Name: Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a rastrear em tempo real a penetração de drogas e resposta terapêutica em tumores mamários de camundongos usando microscopia confocal de disco giratório. Este método permite analisar interações célula-morto e estroma-tumor em resposta a tratamentos anticâncer.

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Agradecemos J. e J. Cappellani Qiu para suporte técnico. Este trabalho foi financiado por fundos do Instituto Nacional do Câncer (U01 CA141451), o Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for the Cure, Long Island Caminhada dia 2 de Combate ao Câncer de Mama, Manhasset Coalizão das Mulheres Contra o Câncer de Mama para mim, e um pré-doutoramento bolsa de estudos do Programa Dirigido pelo Congresso Breast Cancer Research, dos EUA para ESNESN também é o destinatário da C. Leslie rápida e William Randolph Hearst bolsas da Fundação da Faculdade de Ciências Biológicas Watson. HAA foi apoiada por fundos do Conselho de Pesquisa da Noruega (160698/V40 e 151882), e Sudeste Autoridades Regionais de Saúde (2.007.060).

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Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar. Todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados IACUC.

As respostas dos tumores aos tratamentos sistémicos in vivo pode ser dramaticamente diferentes das células cancerosas in vitro, como o microambiente influencia tanto a resposta aguda e recaída 5. Um dos maiores obstáculos para a explicitação das vias quimiorresistência Vivo é a complexidade das interações entre as células de câncer e seu microambiente. Em particular, porque os tumores sólidos têm desenvolvido um equilíbrio entre o cancro e as células do estroma, perturbações de um componente, como a morte celular que ocorre durante o tratamento anti-cancro, pode resultar em efeitos dramáticos na organização dos tecidos. A técnica de imagem intravital fornecido aqui permite a visualização direta de câncer de células do estroma interações dentro dos tumores de ratos anestesiados ao vivo, durante o tratamento com drogas anti-câncer. Usamos microscopia confocal de disco giratório, que tem uma profundidade de penetração relativamente limitada (ver 17 </sup&gt;), mas as nossas técnicas cirúrgicas e rotulagem pode ser usado com outros tipos de microscopia. Filmes obtidos a partir destas experiências pode ser utilizada para controlar os processos, que incluem alterações na intensidade de fluorescência (por exemplo, devido à infiltração de uma população marcada ou indução da morte celular), motilidade celular, a distribuição de injectáveis ​​(por exemplo, para controlar derrame vascular), e co- localização dos sinais fluorescentes 5,12,17,20. Rotineiramente ratos de imagem para mais de 6 horas e de imagem também realizada por mais de 18 horas. Isto requer a manutenção dos ratinhos continuamente sob anestesia para estes períodos de tempo longos. Com anestesia adequada, mais de 90% dos animais sobrevivem nossos 6 horas, e cerca de 80% sobrevivem mais de 18 horas. Detalhes sobre como realizar a longo prazo da anestesia foram publicados previamente 19. Em nossa experiência, cinco fatores são fundamentais: evitar a hipotermia, evitando a desidratação, mantendo fisiológicas no sangue os níveis de saturação de oxigênio, ucantar gás transportador umidificado pelo isoflurano, e manter os animais com o menor nível de anestesia em que eles não mostram sinais de dor. Para manter a temperatura do corpo, mantemos ratos sob um cobertor aquecido (38 ° C). Para evitar a desidratação, é injectar pequenos volumes de solução salina IP em todo o procedimento de imagem inteira. Para manter níveis fisiológicos de saturação de oxigénio do sangue, que começa com 21% de oxigénio no gás de transporte (em vez de a comummente utilizado a 100%). Isso nos permite aumentar os níveis de oxigênio inalado se um rato - hora em um experimento - mostra uma diminuição na saturação de oxigênio no sangue. Em nossa experiência, aumentando os níveis de oxigênio inalado em tempo tal (por exemplo, 30-40%), quase sempre irá estabilizar o animal permitindo horas de imagem adicional. O nível ideal de anestesia é para a maioria dos mouses alcançados com 1-1,5% isoflurano e resulta em taxas de respiração de 60-65/min e taxas de pulso de 400-450/min. Em nossos experimentos de imagem, utilizamos principalmente modelo de camundongo transgênicos (MMTV-PyMT e C3 [1]-Tag), no qual os tumores são multifocal, permitindo imagens de múltiplas lesões em diferentes fases da progressão do tumor, em paralelo em múltiplos, as posições x y durante uma sessão única imagem. Isto diminui as preocupações relativas rato para rato variação no que diz respeito a experiências destinadas a identificar fase dependentes de respostas terapêuticas, e reduz o número de animais necessários para a imagiologia. O modelo de MMTV-PyMT (e outros modelos de cancro espontâneas) passam por fases progressivas histopatológicos que podem ser reconhecidos durante imagiologia intravital, embora o estadiamento patológico das lesões tumorais que podem ser feitas durante a imagiologia intravital é diferente de, e menos detalhado, do que a de cortes histológicos 5,17. Em contraste, os modelos de transplante de tumores tendem a reflectir melhor fase tardia, como as células cancerosas normalmente são isolados a partir de tumores avançados. Tais modelos são, assim, mais susceptíveis de estudar a tumores do estromainterações de tumores em estágio final que diferenças nessas interações entre diferentes etapas. Nós mostramos exemplos de como a imagem nucleares alterações estruturais que ocorrem após a morte celular induzida por terapia. Na ausência de tratamento anti-cancro, esta estratégia de etiquetagem pode ser utilizado em vez da divisão celular de imagem in situ, elucidar, por exemplo, como proliferação celular e a dormência é influenciada pelo microambiente. No futuro, a marcação fluorescente de componentes mitocondriais pode tornar possível a mudança de imagem mitocondriais que ocorrem durante a morte celular por apoptose. Neste protocolo, mostrámos também exemplos de como a imagem de cancro interacções célula-célula do sistema imunológico após a terapia, mas outros componentes do microambiente pode também ser visualizada e impressa. As linhas repórter transgênicos para os componentes do estroma incluem os de fibroblastos (por exemplo., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21), ou células da vasculatura (por exemplo, Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital de imagem permite a visualização em tempo real das interacções e processos que ocorrem na administração in vivo a seguir a quimioterapia. Com a tecnologia atualmente disponível, temos feito grandes progressos na compreensão de como as células mielóide influenciar a resposta terapêutica, no entanto, porque o microambiente do tumor é tão complexo, grandes avanços ainda são necessários para começar a mergulhar em mecanicamente os processos subjacentes ambiente mediado por resistência às drogas. Um dos avanços mais importantes ainda necessário é a identificação de melhores marcadores de populações de células específicas. A importância dos melhores marcadores é bem ilustrada com dois dos componentes mais importantes das células estromais do microambiente do tumor da mama, fibroblastos e células do sistema imune. α-actina de músculo liso (αSMA) é freqüentemente usado para identificarfibroblastos, mas a proteína também é expressa por células musculares lisas vasculares e células mioepiteliais 24. Assim, embora ratos αSMA-GFP repórter existir, determinar o tipo específico de célula estar abaixo durante um experimento de imagens intravital é desafiador. De modo semelhante, um único marcador fluorescente tal como expressa EGFP sob o promotor de c-fms, muitas vezes identificar múltiplas subpopulações de células imunes 12,17. Assim, embora um Prefere utilizar um único marcador para identificar um tipo específico de célula a complexidade da biologia subjacente representa um grande desafio na utilização desta abordagem. Uma solução parcial para este problema é a utilização de etiquetas de injectáveis ​​para diferenciar ainda mais sub-populações de células que expressam o mesmo repórter fluorescente. Por exemplo, os dextranos fluorescentes são captados por macrófagos e podem ser usados ​​para marcar as subpopulações de macrófagos que são etiquetados pelo c-fms-EGFP e Fsp1-EGFP ratinhos transgénicos repórter <sup&gt; 17. Os anticorpos conjugados de sondas fluorescentes também têm sido utilizados para identificar subpopulações específicas (por exemplo, a população Gr1-positivo de células mielóides rotulados pelo repórter c-fms-EGFP 17). Diferentemente das curvas de resposta do tumor gerados pelo compasso de calibre de medição, o qual fornece informações mecanicista pouco sobre como ou por tumores respondem à terapêutica administrada, ou a série histológica derivadas de tecidos colhidos em momentos diferentes, que necessitam de grandes grupos de animais, a nossa técnica fornece informação directa quantificável sobre a dinâmica da morte celular e as interações de células do estroma com células cancerosas em pequenas coortes. Assim, a vantagem de utilizar o processo descrito aqui, é que ela fornece uma informação dinâmica sobre as respostas de drogas no contexto de um microambiente do tumor intacto, em tempo real. Tal informação pode levar a importantes insights sobre os processos subjacentes que impulsionam respostas terapêuticas 5 &lt;/ Sup&gt;.

Os tumores sólidos são constituídos por dois compartimentos principais: células de cancro e os componentes do estroma (tanto celulares e não celulares) que ajudam na manutenção de um ambiente adequado para o crescimento do tumor 1. Estes componentes do estroma desempenham papéis críticos no desenvolvimento, progressão e metástase de vários tipos de cancros, incluindo os da mama 2-5. O ambiente também influencia estromal respostas terapêuticas 2,4,5. Assim, determinar como as células cancerosas responder às terapias convencionais e novel dentro do contexto do microambiente intacto é importante para favorecer a nossa compreensão da biologia do cancro e na melhoria actuais estratégias terapêuticas. Além disso, a definição de como cancro das células do estroma interacções mudar após a administração da terapia é crítica para a compreensão da biologia de recidiva tumoral. Organotípicas co-cultura de sistemas têm sido úteis para o estudo de tumores do estroma interacções <sse&gt; 6, mas é evidente que os métodos actualmente disponíveis não podem com sucesso recapitular o microambiente do tumor intacto in vitro, em particular no que diz respeito à função vascular e recrutamento de células imunitárias. Com efeito, as respostas celulares de cancro para terapias que são observadas in vitro muitas vezes são significativamente diferentes dos observados in vivo, onde o microambiente está intacta 5. Assim, em modelos in vivo para o estudo de tumores do estroma interações e seu impacto sobre a resposta terapêutica pode refletir melhor os mecanismos clinicamente relevantes 7. O principal meio de estudar as respostas para a terapia anti-cancro in vivo tem sido através de medições do tamanho do tumor e exame histológico de tecidos derivados de animais ou de pacientes tratados. No entanto, os avanços na microscopia e repórteres fluorescentes mais nas últimas duas décadas permitiram a visualização dos processos inter e intracelularem alta resolução em animal vivo, anestesiados (intravital imagem) 8. Estas tecnologias de microscopia intravital provaram ser especialmente valioso para espacialmente e temporalmente dissecando a dinâmica de tumor in vivo de interacções a-estroma resolução celular e subcelular 8,9. Os processos que foram desvendados por imagiologia intravital incluem anti-tumor a citotoxicidade das células T 10,11, as interacções entre as células T e as células mielóides 12, a dinâmica das modificações na composição de colagénio e organização após o tratamento terapêutico 13, macrófagos dependente intravasation célula cancerosa e metástase 14, e permeabilidade vascular 15. Existem três principais requisitos para imagiologia intravital. Estes incluem a preparação adequada exposição dos tecidos e para geração de imagens, marcação fluorescente dos componentes do tecido de interesse, e um par de microscopia câmara-sistema capaz de adquirir imagens de 16. As estratégias mais comuns utilizadas para atender a esses requisitos incluem: 1) os preparativos heterotópicos (por exemplo, a inoculação do orbital orelha ou olho), permanente Windows Imaging, ou preparações exteriorizado (por exemplo, retalho de pele dorsal), 2) transgênicos fluorescentes e repórteres.. injetáveis ​​fluorescentes para identificar os componentes do tecido, e 3) sistemas de microscopia confocal multifotônica ou emparelhado com tubos fotomultiplicadores ou charge-coupled device (CCD) câmeras, respectivamente 9. Usamos um modelo de retalho cirurgicamente preparado pele para expor a glândula mamaria inguinal para imagens em animais anestesiados que expressam transgenes que codificam os repórteres fluorescentes. As imagens são obtidas ao longo de um período de 12 a 40 horas utilizando um CCD intensificada (ICCD) câmara emparelhado com um sistema de fiação de disco de quatro a laser microscópio confocal 17. Imagiologia desta forma, permitiu-nos estudar os processos, tais como in vivo de distribuição de droga, dependente da fase chrespostas emotherapeutic, tipo de quimioterapia induzida morte celular, e o comportamento de células mielóides 5. Nós fornecemos um protocolo para a criação de imagens intravital de respostas de células cancerosas para anti-câncer de terapia e de tumor do estroma interações em modelos do rato do câncer de mama. Este protocolo pode ser usado para controlar os comportamentos e morte de tanto as células cancerosas e componentes do estroma com uma grande variedade de transgênicos e injetáveis ​​etiquetas fluorescentes em ambos os modelos transgênicos e transplante por períodos de até 40 horas em uma sessão de imagem única.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT ratos </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag ratos </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP ratos </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP ratos </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Feita em casa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, fluoresceína conjugada </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Reconstituir em dH 2 O (4 loja mg / ml, à temperatura de -20 ° C); diluído a 1 mg / ml em 1 x PBS </td></tr><tr><td> Dextran 10 kD, Alexa Fluor 647-conjugados </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Reconstituir em dH 2 O (4 loja mg / ml, à temperatura de -20 ° C); diluído a 1 mg / ml em 1 x PBS </td></tr><tr><td> Cloridrato de doxorrubicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Reconstituir em dH2O e armazenar a 4 ° C; diluir em 1 x PBS </td></tr><tr><td> Isothesia (isoflurano) </td><td> Butler Abastecimento Saúde Animal </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Iodeto de propídio </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; diluído 1:15 em 1 x PBS </td></tr><tr><td> Nitrogênio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxigênio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;agulha de bisel regulares </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Software de código aberto </td></tr><tr><td> Algodão embebido em álcool </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> Compressas com álcool isopropílico a 70% </td></tr><tr><td> Sistema de anestesia </td><td> Moleculares Imaging Products Co., </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampa de vidro </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> No. 1 ½, mm 24x50; desinfectar com 70% toalhetes isopropanol </td></tr><tr><td> Gurança esponjas de gaze (esterilizada) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de vidro de microscópio </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Pré-limpeza, se não pré-limpeza, desinfecção com 70% toalhetes isopropanol </td></tr><tr><td> Endurecidos tesoura fina </td><td> Belas Science Tools </td><td> 14090-11 </td><td> 2 pares; aço inoxidável, afiado afiadas pontas, ponta reta, 26 vanguarda mm, 11 cm de comprimento </td></tr><tr><td> Cobertor aquecido </td><td> Gaymar Indústrias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot talão esterilizador </td><td> Belas Science Tools </td><td> 18000-45 </td><td> Transformar em cerca de 30 min antes da sua utilização; esterilizar instrumentos a&gt; 200 ° C durante 30 seg </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Produtos Elmer </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratório de fita (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fita Laboratory (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> A tampaum refrigerador de isopor transporte </td><td></td><td></td><td> Isto será utilizado como plataforma cirúrgica </td></tr><tr><td> Micro pinça de dissecação </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> Dentes 1x2, curva ligeira, 0,8 de largura ponta 4 mm, comprimento &quot; </td></tr><tr><td> Micro pinça de dissecação </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Serrilhada, ligeira curva, 0,8 de largura ponta mm; 4 de comprimento &quot; </td></tr><tr><td> Microscópio </td><td></td><td></td><td> Spinning-disco confocal, XYZ fase Piezo, capablility epifluourescence 17,25 </td></tr><tr><td> Inserção do microscópio </td><td> Aplicada Instrumentação Científica </td><td></td><td> Personalizado fabricado, com duas portas de imagens circulares </td></tr><tr><td> MouseOx oxímetro, software e sensores </td><td> STARR Ciências da Vida </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super Versi-Dry laboratório soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Corte em quartos para alinhar plataforma cirúrgica </td></tr><tr><td> Nebulizador </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Usado para umidificar gases; evita a irritação dos tecidos pulmonares </td></tr><tr><td> Deslizamento ponta de seringa de tuberculina descartável (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo conjunto infusão alado </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;agulha ultrafina, 12&quot; tubo </td></tr><tr><td> Betadine spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

viver de imagem de respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

O microambiente do tumor desempenham um papel crucial na iniciação do tumor, progressão, metástase, e a resposta a terapias anti-cancro. Tridimensionais co-cultura de sistemas são frequentemente usados ​​para explicar a tumores do estroma interacções, incluindo o seu papel na resposta de drogas. No entanto, muitas das interacções que ocorrem in vivo no microambiente intacta não pode ser completamente reproduzido nestas configurações em in vitro. Assim, a visualização direta destes processos em tempo real tornou-se uma ferramenta importante na compreensão das respostas tumorais às terapias e identificar as interações entre as células cancerosas e do estroma que pode influenciar essas respostas. Aqui nós fornecemos um método para a utilização de microscopia confocal de disco giratório ao vivo, ratos anestesiados para observar directamente de distribuição de medicamentos, as respostas celulares de cancro e alterações no tumor do estroma interacções após a administração de terapêutica sistémica em modelos de cancro da mama. Descrevemos os procedimentos para labeling diferentes componentes do tumor, tratamento de animais para a observação de respostas terapêuticas, bem como o procedimento cirúrgico para expor tecidos tumorais para imagiologia de até 40 horas. Os resultados obtidos com este protocolo são lapso de tempo em que os filmes, os processos tais como a infiltração de drogas, a morte de células cancerosas e a migração das células do estroma pode ser avaliada utilizando o software de análise de imagem.

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento anti-cancro<em&gt; In vivo</em&gt; E a resolução de células simples.

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

O objetivo geral deste procedimento é rastrear em tempo real a penetração do medicamento e a resposta terapêutica à administração de um medicamento terapêutico. Isso é feito tratando primeiro o animal com a droga. Em seguida, a glândula mamária inguinal contendo o tumor é exposta criando um retalho cutâneo.Em seguida, o camundongo é transferido para o estágio microscópico e a saturação de oxigênio no sangue e as taxas de pulso são medidas e uma linha de demora para administração de fluidos e medicamentos ou corantes é inserida. Finalmente, as imagens de lapso de tempo são adquiridas para análises posteriores. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações na morte celular ou nas interações do estroma tumoral em resposta a uma droga por meio de microscopia confocal de disco giratório ao vivo de tumores mamários de camundongos.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do microambiente tumoral, como como vários componentes do estroma de um tumor influenciam a resposta à terapia. Antes de começar, consulte o protocolo escrito para horários típicos de administração de medicamentos e imagens. Ligue um esterilizador de esferas quentes e deixe-o atingir pelo menos 200 graus Celsius.Depois de lavar as ferramentas cirúrgicas em água e sabão, incluindo uma pinça com dentes, uma pinça serrilhada e duas tesouras, use o esterilizador de esferas quentes para esterilizá-las por pelo menos 30 segundos. Então deixe-os. Fresco. Coloque um absorvedor de laboratório em cima da tampa de isopor que será usada como plataforma cirúrgica.Use fita adesiva de laboratório para fixar um cone nasal com uma linha no sistema de anestesia, no absorvedor de laboratório e uma agulha de calibre 18 por uma polegada e meia através da fita na tampa de isopor em ambos os lados do cone do nariz para manter o cone do nariz preso no lugar. Reserve a gaze estéril Betadine. Dois limpadores de isopropanol 70% uma lâmina de microscópio, super cola e quatro pedaços de fita de laboratório de meia polegada de largura.Após anestesiar o animal em uma câmara de indução, quando ele estiver respirando profunda e lentamente, transfira o camundongo para a plataforma cirúrgica, com o lado ventral voltado para cima. Para evitar alta pressão, abra a linha de anestesia para a plataforma cirúrgica e, em seguida, feche a linha de anestesia para a câmara de indução. Reduza a concentração de isoflurano de 4% para 2,5%Verifique se a profundidade da anestesia é suficiente para a cirurgia, realizando uma pinça nas patas.Se o animal não reagir, use quatro pedaços de fita adesiva para prender seus membros à plataforma cirúrgica e use um barbeador elétrico para remover os pelos da superfície ventral. Use lenços umedecidos com isopropanol 70%, seguidos de Betadine aplicado em gaze estéril para desinfetar a superfície ventral do animal usando tesouras e pinças com dentes. Faça uma incisão na linha média ventral subcutânea de cerca de três milímetros acima da uretra até o processo xifóide.Tome cuidado para evitar perfurar ou cortar o peritônio com a tesoura e a pinça serrilhada. Gentilmente descolou a pele da cavidade peritoneal com a glândula mamária inguinal contendo o tumor a ser visualizado Ainda anexado. Posicione uma lâmina de microscópio de vidro contra a aba da pele de modo que a maior parte do tumor fique plana quando o camundongo for colocado no palco e para que não seja obstruído pelos membros posteriores.Uma vez que a lâmina do microscópio tenha sido posicionada corretamente, use super cola para prender a lâmina à superfície externa da pele. Remova a fita de laboratório que prende os membros do animal. Abra a linha de anestesia para o estágio do microscópio e, em seguida, feche a linha de anestesia para a plataforma cirúrgica.Transfira rapidamente o animal para o estágio do microscópio Depois que o animal for transferido, posicione e prenda a linha de anestesia e o cone do nariz para garantir que o mouse permaneça anestesiado e esteja em uma posição confortável. Reduza a concentração de isoflurano para 1,5%Exponha o tumor de forma que ele fique posicionado na parte superior e no centro de uma das portas de imagem cobertas de vidro na platina do microscópio. Insira a linha intraperitoneal de demora com o conjunto de infusão alado conectado à seringa de um mililitro contendo solução salina PBS estéril ou solução salina com iodeto de propídio.Quando a linha intraperitoneal for inserida, injetar o animal com 100 microlitros de solução salina com iodeto de propídio e continuar a injetar 50 microlitros de solução salina com iodeto de propídio a cada hora até que a sessão de imagem seja concluída. Usando as oculares, verifique se o tumor está posicionado corretamente e com fita adesiva suave na lâmina do microscópio e na linha intraperitoneal. A lâmina deve ser presa frouxamente o suficiente para que o fluxo sanguíneo para o tecido não seja obstruído.Colar a lâmina do microscópio ajuda a minimizar os artefatos de imagem introduzidos pela respiração do animal para adquirir imagens de lapso de tempo. Use o microgerenciador de software de código aberto, compile e analise os dados brutos usando IRIS ou outro software de análise de imagem. As fitas DExT conjugadas com fluorescência podem ser usadas como um marcador substituto para a administração de medicamentos nos tecidos.Aqui é mostrada a chegada de fitzy conjugado com dois megadalton dextrano IV injetado em um camundongo expressando proteína fluorescente azul em células de câncer de mama. Após a chegada do medicamento ao tumor, o extravasamento e a difusão podem ser visualizados para determinar a meia-vida intravascular e a distribuição do medicamento. Aqui, o extravasamento e a distribuição de LOR conjugado com 10 kilodalton dextrano IV injetado em um camundongo expressando proteína fluorescente azul em células de câncer de mama e proteína fluorescente verde em células mielóides é mostrado.A imagem pode fornecer informações sobre o tipo de morte celular que as células cancerígenas sofrem. Aqui, alterações nucleares estruturais indicativas de necrose ou apoptose são observadas em um camundongo que expressa proteína fluorescente verde conjugada à histona dois b. Após o tratamento com doxorrubicina, a morte de células cancerígenas induzida pela quimioterapia freqüentemente resulta em um recrutamento reativo de células imunes para tumores.Aqui está um exemplo dessa resposta estromal ao tratamento agudo com doxorrubicina em um camundongo expressando proteínas fluorescentes azuis e verdes no câncer de mama e células mieloides, respectivamente. Além de visualizar a resposta estromal geral à quimioterapia, respostas estromais especializadas também podem ser visualizadas aqui. A fagocitose do material celular necrótico por uma célula vizinha é mostrada Uma vez dominada.Essa técnica pode ser feita em 30 a 60 minutos e os animais podem ser fotografados por 12 a 40 horas se for realizada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado...

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Um modelo de camundongo experimental de metástase óssea foi estabelecido após a entrega intracardíaca da luciferase expressando células tumorais mamárias. Desenvolvimento do tumor e resultou lesão osteolítica foram monitorados longitudinalmente, com a bioluminescência e CT micro imagem.

Monitoramento metástases tumorais e lesões osteolíticas com bioluminescência e CT Micro Imagem

Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

Nós desenvolvemos modelos 3D para co-cultura de células de imagem ao vivo em tempo real das interações entre as células tumorais de mama e outras células em seu microambiente que a progressão de impacto para um fenótipo invasivo. Estes modelos podem servir como telas pré-clínicos de medicamentos para atingir parácrina induzidas proteolíticas caminhos, quimiocinas / citocina e quinase envolvidos na invasão.

Modelos MAME para formação de imagens 4D Live-célula do tumor: Interações microambiente que a progressão de Impacto maligno

Fonte:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, 2Departamento de Processos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicologia, Universidade de BrasíliaEste vídeo demonstra o procedimento para rastrear a progressão do tumor in...

Imagem bioluminescente da progressão do tumor de mama em um modelo de camundongo fêmea

Um modelo de tumor primário do cancro da mama ortotópico e remoção cirúrgica do tumor primário para prolongar a vida do rato para gerar metástase espontânea são descritos. O crescimento do tumor e progressão são monitorados e quantificado por imagens de fluorescência da luciferase.

Um modelo de camundongo ortotópico de câncer de mama espontânea metástase

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Aqui descrevemos o modelo e a abordagem para estudar as funções dos macrófagos alveolares pulmonares na metástase do câncer. Para demonstrar o papel dessas células na metástase, foi utilizado o modelo singênico (4T1) de câncer de mama em conjunto com a depleção de macrófagos alveolares com lipossomas de clodronatos.

Estudar o papel dos macrófagos alveolares em câncer de mama metastático

Aqui, descrevemos um método de monitoramento não invasivo envolvendo expressão de luciferase e proteína fluorescente verde em várias linhas de células cancerígenas de mama. Este protocolo fornece uma técnica para monitorar a formação de tumores e a colonização metastática em tempo real em camundongos.

Monitoramento do crescimento do câncer de mama e formação de colônia metastática em camundongos usando bioluminescência

O manuscrito descreve uma metodologia para o estabelecimento, bem como o monitoramento longitudinal do crescimento de metástases pulmonares espontâneas de tumores de mama injetados ortotopicamente, passíveis de intervenção em todos os estágios da cascata metastática.

In vivo Imagem para medir metástase pulmonar espontânea de células tumorais de mama injetadas ortotopicamente

Aqui, descrevemos o protocolo para entrega in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro carregando oligômeros de RNA para câncer de mama metastático em modelos animais, fornecendo uma abordagem clinicamente viável para o silenciamento terapêutico de ácidos nucléicos oncogênicos.

Monitoramento do acúmulo de nanodrogas em metástases de câncer de mama murino

Aprenda a rastrear em tempo real a penetração de drogas e resposta terapêutica em tumores mamários de camundongos usando microscopia confocal de disco giratório. Este método permite analisar interações célula-morto e estroma-tumor em resposta a tratamentos anticâncer.

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

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