,7% Trix 100 em 0,1 molar frio por 10 minutos em gelo no escuro. Após três enxágues em PBS, desnature as células em ácido clorídrico 1,9 molar por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro e lave mais três vezes em PBS gelado ao lado de hibridizar as células com as sondas.

Coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em uma gota de sonda de 15 microlitros preparada na seção anterior deste vídeo em uma lâmina de microscópio, sele a lâmina com cimento de borracha e incube durante a noite a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada escura. No dia seguinte, use uma pinça para remover cuidadosamente o cimento de borracha das lâminas. Em seguida, gripe as lamínulas com dois Acts SSC e use uma pinça para remover cuidadosamente as lamínulas com as células.

Em seguida, coloque-os em poços contendo solução de lavagem. Em seguida, execute as seguintes lavagens com agitação no escuro, dois XSSC por 30 minutos a 37 graus Celsius, dois XSSC por 30 minutos em temperatura ambiente e um XSSC por 30 minutos em temperatura ambiente para montar as lâminas, coloque as lamínulas com o lado da célula voltado para baixo em uma gota de 10 a 15 microlitros de meio de montagem de ouro prolongado contendo 1.5 miligramas por mililitro de vedação DPI com esmalte. As lâminas podem ser armazenadas por meses a 20 graus Celsius negativos.

Assim que as lâminas estiverem prontas, colete imagens 3D com seções ópticas separadas por 0,3 mícron e analise conforme descrito no documento anexo para determinar se as mudanças na associação dos dois alelos dos loci do receptor de antígeno estão ligadas à regulação do processo de recombinação de VDJ durante o desenvolvimento de linfócitos, células selvagens e mutantes deficientes na proteína recombinase rag um foram usadas para examinar um locus de interesse usando um DNA sonda de peixe gerada a partir de um dorso que se estende por aproximadamente 200 pares de quilobases, abrangendo a região genômica. As distâncias entre os alelos foram medidas entre o centro de massa de cada sinal de retorno em pilhas de imagens 3D, círculos tracejados, formas de núcleo de contorno. As barras de escala mostradas são curvas de distribuição de frequência cumulativa de um mícron foram então geradas para mostrar toda a faixa de distâncias entre os dois alelos medidos no tipo selvagem e nas células mutantes.

O teste não paramétrico de KS para duas amostras foi então usado para avaliar a significância das diferenças entre as duas distribuições. A faixa das diferenças mais robustas nas distâncias interalélicas foi avaliada usando uma série de dois testes exatos de pesca de cauda indicados pelos pontos azuis. Os valores de P mais robustos indicados pelos pontos mais altos foram encontrados para as distâncias em torno de um mícron.

Assim, o ponto de corte para associação próxima ou emparelhamento dos dois alelos foi estabelecido em um mícron. As curvas de frequência cumulativa mostradas aqui indicam a faixa de distâncias para associação estreita dos dois alelos de zero a 1,5 mícron nas duas condições biológicas diferentes. A significância do emparelhamento dos dois alelos foi avaliada usando o teste exato de duas caudas de fisher para um ponto de corte em um mícron.

Este gráfico mostra que, na condição mutante, os dois alelos não estão associados à alta frequência como no tipo selvagem. Assim, o pano de proteína ausente está envolvido no emparelhamento ínico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar imunofluorescência e DNA de peixe.

Essa técnica abriu o caminho para os pesquisadores, fornecendo insights sobre as mudanças globais na arquitetura nuclear, o comportamento de loci genômicos específicos e regiões dentro do espaço nuclear e a associação de proteínas nucleares específicas dentro dessas regiões. E ajuda a entender os mecanismos subjacentes às diferentes doenças após esse procedimento. Outros métodos, como técnicas de rendimento de gelo em todo o genoma, como cromatina, imunoprecipitações ou busca de chips ou confirmação de captura de cromossomos, juntamente com sequenciamento profundo, como cinco C ou IC, podem ser realizados para fornecer dados globais sobre populações de células.