Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama
24 de março de 2013
Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento anti-cancro In vivo E a resolução de células simples.
O objetivo geral deste procedimento é rastrear em tempo real a penetração do medicamento e a resposta terapêutica à administração de um medicamento terapêutico. Isso é feito tratando primeiro o animal com a droga. Em seguida, a glândula mamária inguinal contendo o tumor é exposta criando um retalho cutâneo.
Em seguida, o camundongo é transferido para o estágio microscópico e a saturação de oxigênio no sangue e as taxas de pulso são medidas e uma linha de demora para administração de fluidos e medicamentos ou corantes é inserida. Finalmente, as imagens de lapso de tempo são adquiridas para análises posteriores. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações na morte celular ou nas interações do estroma tumoral em resposta a uma droga por meio de microscopia confocal de disco giratório ao vivo de tumores mamários de camundongos.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do microambiente tumoral, como como vários componentes do estroma de um tumor influenciam a resposta à terapia. Antes de começar, consulte o protocolo escrito para horários típicos de administração de medicamentos e imagens. Ligue um esterilizador de esferas quentes e deixe-o atingir pelo menos 200 graus Celsius.
Depois de lavar as ferramentas cirúrgicas em água e sabão, incluindo uma pinça com dentes, uma pinça serrilhada e duas tesouras, use o esterilizador de esferas quentes para esterilizá-las por pelo menos 30 segundos. Então deixe-os. Fresco. Coloque um absorvedor de laboratório em cima da tampa de isopor que será usada como plataforma cirúrgica.
Use fita adesiva de laboratório para fixar um cone nasal com uma linha no sistema de anestesia, no absorvedor de laboratório e uma agulha de calibre 18 por uma polegada e meia através da fita na tampa de isopor em ambos os lados do cone do nariz para manter o cone do nariz preso no lugar. Reserve a gaze estéril Betadine. Dois limpadores de isopropanol 70% uma lâmina de microscópio, super cola e quatro pedaços de fita de laboratório de meia polegada de largura.
Após anestesiar o animal em uma câmara de indução, quando ele estiver respirando profunda e lentamente, transfira o camundongo para a plataforma cirúrgica, com o lado ventral voltado para cima. Para evitar alta pressão, abra a linha de anestesia para a plataforma cirúrgica e, em seguida, feche a linha de anestesia para a câmara de indução. Reduza a concentração de isoflurano de 4% para 2,5%Verifique se a profundidade da anestesia é suficiente para a cirurgia, realizando uma pinça nas patas.
Se o animal não reagir, use quatro pedaços de fita adesiva para prender seus membros à plataforma cirúrgica e use um barbeador elétrico para remover os pelos da superfície ventral. Use lenços umedecidos com isopropanol 70%, seguidos de Betadine aplicado em gaze estéril para desinfetar a superfície ventral do animal usando tesouras e pinças com dentes. Faça uma incisão na linha média ventral subcutânea de cerca de três milímetros acima da uretra até o processo xifóide.
Tome cuidado para evitar perfurar ou cortar o peritônio com a tesoura e a pinça serrilhada. Gentilmente descolou a pele da cavidade peritoneal com a glândula mamária inguinal contendo o tumor a ser visualizado Ainda anexado. Posicione uma lâmina de microscópio de vidro contra a aba da pele de modo que a maior parte do tumor fique plana quando o camundongo for colocado no palco e para que não seja obstruído pelos membros posteriores.
Uma vez que a lâmina do microscópio tenha sido posicionada corretamente, use super cola para prender a lâmina à superfície externa da pele. Remova a fita de laboratório que prende os membros do animal. Abra a linha de anestesia para o estágio do microscópio e, em seguida, feche a linha de anestesia para a plataforma cirúrgica.
Transfira rapidamente o animal para o estágio do microscópio Depois que o animal for transferido, posicione e prenda a linha de anestesia e o cone do nariz para garantir que o mouse permaneça anestesiado e esteja em uma posição confortável. Reduza a concentração de isoflurano para 1,5%Exponha o tumor de forma que ele fique posicionado na parte superior e no centro de uma das portas de imagem cobertas de vidro na platina do microscópio. Insira a linha intraperitoneal de demora com o conjunto de infusão alado conectado à seringa de um mililitro contendo solução salina PBS estéril ou solução salina com iodeto de propídio.
Quando a linha intraperitoneal for inserida, injetar o animal com 100 microlitros de solução salina com iodeto de propídio e continuar a injetar 50 microlitros de solução salina com iodeto de propídio a cada hora até que a sessão de imagem seja concluída. Usando as oculares, verifique se o tumor está posicionado corretamente e com fita adesiva suave na lâmina do microscópio e na linha intraperitoneal. A lâmina deve ser presa frouxamente o suficiente para que o fluxo sanguíneo para o tecido não seja obstruído.
Colar a lâmina do microscópio ajuda a minimizar os artefatos de imagem introduzidos pela respiração do animal para adquirir imagens de lapso de tempo. Use o microgerenciador de software de código aberto, compile e analise os dados brutos usando IRIS ou outro software de análise de imagem. As fitas DExT conjugadas com fluorescência podem ser usadas como um marcador substituto para a administração de medicamentos nos tecidos.
Aqui é mostrada a chegada de fitzy conjugado com dois megadalton dextrano IV injetado em um camundongo expressando proteína fluorescente azul em células de câncer de mama. Após a chegada do medicamento ao tumor, o extravasamento e a difusão podem ser visualizados para determinar a meia-vida intravascular e a distribuição do medicamento. Aqui, o extravasamento e a distribuição de LOR conjugado com 10 kilodalton dextrano IV injetado em um camundongo expressando proteína fluorescente azul em células de câncer de mama e proteína fluorescente verde em células mielóides é mostrado.
A imagem pode fornecer informações sobre o tipo de morte celular que as células cancerígenas sofrem. Aqui, alterações nucleares estruturais indicativas de necrose ou apoptose são observadas em um camundongo que expressa proteína fluorescente verde conjugada à histona dois b. Após o tratamento com doxorrubicina, a morte de células cancerígenas induzida pela quimioterapia freqüentemente resulta em um recrutamento reativo de células imunes para tumores.
Aqui está um exemplo dessa resposta estromal ao tratamento agudo com doxorrubicina em um camundongo expressando proteínas fluorescentes azuis e verdes no câncer de mama e células mieloides, respectivamente. Além de visualizar a resposta estromal geral à quimioterapia, respostas estromais especializadas também podem ser visualizadas aqui. A fagocitose do material celular necrótico por uma célula vizinha é mostrada Uma vez dominada.
Essa técnica pode ser feita em 30 a 60 minutos e os animais podem ser fotografados por 12 a 40 horas se for realizada corretamente.
Visão Geral
Este artigo descreve um método para imagear a resposta ao tratamento anti-câncer in vivo com resolução de única célula. A técnica permite o rastreamento em tempo real da penetração do fármaco e da resposta terapêutica em tumores mamários de camundongo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Oncologia
- Técnicas de Imagem
Antecedentes
- Compreender as interações do microambiente tumoral é crucial para a terapia do câncer.
- A imagem em tempo real pode fornecer informações sobre a entrega e eficácia de fármacos.
- A imagem com resolução em nível de célula única aprimora a compreensão das respostas celulares.
- As técnicas de imagem em tempo real são essenciais para estudar processos biológicos dinâmicos.
Objetivo do Estudo
- Acompanhar a penetração de fármacos em tumores.
- Analisar as respostas terapêuticas ao nível celular.
- Investigar as interações entre células tumorais e componentes do estroma.
Métodos Utilizados
- Foram utilizados modelos de camundongos com tumores implantados para a realização de imagens.
- A aquisição de imagens com lapso de tempo foi realizada utilizando microscopia confocal de disco giratório.
- A administração do fármaco foi monitorada por meio de uma linha indwelling.
- Marcadores fluorescentes foram utilizados para visualizar a distribuição do fármaco e as respostas celulares.
Resultados Principais
- A imagem em tempo real revelou alterações nas interações entre morte celular e estroma tumoral.
- Os marcadores conjugados com fluorescência demonstraram eficácia na entrega do fármaco.
- A imagem forneceu informações sobre o tipo de morte celular que ocorre nos tumores.
- Foram observadas respostas estromais à quimioterapia, destacando o recrutamento de células imunes.
Conclusões
- O método permite uma análise detalhada das respostas terapêuticas em tumores.
- A imagem em tempo real pode aprimorar a compreensão da eficácia dos medicamentos.
- Essa abordagem pode orientar estratégias futuras de tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A visualização em tempo real da distribuição de fármacos e das interações entre tumor e estroma em modelos de camundongos vivos permite a redução de riscos mecanicistas de terapêuticas oncológicas ao associar a exposição farmacocinética à resposta farmacodinâmica. Esta abordagem apoia a validação de alvos e aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao capturar processos biológicos dinâmicos que influenciam a eficácia do fármaco. O método orienta a triagem de portfólios ao identificar precocemente mecanismos de resistência mediados pelo estroma durante a fase de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas por meio da visualização em tempo real da penetração do fármaco e da morte de células cancerígenas.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta da migração de células estromais e do recrutamento imunológico após o tratamento.
- Valor Preditivo: Apoia decisões de portfólio ao revelar como as interações no microambiente tumoral modulam a resposta ao fármaco.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes, estabelecendo parâmetros quantitativos para distribuição de fármacos e reatividade estromal.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de imagens com lapso de tempo de interfaces tumor-estroma consistentes.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em múltiplos candidatos a fármacos e configurações estromais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a relevância para a doença ao capturar respostas estromais que refletem observações clínicas de recrutamento imune após quimioterapia.
- Alinhamento Pré-clínico: Conecta descobertas de pesquisa à validação pré-clínica por meio de desfechos mensuráveis, como morte de células cancerígenas e migração estromal.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir ou não ao quantificar barreiras mediadas pelo estroma que afetam a eficácia do fármaco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, fornecendo leituras dinâmicas da exposição ao fármaco e da resposta biológica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao associar a liberação de fármacos aos resultados celulares em microambientes tumorais intactos.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de portas de imagem padronizadas e aquisição de imagens sequenciais reprodutíveis.
- Análises: Permite a comparação quantitativa da distribuição de fármacos, da cinética da morte celular e da migração de células estromais utilizando software de análise de imagens.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar respostas estromais que predizem efeitos de fármacos mediados pelo sistema imunológico.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de imagem reutilizável para avaliar diversos terapêuticos em modelos de câncer de mama.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações fármaco-tumor-estroma.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos de preparo cirúrgico e de imagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento e a eficiência do capital ao identificar mecanismos de resistência biológica precocemente.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco com base em perfis de interação estromal.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia de camundongo, manejo da anestesia e técnicas de imagem intravital.
- Depende de microscopia confocal de disco giratório, estágios com controle de temperatura e infraestrutura para marcação fluorescente.
- Necessita padronização entre equipes para preparo consistente de tumores, administração de fármacos e aquisição de imagens.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes modelos de tumor, composições estromais e agentes terapêuticos.
- Limitado pela duração da imagem (até 40 horas) e possíveis artefatos decorrentes de movimento ou respiração do animal.
